يصف الإجراء عزل الزغب من ظهارة الفأر المعوية التي تخضع للتمايز لتحديد إمكانات تكوين الأعضاء.
ويعزى كلونوجينيتي من organoids من ظهارة الأمعاء إلى وجود الخلايا الجذعية فيه. يتم تقسيم ظهارة الفأر المعوية الصغيرة إلى سرداب وزغب: تقتصر الخلايا الجذعية والمتكاثرة على السرداب ، في حين أن ظهارة الزغب تحتوي على خلايا مختلفة فقط. وبالتالي ، فإن سرداب الأمعاء العادية ، ولكن ليس الزغب ، يمكن أن تؤدي إلى الأجهزة العضوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد. الإجراء الموصوف هنا ينطبق فقط على ظهارة villus التي تخضع للتمايز مما يؤدي إلى الجذعية. يستخدم الأسلوب الموصوف Smad4-loss-of-function:β-catenin كسب من وظيفة (Smad4 KO:β-cateninGOF) الماوس متحولة مشروطة. الطفرة يسبب الزغب المعوية لdedifferentiate وتوليد الخلايا الجذعية في الزغب. يتم كشط الزغب المعوي الذي يخضع للتمايز من الأمعاء باستخدام الشرائح الزجاجية ، ووضعها في مصفاة 70 ميكرومتر وغسلها عدة مرات لتصفية أي خلايا فضفاضة أو سرداب قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1 لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز. تم استخدام معيارين رئيسيين لضمان تطوير الأجهزة العضوية الناتجة من مقصورة villus المتمايزة وليس من السراديب: 1) تقييم الزغب المعزول بشكل مجهري لضمان عدم وجود أي سرداب مربوطة ، قبل وبعد الطلاء في المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، و 2) مراقبة المسار الزمني لتطور الجهازية من villi. بدء العضوية من الزغب يحدث بعد يومين إلى خمسة أيام فقط من الطلاء ويبدو على شكل غير منتظم، في حين أن organoids المستمدة من سرداب من ظهارة الأمعاء نفسها واضحة في غضون ستة عشر ساعة من الطلاء وتظهر كروية. الحد من هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أن عدد organoids شكلت، والوقت اللازم لبدء organoid من الزغب تختلف تبعا لدرجة dedifferentiation. وبالتالي ، اعتمادا على خصوصية الطفرة أو الإهانة التي تسبب التمايز ، يجب تحديد المرحلة المثلى التي يمكن فيها حصاد الزغب لتقصي إمكانات تشكيل الأعضاء الخاصة بهم ، تجريبيا.
السراديب المعوية ولكن ليس زغب، تشكل organoids عندما مثقف في مصفوفة Matrigel أو BME-R1. هذه organoids هي هياكل التنظيم الذاتي، وغالبا ما يشار إليها باسم “الأمعاء المصغرة” بسبب وجود مختلف الأنساب المختلفة، السلف، والخلايا الجذعية الموجودة في ظهارة الأمعاء في الجسم الحي. ويعزى احتمال تشكيل organoids من سرداب إلى وجود الخلايا الجذعية1. الزغب المعوي من ناحية أخرى تتكون فقط من خلايا مختلفة، وبالتالي لا يمكن تشكيل organoids. ومع ذلك، قد تؤدي الطفرات2 أو الشروط التي تسمح dedifferentiation من ظهارة villus إلى الخلايا الجذعية في زغب2،3. يمكن تأكيد هذا التغيير المصيري الناتج عن الجذعية في ظهارة السيلي عن طريق طلاء ظهارة villus المتمايزة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز كمؤشر على النبع من الدي نوفو في ظهارة villus. وبالتالي ، فإن الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب.
وSmad4KO:β-cateninGOF الطفرة الشرطية يسبب dedifferentiation في ظهارة الأمعاء تميزت التعبير عن الانتشار وعلامات الخلايا الجذعية في الزغب, وفي نهاية المطاف تشكيل هياكل مثل سرداب في زغب يشار إليها باسم سرداب خارج الرحم تم تحديد وجود هذه الخلايا الجذعية هذه villi dedifferentiated من خلال التعبير عن علامات الخلايا الجذعية في سرداب خارج الرحم(في الجسم الحي)وقدرة الزغب متحولة لتشكيل organoids wh en مطلي ماتريجل3. الإجراء المذكور أدناه يوضح المنهجية المستخدمة لتأكيد الجذعية من ظهارة الأمعاء المتمايزة في Smad4 KO:β-cateninGOF الفئران المتحولة. كانت إحدى السمات الرئيسية لهذه المنهجية لعزل الزغب هي استخدام كشط التجويف المعوي ، بدلا منطريقةEDTA 4. على عكس طريقة إزالة EDTA ، تحتفظ عزلة الزغب عن طريق كشط غالبية mesenchyme الأساسي وتسمح بضبط ضغط الكشط لتسفر عن زغب بدون سرداب مربوطة. ضغط كشط ذاتية للمشغل، وبالتالي، يجب تحديد الضغط الأمثل لتسفر عن زغب دون سرداب المربوطة تجريبيا من قبل المشغل. الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري للزغب قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1.
يتم كشط زغب الأمعاء قبالة التجويف المعوي مع الشرائح الزجاجية ووضعها في مرشح 70 ميكرومتر وغسلها مع برنامج تلفزيوني للتخلص من الخلايا فضفاضة أو سرداب، إن وجدت، قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1. وتشدد هذه الطريقة على المعايير التالية لتجنب التلوث سرداب: أ) حصر حصاد الزغب النصف القريب من الاثني عشر حيث الزغب هي الأطول، ب) التقليل من عدد الخدوش ذات العائد الزغب، ج) غسل المرشح الذي يحتوي على الزغب من خلال سلسلة من برنامج تلفزيوني في طبق من ستة آبار، و د) مما يؤكد عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1. عزل سيلي عن طريق كشط، بدلا من EDTA chelation، يمنع فقدان كامل من mesenchyme الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة5،6،7،8، إذا لزم الأمر، لبدء organoid من ظهارة villus.
يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة التجديد الذاتي لظهارة السيلي المتمايزة التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يمكن أن تؤدي ظهارة الأمعاء العادية إلى ظهور أعضاء من سرداب ولكن ليس مقصورة الزغب ، عندما تكون مثقفة في 3D بسبب وجود خلايا جذعية في سرداب1. وهكذا، فإن تكوين…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا المنشور من قبل جائزة رقم K22 CA218462-03 من المعهد الوطني للسرطان NIH. كانت خلايا HEK293-T التي تعبر عن R-Spondin1 هدية سخية من الدكتور مايكل ب. فيرزي.
Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |