实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

摘要

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。

摘要

实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）由免疫细胞对自身抗原的反应所驱动。这一非感染性眼内炎症疾病模型的多种特征可重现人类后葡萄膜炎的临床表型。EAU已被可靠地用于研究新型抗炎治疗药物的疗效、作用机制，并进一步探究眼内疾病进展背后的病理机制。本文提供了在C57BL/6J小鼠中诱导EAU的详细方案——这是最广泛使用的、对该疾病具有易感性的模式生物。将通过检眼镜检查、组织学分析和荧光素血管造影术来演示对疾病严重程度和进展的临床评估。诱导过程包括在皮下 注射一种乳剂，该乳剂含有来自眼内蛋白视网膜间感光细胞类视黄醇结合蛋白（也称为视黄醇结合蛋白3）的肽段（IRBP_1-20）、完全弗氏佐剂（CFA），并添加灭活的Mycobacterium tuberculosis。在颈背部注射该黏稠乳剂后，再进行一次腹腔注射百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）毒素。在症状出现时（第12–14天），于全身麻醉下采集眼底图像，通过临床检查评估疾病进展。这些数据可与后期时间点及疾病高峰期（第20–22天）的数据直接比较，并进行差异分析。同时，本方案允许研究者利用荧光素血管造影术评估血管通透性和损伤的潜在差异。EAU也可在其他小鼠品系中诱导，包括野生型或基因修饰小鼠，并可与新型疗法联合使用，为研究药物疗效和/或疾病机制提供了灵活性。

引言

本方案将演示如何通过皮下注射含有视网膜抗原的乳化佐剂，单次注射诱导C57BL/6J小鼠产生实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）。文中将详细说明通过检眼镜成像和组织学检查监测及评估疾病进展的方法，并列出了相应的测量参数。此外，还将讨论荧光素血管造影技术，该技术用于观察视网膜血管结构及通透性。

该实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型在临床病理特征以及驱动疾病发生的基本细胞和分子机制方面，重现了人类非感染性后葡萄膜炎的核心特征。EAU由自身反应性CD4⁺T淋巴细胞中的Th1和/或Th17亚群介导，这一点已在过继转移实验及IFNγ缺陷小鼠模型中得到证实¹。目前关于这些细胞在葡萄膜炎中潜在作用的许多认识，均来源于对EAU模型的研究²，在该模型的视网膜组织中可检测到Th1和Th17细胞的存在³。EAU常被用作临床前模型，以评估新型治疗方法在缓解疾病方面的有效性。在EAU模型中成功调控疾病的治疗策略，部分已在临床应用中显示出疗效，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。例如，一些免疫调节药物，包括靶向T细胞的环孢素、FK-506和雷帕霉素^4,5,6。近年来，该模型也被用于探索靶向新通路的干预措施，以研究其作用机制及对疾病结局的影响。这些干预包括通过溴结构域额外末端（BET）蛋白和P-TEFb抑制剂调控转录调控过程³。此外，一些较传统的策略，如VLA-4抑制剂，近期也被证明可通过调节效应性CD4⁺T细胞显著抑制EAU⁷。另外，使用TMP778（一种RORγt反向激动剂）靶向Th17细胞也被发现可显著抑制EAU⁸。此外，该模型还为研究视网膜中慢性自身免疫性炎症及其相关机制（如淋巴细胞致敏过程）提供了重要机会。

EAU 前临床研究的主要检测指标是通过视网膜眼底成像进行临床评估，较少情况下则通过光学相干断层扫描（OCT）评估视网膜完整性。在实验终点，进一步开展视网膜组织病理学评价，并通过流式细胞术对视网膜细胞进行免疫表型分析。眼底检查是一种易于使用的活体成像系统，可对整个视网膜进行快速且可重复的临床评估。对于免疫组织化学评估，相关技术基于制备视网膜切片，使我们能够研究组织结构中的炎症程度和结构损伤⁹。本方案将详细说明所有所用技术的评估标准和常规评分系统。通过眼底成像记录的损伤程度通常与组织学变化密切相关。这种对疾病严重程度进行监测和评估的双重方法可提供更高的敏感性和更可靠的测量结果。

