单细胞多重荧光成像技术用于可视化病毒核酸与蛋白质并监测HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感病毒感染

摘要

本文介绍了一种荧光成像方法的实验方案，即多重免疫荧光细胞检测法检测DNA、RNA和蛋白质（MICDDRP），该方法能够同时在单细胞水平上以荧光方式可视化不同种类和链型的病毒蛋白及其核酸。该方法可广泛应用于多种研究体系。

摘要

由于缺乏能够灵敏且同时标记病毒核酸和蛋白质的稳健原位杂交（ISH）技术，病毒动态复制与组装过程的捕捉一直受到阻碍。传统的DNA荧光原位杂交（FISH）方法通常无法与免疫染色兼容。因此，我们开发了一种成像方法——MICDDRP（multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein，基于细胞的多重免疫荧光检测DNA、RNA和蛋白质），可实现DNA、RNA和蛋白质在单细胞水平上的同时可视化。与传统的DNA FISH相比，MICDDRP采用分支DNA（bDNA）ISH技术，显著提高了寡核苷酸探针的灵敏度和检测能力。对MICDDRP进行少量改进后，即可在检测不同链型（RNA或DNA）病毒核酸的同时，对病毒蛋白进行成像。我们已将这些方案应用于研究多种病毒病原体的生命周期，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）-1、人类T细胞白血病病毒（HTLV）-1、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）、寨卡病毒（ZKV）和甲型流感病毒（IAV）。我们证明了该方法能够高效地标记多种不同病毒的核酸和蛋白质。这些研究有助于加深对多种病毒系统机制的理解，同时为在广泛的细胞系统中开展DNA、RNA和蛋白质的多重荧光成像提供了可借鉴的模板。

引言

尽管已有数千种商用抗体可用于通过传统的免疫染色方法特异性地标记蛋白质，且可通过基因工程将融合蛋白与光优化的荧光标签结合，以在样品中同时追踪多种蛋白质¹，但蛋白质的显微成像通常难以与传统的DNA荧光原位杂交（FISH）兼容²。由于基于荧光的方法在同时可视化DNA、RNA和蛋白质方面存在技术局限性，阻碍了对病毒复制过程的深入理解。在感染过程中同时追踪病毒核酸和蛋白质，可使病毒学家直观观察病毒复制与组装背后的基本生物学过程^3,4,5,6。

我们开发了一种成像方法，即基于细胞的多重免疫荧光DNA、RNA和蛋白质检测法（multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein, MICDDRP）

方案

1. 种子细胞（悬浮） 与 贴壁细胞）置于盖玻片或腔室载玻片上（本方案采用盖玻片）。

1. 悬浮细胞的接种
   1. 通过以下步骤制备多聚赖氨酸（PDL）包被的盖玻片（有助于悬浮细胞贴附于盖玻片）：首先将盖玻片在乙醇（EtOH）中孵育5分钟（以灭菌并去除残留物），然后在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤2次，再将盖玻片在PDL（20 µg/mL）中室温（RT）孵育30分钟（min）。
   2. 去除PDL溶液，并用PBS洗涤2次。收集细胞（根据所需成像条件预先感染或处理过的细胞），离心沉淀后重悬于50 µL PBS中，细胞密度为10⁶个/50 µL。将50 µL细胞悬液滴加至玻璃盖玻片（PDL包被）上，室温孵育30 min。
2. 贴壁细胞的接种
   1. 将细胞培养于置于6孔板中的无菌盖玻片上，并用病毒颗粒感染细胞或加入目标化合物处理。在进行成像实验样品制备前，使细胞生长至50–70%融合度。

2. 细胞固定：用于在荧光成像研究中保存细胞形态

注意：细胞固定前，将 4% PFA 和 PBS 置于室温下至少 30 分钟。

1. 吸弃细胞培养基，用 PBS 洗涤盖玻片上的细胞 3 次，然后用 4% 多聚甲醛（PFA）固定细胞 30 ....

结果

MICDDRP 的示意图如图1所示。在对 DNA 和 RNA 进行标记后，进行免疫染色。使用分支放大器可增强信号，从而实现对单个核酸分子的检测。

图1：MICDDRP 示意图及逐步工作流程。 (A) bDNA 信号被扩增 通过 分支预扩增和扩增DNA以增强病毒DNA（1）和RNA种类（2）的检测。寡核苷酸探针成对杂交（示意图中为ZZ）至目标序列，形成预扩增子（Amp 1-FL， 步骤 6 在 方案），放大器.......

