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方法文章

从植物提取物和组分中系统筛选新型抗菌及抗生物膜分子以预防龋齿

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DOI：

10.3791/61773

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2021年3月31日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dental Materials and Prosthodontics, School of Dentistry, São Paulo State University (UNESP), 2Department of Organic Chemistry, Institute of Chemistry, São Paulo State University (UNESP), 3Faculty of Pharmaceutical Sciences of Ribeiraão Preto (FCFRP-USP), Department of Physics and Chemistry, University of São Paulo

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

天然产物是开发新药和治疗剂的有前景的起点。然而，由于化学多样性高，从植物中发现新的治疗化合物是一项具有挑战性且耗时的任务。我们描述了一种简化的方法，用于从植物提取物和组分中鉴定抗菌和抗生物膜分子。

摘要

天然产物提供了结构多样的化合物，具有多种生物学活性。然而，由于植物基质复杂，且分离与鉴定过程耗时，从植物中鉴定和分离活性化合物具有较大挑战性。因此，本文提出了一种逐步筛选植物中天然化合物的方法，包括潜在活性分子的分离与鉴定。该方法涵盖植物材料的采集；粗提物的制备与分级分离；采用色谱与波谱技术（超高效液相色谱-二极管阵列检测-高分辨质谱联用和核磁共振谱）进行分析及化合物鉴定；生物活性检测（抗菌与抗生物膜活性；细菌对唾液薄膜及经特定处理的初始葡聚糖基质的"黏附强度"）；以及数据分析。该模型简便、可重复，支持对多种化合物、浓度和处理步骤进行高通量筛选，并能实现一致的控制。所得数据为后续研究奠定了基础，包括采用最具活性的提取物和/或组分进行制剂开发、分子分离、以及针对微生物细胞和生物膜中的特定靶点进行分子结构模拟。例如，控制致龋生物膜的一个靶点是抑制变异链球菌（Streptococcus mutans）葡糖基转移酶的活性，该酶负责合成胞外基质中的葡聚糖。抑制这些酶的活性可阻止生物膜的形成，从而降低其毒力。

引言

社会中最早使用的医学模型基于天然产物（NPs）。自那时起，人类一直在自然界中寻找可转化为药物的新化学物质1。这一探索推动了民族植物学筛选技术与方法的持续改进1,2,3。天然产物提供了结构多样化的丰富物质来源，具有广泛的生物活性，可用于开发替代疗法或辅助治疗。然而，植物固有的复杂基质使得活性化合物的分离与鉴定成为一项具有挑战性且耗时的工作4。

基于纳米颗粒（NPs）的药物或制剂可用于预防和/或治疗多种口腔疾病，包括龋齿4。龋齿是全球最常见的慢性疾病之一，其成因是高糖饮食与牙齿表面形成的微生物生物膜（牙菌斑）相互作用，导致微生物代谢产生的有机酸引发牙体脱矿；若不及时治疗，最终可导致牙齿脱落5,6。尽管其他微生物也可能参与其中7，但Streptococcus mutans（变形链球菌）是一种关键的致龋细菌，因其具有产酸性、耐酸性以及能够构建胞外基质的特性。该菌编码多种胞外酶（如葡萄糖基转移酶或Gtfs），可利用蔗糖作为底物8，合成富含胞外多糖的胞外基质，而该基质是其毒力的重要决定因素9。此外，真菌Candida albicans（白色念珠菌）也可促进该胞外基质的生成7。尽管氟化物以多种形式应用仍是预防龋齿的基础手段10，但仍需开发新的辅助策略以增强其效果。此外，目前可用的抗牙菌斑方法主要依赖广谱杀菌剂（如氯己定）11。作为替代方案，纳米颗粒（NPs）在控制生物膜和预防龋齿方面具有潜在治疗价值12,13。

