实验性自身免疫性葡萄膜炎：一种眼内炎症的小鼠模型

摘要

在本报告中，我们介绍了一种可使研究人员建立小鼠眼内葡萄膜炎模型的实验方案。该模型通常被称为实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），是一种成熟的模型，能够模拟人类疾病的多个方面。本文将描述如何通过多种检测指标来诱导并监测疾病进展。

摘要

实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）由免疫细胞对自身抗原的反应所驱动。这一非感染性眼内炎症疾病模型的多种特征可重现人类后葡萄膜炎的临床表型。EAU已被可靠地用于研究新型抗炎治疗药物的疗效、作用机制，并进一步探究眼内疾病进展背后的病理机制。本文提供了在C57BL/6J小鼠中诱导EAU的详细方案——这是最广泛使用的、对该疾病具有易感性的模式生物。将通过检眼镜检查、组织学分析和荧光素血管造影术来演示对疾病严重程度和进展的临床评估。诱导过程包括在皮下 注射一种乳剂，该乳剂含有来自眼内蛋白视网膜间感光细胞类视黄醇结合蛋白（也称为视黄醇结合蛋白3）的肽段（IRBP_1-20）、完全弗氏佐剂（CFA），并添加灭活的Mycobacterium tuberculosis。在颈背部注射该黏稠乳剂后，再进行一次腹腔注射百日咳博德特氏菌（Bordetella pertussis）毒素。在症状出现时（第12–14天），于全身麻醉下采集眼底图像，通过临床检查评估疾病进展。这些数据可与后期时间点及疾病高峰期（第20–22天）的数据直接比较，并进行差异分析。同时，本方案允许研究者利用荧光素血管造影术评估血管通透性和损伤的潜在差异。EAU也可在其他小鼠品系中诱导，包括野生型或基因修饰小鼠，并可与新型疗法联合使用，为研究药物疗效和/或疾病机制提供了灵活性。

引言

本方案将演示如何通过皮下注射含有视网膜抗原的乳化佐剂，单次注射诱导C57BL/6J小鼠产生实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）。文中将详细说明通过检眼镜成像和组织学检查监测及评估疾病进展的方法，并列出了相应的测量参数。此外，还将讨论荧光素血管造影技术，该技术用于观察视网膜血管结构及通透性。

该实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型在临床病理特征以及驱动疾病发生的基本细胞和分子机制方面，重现了人类非感染性后葡萄膜炎的核心特征。EAU由自身反应性CD4⁺T淋巴细胞中的Th1和/或Th17亚群介导，这一点已在过继转移实验及IFNγ缺陷小鼠模型中得到证实¹。目前关于这些细胞在葡萄膜炎中潜在作用的许多认识，均来源于对EAU模型的研究²，在该模型的视网膜组织中可检测到Th1和Th17细胞的存在³。EAU常被用作临床前模型，以评估新型治疗方法在缓解疾病方面的有效性。在EAU模型中成功调控疾病的治疗策略，部分已在临床应用中显示出疗效，并获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准。例如，一些免疫调节药物，包括靶向T细胞的环孢素、FK-506和雷帕霉素^4,5,6<....

方案

所有实验均按照英国1986年《动物（科学程序）法案》以及机构动物福利与伦理审查委员会（AWERB）的指南进行。

1. C57BL/6J 小鼠的饲养

1. 在特定病原体阴性环境中饲养的实验小鼠，采用12小时光照-黑暗循环，自由摄食和饮水 随意.
2. 在成年雌性C57BL/6J小鼠上进行所有实验（优先选择雌性，因为葡萄膜炎患者中女性与男性发病率之比为1.4比1）。根据体重和年龄将6至8周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行随机分组。饲养小鼠 在独立通气笼具（IVC）中，每笼5-6只小鼠分组饲养。