EAU 是一种成熟且常用的临床前模型，用于免疫介导性眼病的研究与测试。该模型具有高度可靠性和可重复性，疾病发生率超过>95%，能够产生全面的数据，可用于验证或否定针对眼内炎症性疾病的新疗法。眼内炎症性疾病是全球工作年龄人群失明的主要原因之一¹⁰。

方案

所有实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法案》以及机构动物福利与伦理审查委员会（AWERB）的指南进行。

1. C57BL/6J 小鼠的饲养

1. 在特定病原体阴性环境中饲养的实验小鼠，采用12小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水 随意.
2. 在成年雌性C57BL/6J小鼠上进行所有实验（优先选择雌性，因为葡萄膜炎患者中女性与男性发病率之比为1.4比1）。根据体重和年龄将6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行随机分组。饲养小鼠 在独立通气笼具（IVC）中，每笼5-6只小鼠分组饲养。

2. C57BL/6小鼠的免疫

1. IRBP_1-20 - CFA 乳剂制备
   注意：乳剂制备对于疾病发生率和实验可重复性至关重要；因此，必须在整个制备过程及不同实验之间尽可能保持一致性。在制备乳剂时，应预先计算所有试剂的损耗量。损耗量约为原体积的1.5倍（即额外准备50%的体积），具体取决于计划免疫的小鼠数量。请参考以下示例：若需免疫10只小鼠，则应按15只小鼠的量进行准备，即400 µg（每20 g小鼠所需肽量）× 15只 = 6 mg。每只小鼠免疫剂量为200 µL（共需3 mL）。最终体积由肽溶液与CFA按1:1体积比组成，因此需要1.5 mL肽溶液和1.5 mL CFA。
   1. 在超净工作台中使用无菌技术配制所有无菌溶液。
   2. 称取所需量的人源IRBP_1-20（LAQGAYRTAVDLESLASQLT）冻干肽（每20 g小鼠400 µg）。用100% DMSO溶解肽粉。将储备液以冻干形式保存于-20 °C。
      注意：为确保粉末完全溶解，每一片都必须首先与DMSO接触，并无任何残留固体可见。分次加入少量PBS以达到最终体积。不要使用涡旋振荡器混匀，而应使用移液枪轻轻吹打。DMSO的最终浓度不得超过肽溶液总体积的1%。建议在底部呈锥形的20 mL塑料管中制备乳剂，以便DMSO更好地接触冻干粉末。
   3. 将DMSO-PBS肽溶液按1:1（v/v）加入已添加1.5 mg/mL灭活Mycobacterium tuberculosis的CFA中，使终浓度为2.5 mg/mL。逐滴加入，并频繁轻柔吹打，形成黏稠且均匀分布的乳剂。
   4. 使用1000 µL移液枪（设定为700 µL以减少损耗）反复吸取并吹打肽溶液与CFA，直至形成奶油状浓稠乳剂。该技术需反复上下吹打直至达到理想黏稠度。 为获得最佳效果，确保抗原溶液与佐剂在注射前充分混合。
2. 百日咳毒素腹腔注射
   1. 将1.5 µg Bordetella pertussis毒素悬浮于100 µL RPMI 1640培养基中，培养基中添加1%小鼠血清¹¹。
   2. 使用无菌注射器和23G针头进行腹腔注射。
      注意：为避免干扰注射部位，必须在注射抗原前给予百日咳毒素。
   3. 将每只小鼠暂时转移至单独的笼子，接受一次100 µL的Bordetella pertussis毒素腹腔注射。
3. IRBP乳剂皮下注射
   1. 随后，将IRBP乳剂进行皮下注射。此操作需两名符合健康与安全规范着装的动物操作人员共同完成。
   2. 由一名训练有素的操作者将小鼠轻柔固定在笼盖上，抓握其颈部皮肤使其呈“抓颈”姿势，腹部朝下；另一名训练有素的操作者捏起背部颈部皮肤，形成帐篷状结构，以便将针头插入手指与拇指之间的皮下间隙。
      警告：存在针刺伤风险。
   3. 针头定位后，注入200 µL IRBP乳剂。拔针时，旋转针头以闭合皮肤，随后对注射部位施加压力，防止乳剂反流。
      警告：乳剂不得接触小鼠皮肤或毛发，否则可能引起刺激，严重时可导致皮肤损伤。一旦发生，应立即用70%乙醇彻底擦拭污染区域，然后擦干。
      ​注意：若研究结束时需取引流淋巴结进行检测，则注射部位应有所不同。此时应在两侧腹股沟区皮下各注射100 µL。此方法可在引流腹股沟淋巴结中引发更强的免疫反应，便于在取材时切除。然而，若实验目的仅为建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型，则优选在颈部背部单次注射200 µL，以避免多点注射带来的不适。