从植物中进一步发现新的生物活性化合物包括若干必要步骤或方法：（i）采用可靠且可重复的采样方案，需考虑到植物常表现出种内变异；（ii）制备全面的粗提物及其相应的小规模分级组分；（iii）通过获取多维数据（例如气相色谱-质谱联用技术GC-MS、液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术LC-DAD-MS或核磁共振NMR）对化学谱图进行表征和/或去重复化分析；（iv）采用可行且高通量的模型评估生物活性；（v）基于多变量数据分析或其他统计工具筛选潜在的新活性化合物候选分子；（vi）对目标化合物或有前景的候选物进行分离与纯化；以及（vii）利用分离得到的化合物验证其相应的生物学活性2,14。

去重复化（dereplication）是指在粗提物中快速鉴定已知化合物，并区分出尚未被研究的新化合物的过程。此外，该过程可避免对已知具有生物活性的化合物进行重复分离，尤其有助于识别“频繁出现的活性化合物”（frequent hitters）。该方法已应用于多种非靶向研究流程中，从主要化合物的鉴定、加速基于活性的分级分离，到提取物集合的化学成分分析。它还可与代谢组学研究完全整合，用于粗提物的非靶向化学成分分析或代谢物的靶向鉴定。所有这些最终都有助于在分离纯化前对提取物进行优先级排序1,15,16,17。

因此，在本论文中，我们描述了一种系统性方法，用于从植物提取物和组分中鉴定具有抗菌和抗生物膜活性的分子。该方法包括四个多学科步骤：（1）植物材料的采集；（2）粗提物（CE）和组分（CEF）的制备，并进行化学成分分析；（3）生物活性检测；以及（4）生物学与化学数据分析（图1）。本文展示了我们所建立的实验方案，用于分析Casearia sylvestris提取物和组分对Streptococcus mutans和Candida albicans13的抗菌与抗生物膜活性，以及植物化学特征分析和数据处理的相关操作流程。为简化说明，本文重点以细菌为例，演示天然化合物筛选的方法。

植物提取物分析：UHPLC-DAD-HRMS 分析、生物活性检测及数据分析步骤示意图。
图1：从植物提取物及组分中系统性鉴定活性分子的流程图。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

1. 植物材料的采集

  1. 植物材料
    1. 在采集地国家用于管理遗传资源获取的电子平台上记录植物材料的获取信息。例如，在巴西，需在国家遗传资源及关联传统知识管理系统（SisGen）进行注册（网站 https://sisgen.gov.br/paginas/login.aspx）。
    2. 采集目标植物材料样本（例如叶片、茎、根、花、果实），并记录材料是在生殖期还是营养生长期采集的。
    3. 记录采集参数（日期、地理坐标、年平均气温和平均湿度百分比）。
    4. 对样本进行精确鉴定，并由分类学家确认其真实性。
  2. 植物样本的稳定化与保存
    1. 采集后立即将植物器官分装至独立的塑料袋或容器中。
    2. 通过以下方法之一抑制潜在的酶促反应：(i) 液氮中立即冷冻，(ii) 通风烘箱中40 °C脱水，或 (iii) 冷冻干燥（冻干）处理。
    3. 将稳定化后的材料密封于密闭袋中，室温或冷冻（-20 °C 或 -80 °C，根据保存期限或后续用途而定）保存至使用前。
    4. 使用分析研磨仪（根据组织类型或设备条件选择刀式或球磨）研磨样本，并采用标准筛网统一颗粒大小。
    5. 分别称量样本，用于后续提取步骤。

