使用下一代测序技术进行T细胞和B细胞受体免疫组库分析

摘要

本方案描述了从血液样本和肠道活检组织中提取DNA，构建用于高通量测序的TCRβ和IGH PCR文库，进行高通量测序运行以及基本数据分析的方法。

摘要

免疫记忆是适应性免疫的特征，由T细胞和B淋巴细胞协调完成。在循环系统及不同器官中，存在数十亿个独特的T细胞和B细胞克隆，每个克隆均可结合特定抗原，从而引发增殖、分化和/或细胞因子分泌。T细胞和B细胞的高度异质性由不同基因片段的随机重排产生。近十年来发展的下一代测序（NGS）技术，使得对T细胞和B细胞受体免疫组库进行前所未有的深度分析成为可能。在多种炎症状态、免疫缺陷、感染及恶性肿瘤中的研究表明，免疫组库的克隆性、基因使用情况及其生物物理特性均发生显著改变，这些发现为理解适应性免疫应答在不同疾病中的作用提供了重要见解。

本文提供了从血液和组织中进行T细胞和B细胞免疫组库高通量测序（NGS）的详细实验方案。我们展示了一个完整的流程，从DNA提取开始，经过文库构建、在NGS测序仪上进行测序，直至完成基础数据分析。该方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探究特异性T细胞和B细胞，从而识别不同疾病中淋巴细胞群体及其多样性参数的动态变化。该技术正逐步进入临床应用，具有发现新型生物标志物、实现风险分层和精准医疗的潜力。

引言

适应性免疫系统由T细胞和B淋巴细胞组成，利用免疫记忆识别先前接触过的抗原并启动快速反应。淋巴细胞在骨髓中产生，并在胸腺（T细胞）或骨髓（B细胞）中成熟。T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）均具有独特的构型，可识别特异性抗原。在稳态条件下，T细胞和B细胞持续循环，监测抗原呈递细胞表面呈递的数万亿种不同肽段。当TCR或BCR以高亲和力结合特异性抗原，并在适当共刺激信号存在的情况下，可导致细胞活化，进而分泌细胞因子、发生克隆扩增；对于B细胞而言，还可产生抗体。

不同T细胞或B细胞的庞大集合统称为免疫组库，能够识别无数不同的表位。为了产生如此庞大的组库，机体通过一个复杂的随机基因片段组装过程，形成几乎无限多样的受体组合，从而可结合特异性抗原¹。该过程称为V(D)J重组，包括可变区（V）、多样性区（D）和连接区（J）基因的不同重排，并伴随在连接区域发生随机的核苷酸插入和缺失²。

多年来，适应性免疫系统的结构一直受到不同领域科学家的关注。过去，科学家使用Sanger测序、互补决定区3（CDR3）谱型分析和流式细胞术来表征免疫组库，但这些方法分辨率较低。近十年来，随着高通量测序（NGS）技术的进步，人们得以深入解析个体T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）组库的特征与组成^3....

方案

本研究经由舍巴医疗中心的机构审查委员会批准，并已获得所有参与受试者的知情书面同意。

1. DNA 的提取与定量

1. 肠道活检组织的消化与细胞裂解
   1. 获取肠道活检组织，可为新鲜采集的样本，或储存于 -20 °C 或 -80 °C 的样本。若使用冷冻样本，需在冰上解冻。
   2. 向一个预先在冰上预冷的无菌 1.7 mL 微量离心管中加入 600 µL 细胞核裂解液。
   3. 将活检组织放入含有裂解液的微量离心管中，于 65 °C 孵育 15–30 分钟。
   4. 加入 17.5 µL 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K，于 55 °C 轻柔振荡条件下过夜孵育。
   5. 在进行步骤 1.3 前，将样品在室温下冷却 5 分钟。
2. 全血细胞裂解
   1. 采集 3 mL 全血至含 EDTA、肝素或柠檬酸盐的抗凝管中。
   2. 轻轻摇动试管使血液充分混匀，转移至含有 9 mL 细胞裂解液的无菌 15 mL 离心管中。在室温下孵育 10 分钟，期间反复倒置数次。
   3. 于室温下以 2,000 x g 离心 10 分钟，尽可能弃去上清液，注意勿扰动可见的白色沉淀。约有 50–100 μL 残留液体保留。
   4. 剧烈涡旋振荡 15 秒，直至沉淀完全重悬。加入 3 mL 细胞核裂解液，并用移....

