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方法文章

使用下一代测序技术进行T细胞和B细胞受体免疫组库分析

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DOI：

10.3791/61792

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2021年1月12日

 ,  ,  ,  , 
1Pediatric Gastroenterology Unit, Edmond and Lily Safra Children's Hospital, Sheba Medical Center, 2Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Cancer Research Center, Sheba Medical Center, 4Molecular Hematology Laboratory, Sheba Medical Center

本文内容

摘要

本方案描述了从血液样本和肠道活检组织中提取DNA，构建用于高通量测序的TCRβ和IGH PCR文库，进行高通量测序运行以及基本数据分析的方法。

摘要

免疫记忆是适应性免疫的特征，由T细胞和B淋巴细胞协调完成。在循环系统及不同器官中，存在数十亿个独特的T细胞和B细胞克隆，每个克隆均可结合特定抗原，从而引发增殖、分化和/或细胞因子分泌。T细胞和B细胞的高度异质性由不同基因片段的随机重排产生。近十年来发展的下一代测序（NGS）技术，使得对T细胞和B细胞受体免疫组库进行前所未有的深度分析成为可能。在多种炎症状态、免疫缺陷、感染及恶性肿瘤中的研究表明，免疫组库的克隆性、基因使用情况及其生物物理特性均发生显著改变，这些发现为理解适应性免疫应答在不同疾病中的作用提供了重要见解。

本文提供了从血液和组织中进行T细胞和B细胞免疫组库高通量测序（NGS）的详细实验方案。我们展示了一个完整的流程，从DNA提取开始，经过文库构建、在NGS测序仪上进行测序，直至完成基础数据分析。该方法能够在核苷酸或氨基酸水平上探究特异性T细胞和B细胞，从而识别不同疾病中淋巴细胞群体及其多样性参数的动态变化。该技术正逐步进入临床应用，具有发现新型生物标志物、实现风险分层和精准医疗的潜力。

引言

适应性免疫系统由T细胞和B淋巴细胞组成，利用免疫记忆识别先前接触过的抗原并启动快速反应。淋巴细胞在骨髓中产生，并在胸腺（T细胞）或骨髓（B细胞）中成熟。T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）均具有独特的构型，可识别特异性抗原。在稳态条件下，T细胞和B细胞持续循环，监测抗原呈递细胞表面呈递的数万亿种不同肽段。当TCR或BCR以高亲和力结合特异性抗原，并在适当共刺激信号存在的情况下，可导致细胞活化，进而分泌细胞因子、发生克隆扩增；对于B细胞而言，还可产生抗体。

不同T细胞或B细胞的庞大集合统称为免疫组库，能够识别无数不同的表位。为了产生如此庞大的组库，机体通过一个复杂的随机基因片段组装过程，形成几乎无限多样的受体组合，从而可结合特异性抗原1。该过程称为V(D)J重组，包括可变区（V）、多样性区（D）和连接区（J）基因的不同重排，并伴随在连接区域发生随机的核苷酸插入和缺失2。

多年来，适应性免疫系统的结构一直受到不同领域科学家的关注。过去，科学家使用Sanger测序、互补决定区3（CDR3）谱型分析和流式细胞术来表征免疫组库，但这些方法分辨率较低。近十年来，随着高通量测序（NGS）技术的进步，人们得以深入解析个体T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）组库的特征与组成3,4。这些高通量系统（HTS）能够同时对数百万条重排后的TCR或BCR产物进行测序和分析，从而在核苷酸或氨基酸水平上实现对特定T细胞和B细胞的高分辨率研究。NGS为在健康和疾病状态下研究免疫组库提供了新策略。利用HTS的研究表明，在自身免疫性疾病5、原发性免疫缺陷病6,7以及恶性肿瘤（如急性髓系白血病）8中，TCR和BCR组库均发生改变。我们及其他研究团队利用NGS发现，在炎症性肠病（IBD）患者（包括溃疡性结肠炎和克罗恩病）中存在特定T细胞和B细胞克隆的寡克隆扩增9,10,11,12,13,14。总体而言，来自不同领域的研究表明，免疫组库的变化在免疫介导性疾病的发生机制中起着关键作用。