2. 粗提物（CE）和组分（CEF）的制备用于化学轮廓分析和生物测定

  1. 粗提物（CE）的制备
    注意：该步骤的流程图见图2A。
    1. 配制含醇水提取溶剂（例如70%乙醇（EtOH），或根据实验设计及既往文献确定的水、EtOH与其他改性剂组成的三元混合体系）。
    2. 采用样品重量（干重，mg）与提取溶剂（mL）之比为每毫升溶剂对应50至100 mg样品。
    3. 为实现快速且可重复的提取，建议使用微量离心管进行批量提取。
      注意：此步骤至少应设置三个重复，以便进行统计分析。
    4. 采用超声辅助提取法（UAE），以实现快速、简便且低成本的操作。
    5. 为获得最佳提取效率，重复提取三次，每次15分钟。
    6. 每次提取后，通过离心去除固体残渣，并收集上清液。
    7. 分别合并各次提取的上清液，过滤后分装保存，用于同步进行化学分析和生物活性测定。如需，可在减压、氮气流或冷冻干燥条件下除去提取溶剂，并记录重量及得率。
    8. 于-20 °C避光保存。
      注意：本方案可在此处暂停，用于对粗提物（CE）进行活性筛选，并选择具有目标活性的样品继续后续实验。
  2. 粗提物的分级分离（CEF）
    注意：该步骤的流程图见图2B。
    1. 使用至少含1 g吸附剂的固相萃取柱。若粗提物中可能含有生物碱，则所用溶剂中应添加0.1%甲酸（FA）。
    2. 将样品溶解于最适宜的溶剂（或溶剂混合物）中，配制成100 mg/mL的样品溶液。随后，取1 mL该溶液转移至已预处理的固相萃取柱（SPE，吸附剂1 g，容量6 mL）中。
    3. 使用每种洗脱液约三个柱体积进行分级分离（对于1 g吸附剂的柱子，每种溶剂约为2 mL）。若粗提物中可能含有生物碱，则洗脱溶剂中应含0.1%甲酸（FA）。
    4. 按洗脱液组成分别收集各组分，并分装保存，用于同步进行化学分析和生物活性测定。
    5. 在减压、氮气流或冷冻干燥条件下除去溶剂，并记录重量及得率。
      注意：若粗提物难以溶于初始洗脱体系，可在上样前将其按1:1（w/w）比例分散于固相载体（如C18或硅藻土）中。
      注意：应预先称量微量离心管重量，以便计算提取物及各组分的质量得率。
  3. 化学成分分析
    注意：鉴于不同植物物种需要优化并采用特定的化学分析方法，以下部分将介绍常用于植物材料分析的通用分析策略。作为实际示例，本文建立并验证了一种反相液相色谱方法，用于同时分析两种不同变种的Salicaceae科植物Casearia sylvestris Swartz中差异性生物合成的酚类化合物和克勒罗烷型二萜类成分。所用UPLC-DAD仪器配备脱气装置、四元泵、自动进样器、紫外-可见光二极管阵列检测器及柱温箱（详见Bueno等，201518）。下文所述类似方法可根据其他植物物种或植物材料进行相应优化。
    1. 色谱分析及联用技术可能性
      1. 进行超高效液相色谱（UPLC）分离时，使用C18色谱柱（例如150 × 2.1 mm，2.6 µm，100 Å），并配备兼容的保护柱。
        注意：根据植物物种或材料的不同，也可选用其他类型的色谱柱相或色谱模式。常规高效液相色谱（HPLC）亦可使用，此时需选择合适的色谱柱。为实现优良分离效果，应根据流速（µL/min）、柱温（°C）和进样体积（µL）等参数优化色谱条件。流动相通常由水（A）和乙腈或甲醇（B）组成，采用线性或多步梯度洗脱或等度洗脱。也可加入缓冲液、酸、碱或其他添加剂作为改性剂。
      2. 对植物材料（CE和/或CEF）进行分析，并记录所有相关数据，如光谱数据（使用紫外-可见光和/或优先使用质谱检测器）、保留时间（min）等，具体取决于可用的联用技术。
        注意：液相色谱（LC）通常与高分辨质谱（HRMS）联用（即LC−HRMS），广泛用于对CE或CEF中的代谢物进行快速注释15。
      3. 若需同时获得定性与定量数据，应严格按照相同实验流程配制并进样标准曲线。
        注意：最佳色谱条件的开发可借助实验设计方法（如Bueno等，201518所述）或其他类似文献指导。在方法开发过程中应考虑加入内标物，因其有助于校正样品制备和进样过程中的技术偏差，并为后续数据分析提供归一化依据。
  4. 单变量与多变量数据分析
    1. 将记录的色谱图导出为合适格式（如ASCII、.txt或.csv格式）。若需分析多个样品并进行比较，可通过拼接和对齐色谱图构建单一数据矩阵。所得矩阵应根据所用内标物对色谱图进行归一化处理。
    2. 采用多变量与单变量方法分析植物代谢组学数据。利用多变量统计方法（包括无监督的主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），或有监督的偏最小二乘法分析（如PLS、OPLS、PLS-DA））对代谢组数据集进行探索与可视化分析。单变量方法（如ANOVA、Student's t检验、Tukey检验和Welch's t检验）特别适用于精确分析样品间的定量差异19。
  5. 去重复化与化合物注释
    注意：本步骤旨在通过在线快速识别已知天然产物，避免耗时的分离工作，且可与单变量或多变量数据分析同步进行。
    1. 对检测到或目标化合物进行鉴定层级划分：
      1. 已鉴定化合物，包括完整的三维结构和立体化学信息（0级）；
      2. 通过两个正交参数（如保留时间和MS/MS谱图）实现鉴定（1级）；
      3. 推测性注释的化合物及化合物类别（2级和3级）；
      4. 基于分析数据可区分但未鉴定或未分类的代谢物（4级）19,20。
    2. 利用商业或公共数据库对已知化合物进行表征。其中重要的数据库包括：NIST（https://www.nist.gov）、Wiley（https://www.sisweb.com/software/ms/wiley.htm）、MassBank（https://massbank.eu/MassBank/）、GMD（http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/）、METLIN（https://metlin.scripps.edu）以及全球天然产物社会分子网络数据库（GNPS，https://gnps.ucsd.edu）19。
      注意：化合物注释存在不同层级，其取决于研究中所采用的联用技术，可能包括基于质谱（或核磁共振）的谱图数据库比对，以及计算机谱图预测算法的辅助。
    3. 分离、纯化与化合物完整鉴定
      注意：若某一化合物（经统计方法推测其可能为目标成分）需进行完整的结构鉴定，则首要步骤是将其大规模地分离与纯化，可通过放大已有实验方案实现。
      1. 采用已建立并优化的制备型色谱技术，快速直接地分离目标化合物。可采用干法上样半制备型HPLC，以避免高载样量与样品溶解性之间通常需要权衡的问题1。
      2. 对分离得到的化合物进行完整的结构表征与鉴定。该过程可通过多种技术联合完成：
        1. 核磁共振（NMR）；
        2. 质谱（MS）；
        3. 紫外（UV）和红外（IR）区域的光谱技术对官能团的表征也非常有用；
        4. 使用手性光谱技术，如电子圆二色（ECD）和振动圆二色（VCD）、拉曼光学活性（ROA）以及X射线晶体学，对于确定绝对构型至关重要。