结果

本文描述了一种从肠道组织和血液中分离DNA、构建二代测序（NGS）文库以及进行免疫组库测序的测序运行基本步骤的方法。测序将生成 fastq 文件，可进一步转换为 fasta 文件，用于国际免疫遗传学信息系统（IMGT）/HighV-QUEST 平台。该高通量测序技术可在核苷酸水平上对数以万计的TCRβ和IGH重排序列进行多项分析¹⁵。IMGT/HighV-QUEST 能够分析健康与疾病状态下不同的 TCR 和 IGH 免疫组库，有助于识别新的“疾病特异性”克隆、分析克隆扩增与多样性参数、阐明V(D)J基因片段使用差异、体细胞高频突变分析等。IMGT/HighV-QUEST 提供包含特定序列及其丰度信息的 CSV 文件。以基因组DNA为起始材料可获得反映细胞数量的序列数目。因此，在原始DNA量相等的情况下，还可计算出特定样本中T细胞所占的百分比。

我们纳入了一名IL10受体缺陷患者（因IL10RA基因有害突变导致婴儿期起病的重度炎症性肠病）的代表性自体血液与直肠样本进行基础分析。对样本同时检测了TCRβ和IGH组库。肠.......

讨论

在不同恶性肿瘤¹⁸、慢性炎症性疾病（如溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎）^10,19以及多种免疫缺陷病^17,20中，常可观察到B细胞和T细胞数量与功能的变化。本方法利用高通量测序（NGS）技术，深入分析T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）库，从而能够检测T细胞和B细胞克隆性的细微变化、克隆共享情况、V(D)J基因的使用模式，以及B细胞体细胞高频突变的程度等信息。

已针对肠道活检和血液样本描述了DNA提取方法。然而，通过调整裂解和DNA提取步骤，该方法也可应用于其他组织，如肿瘤、淋巴结、滑膜液等。在文库构建过程中，必须注意避免不同引物组之间的交叉污染。在磁珠纯化步骤中，孵育期间应始终将离心管置于磁力架上。对于浓度较低的DNA样本，可在65 °C下浓缩10-20分钟。此外，扩增产物可使用低至20 µL的洗脱.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-丙醇	Sigma	I9516-500ML
1.7 mL 微量离心管	Axygen	8187631104051
15 mL 离心管	Greiner	188261
无水乙醇	Merck	1.08543.0250
Amplitaq Gold	Thermo Fisher	N8080241
AMPure XP 磁珠	Beckman Coulter	A63881
加热金属块	Bioer	不适用
高灵敏度 D1000 样品缓冲液	Agilent	5067-5603	用于 Tapestation
高灵敏度 D1000 ScreenTape	Agilent	5067-5584	用于 Tapestation，管子需单独购买
Lymphotrack 检测试剂盒	Invivoscribe	TRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019	每套包含 24 个索引
MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）	Illumina	MS-102-2003	包含标准流动池类型及所需全部试剂
MiSeq 测序仪	Illumina	SY-410-1003
PCR 排管	4titude	4ti-0792
蛋白酶 K	Invitrogen	EO0491
Qubit 4 荧光计	Thermo Fisher	Q33226
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒	Thermo Fisher	Q32854	包含缓冲液、染料、标准品和专用管
振荡器	Biosan	不适用
Tapestation 2100 生物分析仪	Agilent	G2940CA
超纯水	Bio-lab	7501
Wizard DNA 提取试剂盒	Promega	A1120	包含细胞裂解液、细胞核裂解液和蛋白质沉淀缓冲液