本方案描述了从肠道活检组织和血液中分离DNA，构建用于高通量测序（NGS）的TCRβ和IGH PCR文库，并进行测序操作的方法。我们还提供了免疫组库数据分析的基本步骤。该方案也可用于生成TCRα、TCRγ和IGL文库。只要采用针对特定组织的消化方案，该方法同样适用于其他器官（如淋巴结、肿瘤、滑膜液、脂肪组织等）。

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方案

本研究经由舍巴医疗中心的机构审查委员会批准，并已获得所有参与受试者的知情书面同意。

1. DNA 的提取与定量

  1. 肠道活检组织的消化与细胞裂解
    1. 获取肠道活检组织，可为新鲜采集的样本，或储存于 -20 °C 或 -80 °C 的样本。若使用冷冻样本，需在冰上解冻。
    2. 向一个预先在冰上预冷的无菌 1.7 mL 微量离心管中加入 600 µL 细胞核裂解液。
    3. 将活检组织放入含有裂解液的微量离心管中，于 65 °C 孵育 15–30 分钟。
    4. 加入 17.5 µL 浓度为 20 mg/mL 的蛋白酶 K，于 55 °C 轻柔振荡条件下过夜孵育。
    5. 在进行步骤 1.3 前，将样品在室温下冷却 5 分钟。
  2. 全血细胞裂解
    1. 采集 3 mL 全血至含 EDTA、肝素或柠檬酸盐的抗凝管中。
    2. 轻轻摇动试管使血液充分混匀，转移至含有 9 mL 细胞裂解液的无菌 15 mL 离心管中。在室温下孵育 10 分钟，期间反复倒置数次。
    3. 于室温下以 2,000 x g 离心 10 分钟，尽可能弃去上清液，注意勿扰动可见的白色沉淀。约有 50–100 μL 残留液体保留。
    4. 剧烈涡旋振荡 15 秒，直至沉淀完全重悬。加入 3 mL 细胞核裂解液，并用移液器反复吹打数次。溶液应变得黏稠。
  3. 蛋白质沉淀
    1. 向组织样本中加入 200 µL 蛋白质沉淀缓冲液，或向血液样本中加入 1 mL。剧烈涡旋振荡 20 秒，冰上孵育 5 分钟。涡旋后可能观察到少量蛋白团块。
    2. 以 16,000 x g 离心 4 分钟，应形成紧密的蛋白沉淀。
    3. 小心转移上清液至新的 1.7 mL 离心管中，注意勿扰动沉淀。
      注：若沉淀不够紧密，可考虑再次以 16,000 x g 离心 4 分钟。
  4. DNA 沉淀与再水合
    1. 向含有上清液的离心管中加入 1 mL 异丙醇，通过反复倒置轻轻混匀。DNA 应以白色絮状物形式析出。
    2. 以 16,000 x g 离心 1 分钟，用移液器完全去除上清液。
    3. 加入 1 mL 新鲜配制的 70% 乙醇，反复倒置数次。于室温下以 16,000 x g 离心 1 分钟，小心弃去上清液。
    4. 重复步骤 1.4.3。
    5. 将离心管开口倒置于洁净吸水纸上 10–15 分钟。重新正置后确认沉淀完全溶解。如有需要，可继续晾干 10–15 分钟。
      注：确保沉淀完全干燥至关重要。
    6. 加入 50 µL 超纯水（UPW）。如有需要，可在定量后进一步稀释 DNA。
    7. 于 65 °C 金属浴中孵育 1 小时，以促进 DNA 再水合。
  5. DNA 定量
    注：DNA 定量采用荧光计及指定试剂完成，具体试剂见材料表。
    1. 将标准品恢复至室温，并按说明准备试剂盒，包括 0.5 mL 指定离心管。
    2. 根据样本数量，在 15 mL 离心管中配制缓冲液与染料混合液。每份样本加入 200 µL 缓冲液和 1 µL 染料。需包含两个标准品样本。建议额外计算一个样本量，以避免缓冲液不足。
      1. 对于两个标准品，取 190 µL 上述配制好的混合液加入 0.5 mL 离心管中，再加入 10 µL 标准品。
      2. 对于每个待测样本，取 199 µL 上述混合液加入 0.5 mL 离心管中，再加入 1 µL DNA 样本。
    3. 读取样本信号。结果将显示样本的 DNA 浓度。
    4. 若样本浓度超出检测范围，用超纯水将 DNA 按 1:10 比例稀释后重新测定。