3. 生物测定

注意：生物筛选：为快速评估 CE 和 CEF 的潜在生物活性，应组织并实施对天然物质的初步筛选，流程应简洁明了。

  1. 生物测定用 CE 和 CEF 的制备
    1. 使用最合适的溶剂复溶干燥物（可通过实验确定）。实验设计21,22 定义了储备液及溶剂的浓度。
    2. 计算储备液中的溶剂浓度。使用公式：C1 × V1 = C2 × V2，其中 C1 表示 CE 和/或 CEF 的储备液（mg）；V1 表示溶剂体积；C2 表示 CE 和/或 CEF 的重量；V2 表示储备液的最终体积（mL）。
      注：例如，我们选择 84.15% EtOH 和 15% 二甲基亚砜（DMSO）作为储备液的溶剂浓度。我们将 CE 的储备液浓度配制为 6 mg/mL，CEF 为 1 mg/mL13。用于稀释 CE 和 CEF 的溶剂取决于生物活性评价方法。作为载体使用的溶剂不得干扰生物学和毒理学活性。通常使用水、DMSO、EtOH 或基于 EtOH 的水性溶剂来溶解植物提取物或植物衍生物4,13。
  2. 试验生物体的制备
    1. 在血琼脂培养基上复苏微生物菌株，例如 S. mutans UA159（48 h，37 °C，5% CO2），并在液体培养基中培养（例如含 1% 葡萄糖（w/v）的胰蛋白胨-酵母提取物肉汤 [TYE：2.5%（w/v）胰蛋白胨与 1.5%（w/v）酵母提取物]（TYEg），培养 16 h，37 °C，5% CO2）。
    2. 将微生物的初始培养物用相同培养基进行 1:20 稀释（初始培养物的稀释比例可根据实验设计调整）。
    3. 孵育至对数生长期中期。
    4. 在 TYEg 中制备用于抗菌测定的接种物，或在含 1% 蔗糖（w/v）的 TYE（TYEs）中制备用于生物膜测定的接种物，接种物浓度为已知菌量（例如，2×106 每毫升菌落形成单位 - CFU/mL）。
      注：培养条件取决于所测试的微生物。
  3. 抗菌活性
    注：步骤示于 图 3。
    1. 在 96 孔板中加入 CE 和/或 CEF 储备液的等分试样（µL）（处理组）。等分试样的体积由测试浓度决定，测试浓度应根据先前研究选定。例如，若测试 CE 在 0.5 mg/mL 的测试浓度，则使用 6 mg/mL 储备液的 16.67 µL 等分试样。此计算使用公式：C1 × V1 = C2 × V2，其中 C1 为储备液浓度，V1 为储备液等分试样体积，C2 为测试浓度，V2 为 96 孔板的体积（对应 200 µL）。在此实验条件下，溶剂（载体）的测试浓度为 7% EtOH 和 1.25% DMSO。
    2. 每块板均需设置一组对照：一列为处理组但不加接种物（每种处理的空白对照，有助于区分由处理本身引起的浊度与微生物生长）；一列为载体加接种物（CE 或 CEF 的稀释液或 0 mg/mL 对照）；一列仅含培养基（培养基对照）；一列仅含接种物（微生物生长对照）。
    3. 用 TYEg 将体积调至 100 µL。随后孵育，例如 24 h，37 °C，5% CO2（根据所测试的微生物而定）。
    4. 向 96 孔板中加入 100 µL 微生物接种物（1×106 CFU/mL）。
    5. 通过肉眼观察各孔的浊度（澄清或浑浊）分析细菌生长情况。澄清：表示微生物无可见生长；浑浊：表示微生物有可见生长。
    6. 测定每孔细菌培养物的吸光度（光密度或 O.D.）（使用 540 nm 的酶标仪）。然后，将 100 µL 培养物转移至含 900 µL 生理盐水（0.89% NaCl）的微量离心管中，充分涡旋混匀。接着继续进行十倍系列稀释，直至达到所需稀释度。
    7. 取所需稀释度的等分试样接种于特定琼脂平板（双重复）。例如，在血琼脂平板上接种 10 µL 特定稀释度的样品。
    8. 孵育。不同微生物的条件可能不同，例如 S. mutans：48 h，37 °C，5% CO2。
    9. 对平板上的菌落进行计数，并按公式 (A菌落数 × 10n)/q 转换为 CFU/mL。在此公式中，n 等于稀释倍数的绝对值（0、1、2 或 3），q 等于点样至琼脂平板的体积（mL）。此外，CFU/mL 可转换为对数值。