2. C57BL/6小鼠的免疫

1. IRBP_1-20 - CFA 乳剂制备
   注意：乳剂制备对于疾病发生率和实验可重复性至关重要；因此，必须在整个制备过程及不同实验之间尽可能保持一致性。在制备乳剂时，应预先计算所有试剂的损耗量。损耗量约为原体积的1.5倍（即额外准备50%的体积），具体取决于计划免疫的小鼠数量。请参考以下示例：若需免疫10只小鼠，则应按15只小鼠的量进行准备，即400 µg（每20 g小鼠所需肽量）× 15只 = 6 mg。每只小鼠免疫剂量为200 µL（共需3 mL）。最终体积由肽溶液与CFA按1:1体积比组成，因此需要1.5 mL肽溶液和1.5 mL CFA。
   1. 在超....

结果

在本实验方案中，我们描述了一种通过使用源自IRBP的致葡萄膜炎视网膜肽对小鼠进行免疫，从而诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型的逐步操作方法。文中涵盖了广泛使用且易于获取的疾病评估方法，尽管这些方法并非唯一选择，也可根据需要补充或部分替换为其他成像技术。在C57BL/6J小鼠中，EAU的最早症状可在免疫后两周被检测到，并在三周内达到疾病高峰，如图1所示。在疾病进展过程中，眼底镜检查所见的改变被分为炎症性改变，包括视网膜组织、血管及视盘的炎症，以及视网膜结构损伤（图2），此外还包括基于免疫细胞浸润和结构损伤的组织病理学改变。这些临床和组织病理学变化可在免疫后持续检测长达85天，并通过分级和评分用于评估疾病进展。为避免在定性视觉评分中产生无意偏倚，图像应由多位专家独立评估，且评分者需对处理分组设盲。

本文展示了临床和组织学评分系统（表1 和 表2）如何指导科研人员量化实验性自身免疫性葡萄膜炎（E.......

讨论

实验动物模型是研究疾病发病机制和新型治疗方案临床前测试的必要工具。在本方案中，我们介绍了一种诱导、监测和评分实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）的方法，该模型为眼内炎症性葡萄膜炎的实验模型。当所有操作均严格按照本方案所述步骤进行时，该EAU模型的疾病发生率超过95%，并可形成慢性单相型EAU。为达到此发生率，我们特别强调抗原制备及乳剂注射的重要性，上述步骤已在前文详细说明。动物EAU的主要特征包括视网膜和/或脉络膜炎症、视网膜血管炎、光感受器破坏以及视力丧失，这些均代表了人类后部葡萄膜炎诸多关键的临床病理特征。¹²对葡萄膜炎中基本细胞与分子机制的许多认识均源于本文所述的实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）模型。EAU可在小鼠中诱导产生¹³ 和大鼠¹¹ 通过用淋巴细胞可识别的视网膜抗原进行主动免疫。这些视网膜抗原具有多种形式；小鼠使用IRBP，大鼠使用视网膜可溶性抗原（S-Ag）。在C57BL/6J遗传背景下诱导实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU），可产生更慢性的疾病形式，病理高峰出现在免疫后三周。相比.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗sedan	美国硕腾公司		用于唤醒
完全弗氏佐剂’佐剂；完全弗氏佐剂	英国 Sigma	F5881	用于免疫
多米托	Orion Pharma，芬兰		用于麻醉
荧光素	英国 Sigma	F2456	用于血管造影
IRBP1-20	Chamberidge 肽，英国		肽；抗原
氯胺酮	Orion Pharma，芬兰		用于麻醉
Micron III	Phoenix Research，美国		用于检眼镜检查
小鼠血清	英国 Sigma	M5905	用于免疫
Mycobacterium tuberculosis	英国 Sigma	344289	用于免疫
百日咳毒素	英国 Sigma	P2980	用于免疫
盐酸去氧肾上腺素 2.5%	Bausch &安普&隆布英国公司	PHEN25	用于扩张
1% 托吡卡胺	SANDOZ		用于扩瞳
维赛泪	WELDRICKS 药房，英国	2082642	用于眼部润滑