2. 文库构建

注意：本实验方案采用一种基于多重 PCR 的检测试剂盒，适用于高通量测序仪（NGS）。该试剂盒包含 24 种不同的索引序列，分别靶向 Vβ 和 Jβ 区域内的保守序列，从而实现单步 PCR 扩增及不同样本的混合。详见材料表。

  1. 准备DNA样本。取150 ng DNA，并加入超纯水（UPW）至总体积为5 µL。
    注意：可用于文库构建的DNA量可少于150 ng，最低浓度为10 ng/µL。
  2. 将移液器和吸头放入带有紫外灯的通风橱中照射15分钟，以降解残留DNA。同时，将用于文库构建的不同接头索引管和DNA聚合酶置于冰上解冻。
  3. 在生物安全柜中，从不同的接头索引管中各取45 µL加入PCR管中。随后，向PCR管中加入0.2 µL DNA聚合酶以及第2.1步中准备的5 µL DNA。
  4. 根据制造商提供的说明，使用预设程序运行PCR反应。

3. 扩增子纯化与定量

  1. 使用磁珠去除过量的引物、核苷酸和酶。
    1. 将磁珠在室温下预热至少30分钟。为每个样本准备足够的新鲜80%乙醇，每份400 µL。
    2. 向每个PCR管中加入50 µL（IGH）或35 µL（TCRβ）磁珠，用移液器吹打混匀10次。室温孵育10分钟。
    3. 将混合样品置于磁力架上5分钟。
    4. 吸除95 µL（IGH）或80 µL（TCRβ）上清液并弃去。使用10 µL吸头吸除残留液体。
    5. 向每个样本中加入200 µL 80%乙醇。孵育30秒。吸除195 µL乙醇并弃去。使用10 µL吸头吸除残留液体。
    6. 重复步骤3.1.5。打开管盖，室温下空气干燥5分钟。
    7. 干燥5分钟后立即从磁力架上取下，加入25 µL洗脱缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0）。吹打混匀至溶液均匀。室温孵育2分钟。
    8. 将PCR管放回磁力架上5分钟。转移22 µL至新的PCR管中。测定DNA浓度（步骤1.5）。
  2. 扩增子定量
    注意：本方案使用自动化电泳仪对DNA浓度、片段大小和完整性进行质量控制。详见材料表。
    1. 将试剂和Screentape在室温下放置至少30分钟。
    2. 在新的1.7 mL微量离心管中，用超纯水（UPW）将步骤3.1.8中定量的DNA样本稀释至1 ng/µL，总体积不少于3 µL。
    3. 使用前涡旋震荡稀释后的DNA。取2 µL缓冲液与2 µL稀释后的DNA加入预标记的专用PCR条带管（试剂盒提供），盖上管盖。在振荡器上震荡1分钟，随后短暂离心PCR条带管。
      注意：由于缓冲液具有较高黏度，转移前应确保移液吸头中多余的缓冲液已被彻底清除。
    4. 将Screentape和去除管盖的PCR条带管放入仪器中。打开仪器内吸头盒的盖子。根据标签指定相应位置，启动仪器。
      注意：输出的电泳图应显示一个位于目标扩增子大小位置的单一峰（图1A）。若样本质量较差，则会出现额外峰（图1B），提示磁珠纯化不充分或引物二聚体形成。

4. 下一代测序

  1. 文库的定量与合并
    1. 根据步骤 3.1.8 中获得的 DNA 值以及电泳仪结果中产物峰的碱基对（bp）大小（见图 1），计算最终 DNA 浓度（单位为 nM）。
    2. 针对每个样本，计算为达到最终浓度 4 nM 所需取用的 DNA 体积，最终体积为 10–20 µL 洗脱缓冲液。
    3. 为每个样本制备新的稀释混合液，并从中取 2 µL 加入新的合并混合液中。
      注意：对于浓度低于 4 nM 的样本，应加入尽可能多的样本量。
  2. 文库的高通量测序运行
    注意：本方案使用台式测序平台。详见材料表中的信息。
    1. 配制新鲜的 0.2 N NaOH 溶液。向步骤 4.1.3 中制备的稀释文库中加入 10 µL 的 0.2 N NaOH。向管中加入 5% PhiX 并短暂涡旋。短暂离心，确保所有溶液均沉降至管底。
    2. 室温孵育 5 分钟以变性双链 DNA。向含有 DNA 的管中加入 980 μL 试剂盒中的预冷缓冲液，并短暂涡旋。
    3. 将稀释后的文库置于冰上，并按如下方式准备文库：对于 17 pM 的混合体系，加入步骤 4.2.2 中的 DNA 425 µL 和缓冲液 575 µL。反复倒置数次混匀，短暂离心。将 600 µL 最终文库上样至指定的测序卡盒中，并将样本放入仪器。
    4. 按照软件操作说明启动测序运行。