      注：当植物提取物加入培养基时，提取物中的颗粒可能发生沉淀。这一现象可能使结果解释困难。同样，当使用微孔板读数仪测量浊度时，在某些情况下细胞会聚集在微孔板底部。此外，根据所用提取物的不同，植物叶片提取物的颜色可能干扰浊度的定量23,24。一种替代方法是使用染料来判断微生物细胞是否具有代谢活性24。
  4. 抗生物膜活性
    注：评估处理对生物膜形成影响的步骤示于 图 4。
    1. 生物膜的形成与处理
      1. 在 96 孔板中，用培养基（TYEs）稀释处理组，方法同抗菌活性实验步骤所述。
      2. 孵育平板。以 S. mutans 为例，孵育条件为 24 h，37 °C，5% CO2。
      3. 孵育后，将平板置于旋转摇床上（5 min，37 °C，75 rpm），以松动未黏附于生物膜的细胞。然后弃去含未黏附细胞的培养基，并用 0.89% NaCl 洗涤残留生物膜三次，以去除非黏附细胞。
    2. 处理后生物膜生物量的定量
      注：步骤示于 图 4A 的流程图中。
      1. 将洗涤后的生物膜保留在平板上，向每孔加入 50 µL 1% 结晶紫水溶液。
      2. 室温孵育 35 min。
      3. 用 MilliQ 水洗涤染色孔（三次），然后空气干燥 60–90 min。
      4. 用 200 µL 99% EtOH 在旋转摇床上孵育（5 min，37 °C，75 rpm），以洗脱结晶紫。
      5. 从每孔取 150 µL 洗脱染料的等分试样转移至另一块板，并定量样品生物量（酶标仪 570 nm）。
    3. 处理后生物膜中可存活微生物群体（CFU/mL）的定量
      注：步骤示于 图 4B 的流程图中。
      1. 用移液器和 200 µL 0.89% NaCl 从平板上取下洗涤后的生物膜，并将所得悬浮液分别转移至无菌微量离心管中。
      2. 每孔额外使用 200 µL 0.89% NaCl，并转移至已含 200 µL 初始生物膜悬浮液的对应管中。重复此过程，直至每原始孔的总悬浮液体积达到 1 mL。
      3. 从每管取等分试样进行十倍系列稀释。
      4. 取所需稀释度的等分试样接种于特定琼脂平板（双重复）。例如，在血琼脂平板上接种 10 µL 特定稀释度的样品。
      5. 孵育琼脂平板（例如 48 h，37 °C，5% CO2），然后按上述方法计数菌落以确定 CFU/mL。
  5. 生物活性验证阶段
    1. 唾液薄膜的形成
      1. 使用羟基磷灰石（HA）微珠（Macro-Prep 陶瓷羟基磷灰石 I 型 80 μm）作为形成唾液薄膜的表面25。这些微珠表面模拟牙釉质。
      2. 将 HA 微珠（例如 10 mg）称重后置于微量离心管中并灭菌。然后使用吸附缓冲液（AB 缓冲液：50 mM KCl，1 mM KPO4，1 mM CaCl2，1 mM MgCl2，dd-H2O 中，pH 6.5]25，含 0.1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）和 0.02% 叠氮化钠（NaN3）洗涤微珠。
      3. 收集并制备人唾液26。需获得机构伦理委员会批准。
      4. 向微量离心管中加入 500 μL 唾液并孵育（40 min，37 °C，24 rpm）。
      5. 随后移除唾液上清液，并用含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液洗涤微珠（三次）。现在，sHA 微珠（含唾液薄膜的 HA 微珠）已可用于后续测定。
        注：唾液来自健康志愿者。收集后，用 AB 缓冲液将唾液稀释（1:1 v/v），离心（1699 × g，20 min，4 °C）。通过过滤灭菌（使用 0.22 μm 聚醚砜膜滤器，对蛋白质低吸附）26。研究需经机构伦理委员会批准。本例中，机构伦理委员会已批准该研究（CAAE: 68161417.0.0000.5416）。
    2. S. mutans 在唾液薄膜和经选定提取物处理的葡聚糖上黏附后的脱离