讨论

同时可视化 RNA、DNA 和蛋白质通常需要进行大量优化。两种常用的方法是 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）标记和 DNA FISH。EdU 标记已被用于同时可视化病毒 DNA 和蛋白质，因为 EdU 可掺入新生 DNA 中，并通过点击化学反应与含叠氮基的荧光染料进行后续标记。via 因此，EdU 标记可用于监测 DNA 病毒或具有 DNA 复制模板的病毒的天然复制动力学¹²。然而，EdU 标记的一个缺点是，在分裂细胞中，复制的基因组会掺入 EdU，导致背景信号升高，干扰图像分析。DNA FISH 可通过将核酸探针直接杂交至相应靶标来规避这些问题，且不受细胞周期影响。然而，传统的 FISH 通常依赖高温以实现高效的探针杂交，从而阻碍了免疫染色甚至同时进行的 RNA 染色¹³。MICDDRP 有可能克服这些问题，可在多种细胞系统中实现 DNA、RNA 和蛋白质的稳定同步荧光标记。

尽管我们已证明可以使用MICDDRP方案同时标记蛋白质和核酸，但仍需在不同系统中进行优化.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
4% PFA
50% 硫酸葡聚糖	Amreso	198	用于DNA杂交缓冲液
50X 洗涤缓冲液	ACD Bio	320058
6孔板
扩增剂 1-FL	ACD Bio
扩增剂 2-FL	ACD Bio
扩增剂 3-FL	ACD Bio
扩增剂 4-FL	ACD Bio		参见方案中的Amp-4表格
抗HCV NS5a抗体	Abcam	ab13833	小鼠单克隆抗体；适用于HCV基因型1a、1b、3和4
抗HIV-1 p24单克隆抗体	NIH AIDS试剂项目	3537
抗Mov10抗体	Abcam	ab80613	兔多克隆抗体
抗PB1抗体	GeneTex	GTX125923	流感病毒蛋白抗体
牛血清白蛋白			免疫染色封闭试剂
含补充物的细胞培养基			适用于细胞模型的培养基
盖玻片
DAPI	ACD Bio		细胞核染料（来自ACD Bio的RNAscope试剂盒）
杜氏磷酸盐缓冲液（1X PBS）	Gibco	14190250	不含钙和镁
碳酸乙烯酯	Sigma	E26258
胎牛血清（FBS）			根据二抗所用血清来源选择相应的FBS（例如山羊FBS）
Fisherbrand Colorfrost Plus显微镜载玻片	Fisher Scientific	12-550-17/18/19	预清洁
HCV-GT2a-sense-C2探针	ACD Bio	441371	HCV(+)正义RNA探针
HIV-gagpol-C1	ACD Bio	317701	HIV-1 cDNA探针
HIV-nongagpol-C3	ACD Bio	317711-C	HIV-1 RNA探针
HybEZ杂交炉	ACD Bio	321710/321720
ImmEdge疏水屏障笔	Vector Laboratories	H-4000
指甲油			用于蛋白酶处理前将盖玻片固定于载玻片
无核酸酶水	Ambion	AM9937
聚-D-赖氨酸（PDL）			用20 µg/mL PDL包被盖玻片30分钟
探针稀释液	ACD Bio	300041	用于稀释RNA C2或C3探针
Prolong Gold抗荧光淬灭封片剂	Invitrogen	P36930
蛋白酶III	ACD Bio	322337
RNAscope® 探针- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221
RNase A	Qiagen
二抗
载玻片
氯化钠			用于DNA杂交缓冲液
柠檬酸钠，pH 6.2			用于DNA杂交缓冲液
Tween-20			用于DNA杂交缓冲液和PBS-T
V-HBV-GTD	ACD Bio	441351	总HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2	ACD Bio	465531-C2	HBV pgRNA探针
V-HCV-GT2a探针	ACD Bio	441361	HCV(-)正义RNA探针
V-HTLV-HBZ-sense-C3	ACD Bio	495071-C3	靶向HBZ的HTLV-1 (-)正义RNA探针
V-HTLV1-GAG-C2	ACD Bio	495051-C2	HTLV-1 DNA探针
V-HTLV1-GAG-POL-sense	ACD Bio	495061	HTLV-1 (+)正义RNA探针
V-Influenza-H1N1-H5N1-NP	ACD Bio	436221	IAV RNA探针
V-ZIKA-pp-O2	ACD Bio	464531	寨卡病毒(+)正义RNA探针
V-ZIKA-pp-O2-sense-C2	ACD Bio	478731-C2	寨卡病毒(-)正义RNA探针