5. 测序分析

  1. 从测序仪下载测序数据指标，并确认测序数据处于以下范围内（针对本实验方案所用试剂盒的特定标准）。未达到以下标准的样本需重新测序：
    簇密度（Density (K/mm²)）：945K – 1800K
    通过过滤的读段比例（Clusters PF (%)）：>90%
    质量得分（%>=Q30）：>85%
    PhiX比对率（Aligned %）：1.5% - 10%
    PhiX错误率（%）：<1.0%

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结果

本文介绍了一种从肠道组织和血液中分离DNA、构建二代测序（NGS）文库以及进行免疫组库测序运行的基本步骤。测序将生成fastq文件，可进一步转换为fasta格式，用于国际免疫遗传学（ImMunoGeneTics, IMGT）/HighV-QUEST平台。该高通量测序技术可在核苷酸水平上对数以万计的TCRβ和IGH重排序列进行多种分析15。IMGT/HighV-QUEST能够分析健康与疾病状态下不同的TCR和IGH组库，有助于发现新的“疾病特异性”克隆，分析克隆扩增与多样性参数，明确V(D)J基因片段使用差异，评估体细胞高频突变等。IMGT/HighV-QUEST提供包含特定序列及其丰度信息的CSV文件。以基因组DNA为起始材料所获得的序列数量可真实反映细胞数量。因此，在原始DNA投入量相等的情况下，还可计算出特定样本中T细胞所占的百分比。

我们纳入了一名IL10受体缺陷患者具有代表性的自体血液和直肠样本进行基础分析，该患者因IL10RA基因有害突变导致婴儿期起病的重度炎症性肠病（IBD）。对样本同时进行了TCRβ和I...

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讨论

在不同恶性肿瘤18、慢性炎症性疾病（如溃疡性结肠炎和类风湿性关节炎）10,19以及多种免疫缺陷病17,20中，常可观察到B细胞和T细胞数量与功能的变化。本方法利用高通量测序（NGS）技术，深入分析T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）库，从而能够检测T细胞和B细胞克隆性的细微变化、克隆共享情况、V(D)J基因的使用模式，以及B细胞体细胞高频突变的程度等信息。

已针对肠道活检和血液样本描述了DNA提取方法。然而，通过调整裂解和DNA提取步骤，该方法也可应用于其他组织，如肿瘤、淋巴结、滑膜液等。在文库构建过程中，必须注意避免不同引物组之间的交叉污染。在磁珠纯化步骤中，孵育期间应始终将离心管置于磁力架上。对于浓度较低的DNA样本，可在65 °C下浓缩10-20分钟。此外，扩增产物可使用低至20 µL的洗脱...

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披露

所有作者均无披露事项。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-丙醇SigmaI9516-500ML
1.7 mL 微量离心管Axygen8187631104051
15 mL 离心管Greiner188261
无水乙醇Merck1.08543.0250
Amplitaq GoldThermo FisherN8080241
AMPure XP 磁珠Beckman CoulterA63881
加热金属块Bioer不适用
高灵敏度 D1000 样品缓冲液Agilent5067-5603用于 Tapestation
高灵敏度 D1000 ScreenTapeAgilent5067-5584用于 Tapestation，管子需单独购买
Lymphotrack 检测试剂盒InvivoscribeTRB: 70-91210039 IGH: 70-92250019每套包含 24 个索引
MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环）IlluminaMS-102-2003包含标准流动池类型及所需全部试剂
MiSeq 测序仪IlluminaSY-410-1003
PCR 排管4titude4ti-0792
蛋白酶 KInvitrogenEO0491
Qubit 4 荧光计Thermo FisherQ33226
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Thermo FisherQ32854包含缓冲液、染料、标准品和专用管
振荡器Biosan不适用
Tapestation 2100 生物分析仪AgilentG2940CA
超纯水Bio-lab7501
Wizard DNA 提取试剂盒PromegaA1120包含细胞裂解液、细胞核裂解液和蛋白质沉淀缓冲液

参考文献

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