      1. 按上述方法培养微生物至对数生长期中期。
      2. 当培养物达到所需 O.D. 时，离心（4000 × g，20 min），用 0.89% NaCl 溶液洗涤，并用与初始培养基相同体积的 0.89% NaCl 重悬沉淀。
      3. 若使用链球菌（如 S. mutans），需用探头超声处理培养物以解聚（30 s，7 W，三次）。若使用单细胞生物，可省略此步骤。
      4. 检测 O.D.（540 nm）并将浓度调整至 2 × 106 CFU/mL。
    3. S. mutans 对唾液薄膜 (sHA) 的黏附及黏附细胞的脱离
      注：步骤示于 图 5 的流程图中。
      1. 按上述方法获得 sHA 样品。
      2. 向含 sHA 样品的微量离心管中加入选定处理组（测试浓度；例如 0.5 mg/mL）或对照组的等分试样（本例中加入 500 μL）。
      3. 将 sHA 样品与处理组或对照组孵育（30 min，37 °C，24 rpm）；然后用含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液洗涤微珠三次。
      4. 加入微生物培养物。本例中，向每管加入 500 µL S. mutans 培养物（2 × 106 CFU/mL）。
      5. 孵育（1 h，37 °C，24 rpm），然后用 AB 缓冲液洗涤三次以去除未结合的细胞。
      6. 用等分试样（本例中加入 1000 μL）AB 缓冲液重悬各样品，并用探头超声处理（30 s，7 W）。
      7. 取各悬浮液的等分试样进行十倍系列稀释，通过在特定琼脂平板上点样（48 h，37 °C，5% CO2）测定可存活菌落数。随后按上述方法计数菌落以确定 CFU/mL。
        注：超声步骤用于使黏附于 sHA 的细胞脱离。
    4. S. mutans 对初始葡聚糖基质（gsHA）的黏附及黏附细胞的脱离
      注：步骤示于 图 6 的流程图中。GtfB 酶从经基因工程改造以产生 GtfB 的 Streptococcus milleri KSB8 培养上清液中纯化。纯化使用含羟基磷灰石微珠的层析柱，缓冲液中含两种蛋白酶抑制剂（0.1 mM PMSF 和 0.02% NaN3）27,28。随后在丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上检测酶，并用硝酸银染色。酶的等分试样储存于 -80 °C 直至使用。
      1. 按上述方法获得 sHA 样品。然后向每管加入 GtfB 酶的等分试样（本例中加入 500 μL），并在匀浆器中孵育（40 min，37 °C，24 rpm）。然后用含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液洗涤三次。
      2. 向每微量离心管中加入含处理组（或对照组，测试浓度例如 0.5 mg/mL）的蔗糖底物（例如 500 μL）（100 mmol 蔗糖）。
      3. 在匀浆器中孵育样品（4 h，37 °C，24 rpm）。然后用含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液洗涤三次，以去除处理组及未掺入合成葡聚糖中的过量蔗糖（得到 gsHA 样品）。
      4. 向每管加入 S. mutans 接种物的等分试样（本例中加入 500 μL）（2 × 106 CFU/mL）。
      5. 在匀浆器中孵育（1 h，37 °C，24 rpm），然后用含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液洗涤三次以去除未结合的细胞。
      6. 用等分试样（例如 1000 μL）含 PMSF 和 NaN3 的 AB 缓冲液重悬各样品，并用探头超声处理以使黏附于 gsHA 的细胞脱离（30 s，7 W）。
      7. 取各悬浮液的等分试样进行十倍系列稀释，通过在特定琼脂平板上点样（48 h，37 °C，5% CO2）测定可存活菌落数。随后按上述方法计数菌落以确定 CFU/mL。