3. 临床评估 - 小鼠眼底检查

注意：临床疾病评分应通过检眼镜和用于可视化观察的 Discover 软件进行活体明场成像的眼底检查来完成。

1. 在疾病发作期（第12-14天），使用氯胺酮（Ketamine，50 mg/mL）和多米特（Domitor，Medetomidine；1 mg/mL）的混合物对小鼠实施全身麻醉。将1份Domitor、1.5份Ketamine和2.5份无菌注射用水混合稀释，然后按每30 g体重注射100 µL的剂量进行腹腔注射。上述麻醉剂组合应使用1 mL无菌注射器和23G针头。
2. 随后，监测小鼠以确保其所有反射消失，并对刺激无反应。
3. 腹腔注射后立即在小鼠仍被提住颈背部皮肤时，将1%托吡卡胺（tropicamide）和2.5%去氧肾上腺素（phenylephrine）滴于每只眼睛表面，以实现瞳孔扩张。应确保两种扩瞳液完全覆盖角膜。瞳孔完全扩张可能需要数分钟时间。
4. 之后，在眼睛表面充分涂抹维他泪（viscotears）眼膏，并在整个成像过程中持续使用，以保持眼球充分润滑和湿润。
5. 同时，打开成像软件（例如Discover），并将眼底镜（例如Micron）设置为明场模式进行图像采集。为每只小鼠单独建立文件夹，并根据所拍摄的眼睛在图像上标注R（右眼）或L（左眼）。
6. 将小鼠固定在专用的活体成像平台上，并调整显微镜位置，以便充分观察视网膜。
7. 为准确反映疾病状态，需拍摄整个视网膜区域的图像，包括视盘及周边所有区域。为此，需在成像过程中不断调整目镜。在整个成像过程中，必须始终保持眼球充分润滑；应定期补充眼膏以确保润滑效果。
8. 此时请参考下文第4节，进行荧光素血管造影操作。
9. 完成所有成像后，将麻醉拮抗剂（抗镇静剂Antisedan，5 mg/mL）用注射用水稀释，并按0.1 mg/kg剂量进行腹腔注射。将小鼠放回笼中，置于预热垫上，并提供湿化的饲料直至其恢复。完全恢复的标志是小鼠能够全身活动并在笼内稳定行走，通常需要数小时。
10. 在预定的实验终点（例如第21-23天），重复步骤4.1-4.5，再次拍摄整个视网膜区域的照片，覆盖视盘及周边所有区域，以准确记录疾病进展情况。

4. 荧光素眼底血管造影

1. 在动物麻醉状态下，为每只小鼠颈背部皮下注射2%荧光素，以检测血管渗漏，并调整位置使视网膜位于实时图像中央。
2. 将眼底镜的激发光滤光片设置为465-490 nm的蓝光，激发后采集的荧光素发射光波长范围为520-530 nm。
3. 荧光素注射后1.5分钟拍摄每只眼的视网膜照片，并在7分钟时再次拍摄。
   ​注意：上述时间点至关重要，若无法完成两次成像，至少应获取单眼图像。

5. 临床疾病评分

1. 根据以下标准的严重程度进行临床评估：视盘炎症、视网膜血管套袖样改变、视网膜组织浸润及结构损伤。
2. 对每个参数按0到5的评分标准打分，总分代表整个眼睛的临床疾病程度，每只眼睛最高得分为20分。表1可作为评分标准的参考依据。