4. 生物学数据分析

  1. 生物测定数据
    1. 在电子表格中输入生物测定的原始数据。计算每种处理对微生物生长抑制的对数值，公式为 (ACFU/mL of treatments + 1) × log10。然后，相对于溶剂对照组，计算微生物生长抑制率的对数值，公式为 (Alog10 CFU/mL of treatment/对照组 Alog10 CFU/mL 的平均值) × 100%。
    2. 校正浮游培养物及经处理（CE 和 CEF 处理组）与溶剂对照组（阴性对照）的生物量的吸光度（O.D.）。校正方法为：从处理孔的吸光度中减去仅含培养基的孔的吸光度（Ablank），计算公式为 (A处理组培养基 /A阴性对照培养基) × 100%。
    3. 完成校正后，相对于溶剂对照组计算生物量抑制百分比，公式为 (A处理组生物量/对照组 A平均值) × 100%。
    4. 提交生成的原始数据，使用特定软件进行统计分析。
      注意：通过断点值（如 IC50/IC90）来判断特定处理方法的有效性。这些值定义为能够分别抑制50%和90%细菌生长或生物膜形成的最低处理浓度24。这些参数有助于解释数据，并为筛选活性更优的化合物提供依据13,29。

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结果

我们提供了一个采用系统性方法筛选植物提取物及组分生物活性的示例，旨在发现可能具有抗龋齿潜力的活性分子：Casearia sylvestris 来自巴西不同生态区的提取物对Streptococcus mutans和Candida albicans的抗菌及抗生物膜活性13。

背景
特定口腔微生物、宿主因素与富含蔗糖和淀粉的饮食之间复杂的相互作用可调节致病性生物膜的形成，并启动致龋过程30,31. S. mutans 通过产生负责胞外多糖合成的葡糖基转移酶（Gtfs），并凭借其产酸性和耐酸性，调控与龋齿发生相关的生物膜的致病性31此外，Gtfs 能够促进黏附作用 白色念珠菌 （及其他微生物），增强生物膜的毒力32...

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讨论

使用天然粗提物进行研究的主要挑战包括其成分复杂以及传统生物活性导向分离研究的不足。尽管该过程较为缓慢，但其行之有效，并已在天然产物研究领域取得诸多重要发现。因此，需要采用基于合理化和优先级排序的研究策略。在此基础上，利用现代化学剖析技术对粗提物（CE）进行分析，并在分离前开展去重复化（dereplication）研究，对于表征所研究材料具有重要意义，尤其有助于避免对已知且已有生物学活性报道的化合物进行重复分离2,15。此外，获取多维数据对于后续开展多元变量数据分析至关重要，可借此识别出可能对所观察到的生物活性负责的潜在候选成分。由此，研究人员可集中精力对这些潜在候选成分进行大规模分离。

本文介绍了一种基于生物活性导向的植物提取物及组分中活性化合物的系统性鉴定方法（体外）。该方案提供了一种多靶点筛选与分析方法，可同时对多种活性成分进行筛选和分析。本方法所采用的生物测定具有样品用量少、通量高、速度快、成本低、易于重复且试剂消耗量少等优点，相较于传统方法（例如，先分离目标...

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披露

未声明任何利益冲突。

致谢

我们感谢圣保罗州立大学（UNESP）化学研究所的天然产物生物测定、生物合成与生态生理学研究中心（NuBBE）（位于巴西圣保罗州阿拉拉夸拉市）提供实验室用于植物材料的制备。同时感谢圣保罗州立大学（UNESP）阿拉拉夸拉分校牙科材料与修复学系应用微生物学实验室的支持。本研究得到了圣保罗研究基金会（FAPESP）的研究资助（项目编号：FAPESP #2013/07600–3，授予 AJC）以及奖学金和管理经费（FAPESP #2017/07408–6 和 FAPESP #2019/23175-7，授予 SMR；#2011/21440–3 和 #2012/21921–4，授予 PCPB）。国家科学技术发展委员会（CNPq）与 FAPESP 联合提供的支持也对此研究有所帮助（INCT CNPq #465637/2014–0 和 FAPESP #2014/50926–0，授予 AJC）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96孔微孔板 Kasvi平底
活性炭LABSYNTH纯化和/或分级步骤
分析研磨仪Ika LabortechniK型号 A11 Basic
血琼脂平板Laborclin
C18色谱柱Phenomenex Kinetex150 × 2.1 mm，2.6 µm，100Â
二甲基亚砜 Sigma-Aldrich溶剂溶液
ELISA酶标仪Biochrom Ez
乙醇J. T. Baker用于提取和分级步骤，以及流动相组成
乙醇Sigma-Aldrich溶剂溶液
乙酸乙酯J. T. Baker分级步骤
GraphPad 软件La JollaGraphPad Prism7
己烷J. T. Baker分级步骤
培养箱Thermo Scientific
异丙醇J. T. Baker用于提取步骤
冷冻干燥机（冻干机）SavantModulyo
尼龙 Millipore 滤膜LAC0.22 µm × 13 mm
旋转摇床Quimis型号 G816 M20
聚酰胺固相萃取小柱Macherey-Nagel纯化和/或分级步骤
硅胶Merck40–63 μm，60 Â
氯化钠 (NaCl)Synth水中 0.89%
固相萃取小柱 (SPE)Macherey-Nagel纯化和/或分级步骤
胰蛋白胨Difco
超高效液相色谱-二极管阵列检测器 (UHPLC-DAD)DionexUltimate 3000 RS
超声波清洗仪UNIQUE型号 USC 2800
酵母提取物Difco

参考文献

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抗菌活性抗生物膜活性植物提取物固相萃取超高效液相色谱-二极管阵列检测-高分辨质谱联用技术核磁共振分析变形链球菌唾液薄膜葡聚糖基质生物膜抑制
从植物提取物和组分中系统筛选新型抗菌及抗生物膜分子以预防龋齿
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