6. 组织学与组织学评分

1. 安乐死后 通过颈椎脱位处死小鼠，用器械撑开眼睑以充分暴露眼球，摘除眼睛。
2. 接下来，将弯钳置于眼球后方，以夹住眶内结缔组织和视神经。注意避免挤压眼球。
3. 固定时，将眼球置于4%戊二醛中至少15分钟，以最小化视网膜脱离，随后转移至10%甲醛中固定至少24小时。1-2 mL固定液足以覆盖两只眼球。
4. 按照标准方案进行石蜡包埋、切片机切片和染色。建议任何染色类型的切片厚度为 3-4 µm。
5. 使用苏木精和伊红（Hematoxylin and Eosin, H&E）染色的标准方案对眼睛进行组织学检查&E) 染色。
6. 根据EAU评分标准，按照视网膜和脉络膜中免疫细胞浸润程度、视网膜层状结构破坏情况、肉芽肿形成程度以及视网膜脱离范围，对视网膜损伤情况进行0-4分的评分，具体标准如前所述（Agarwal 2013）并总结于 表2¹¹.

结果

在本实验方案中，我们描述了一种通过使用源自IRBP的致葡萄膜炎视网膜肽对小鼠进行免疫，从而诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型的逐步操作方法。文中涵盖了广泛使用且易于获取的疾病评估方法，尽管这些方法并非唯一选择，也可根据需要补充或部分替换为其他成像技术。在C57BL/6J小鼠中，EAU的最早症状可在免疫后两周被检测到，并在三周内达到疾病高峰，如图1所示。在疾病进展过程中，眼底镜检查所见的改变被分为炎症性改变，包括视网膜组织、血管及视盘的炎症，以及视网膜结构损伤（图2），此外还包括基于免疫细胞浸润和结构损伤的组织病理学改变。这些临床和组织病理学变化可在免疫后持续检测长达85天，并通过分级和评分用于评估疾病进展。为避免在定性视觉评分中产生无意偏倚，图像应由多位专家独立评估，且评分者需对处理分组设盲。

本文展示了临床和组织学评分系统（表1 和 表2）如何指导科研人员量化实验性自身免疫性葡萄膜炎（E...

讨论

实验动物模型是研究疾病发病机制和新型治疗方案临床前测试的必要工具。在本方案中，我们介绍了一种诱导、监测和评分实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的方法，该模型为眼内炎症性葡萄膜炎的实验模型。当所有操作均严格按照本方案所述步骤进行时，该EAU模型的疾病发生率超过95%，并可形成慢性单相型EAU。为达到此发生率，我们特别强调抗原制备及乳剂注射的重要性，上述步骤已在前文详细说明。动物EAU的主要特征包括视网膜和/或脉络膜炎症、视网膜血管炎、光感受器破坏以及视力丧失，这些均代表了人类后部葡萄膜炎诸多关键的临床病理特征。¹²对葡萄膜炎中基本细胞与分子机制的许多认识均源于本文所述的实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型。EAU可在小鼠中诱导产生¹³ 和大鼠¹¹ 通过用淋巴细胞可识别的视网膜抗原进行主动免疫。这些视网膜抗原具有多种形式；小鼠使用IRBP，大鼠使用视网膜可溶性抗原（S-Ag）。在C57BL/6J遗传背景下诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），可产生更慢性的疾病形式，病理高峰出现在免疫后三周。相比...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗sedan	美国硕腾公司		用于唤醒
完全弗氏佐剂’佐剂；完全弗氏佐剂	英国 Sigma	F5881	用于免疫
多米托	Orion Pharma，芬兰		用于麻醉
荧光素	英国 Sigma	F2456	用于血管造影
IRBP1-20	Chamberidge 肽，英国		肽；抗原
氯胺酮	Orion Pharma，芬兰		用于麻醉
Micron III	Phoenix Research，美国		用于检眼镜检查
小鼠血清	英国 Sigma	M5905	用于免疫
Mycobacterium tuberculosis	英国 Sigma	344289	用于免疫
百日咳毒素	英国 Sigma	P2980	用于免疫
盐酸去氧肾上腺素 2.5%	Bausch &安普&隆布英国公司	PHEN25	用于扩张
1% 托吡卡胺	SANDOZ		用于扩瞳
维赛泪	WELDRICKS 药房，英国	2082642	用于眼部润滑