方法文章

单细胞多重荧光成像，可可视化病毒核酸和蛋白质，并监测 HIV、HTLV、HBV、HCV、寨卡病毒和流感感染

DOI：

10.3791/61843

⸱

2020年10月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biochemical Pharmacology, Department of Pediatrics, Emory University School of Medicine, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, University of Missouri School of Medicine

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的是荧光成像方法的 协议，multiplex immunofluorescent cELL 基于d etection of DNA， RNA和 Protein（MICDDRP），该方法能够同时对不同类型和链的病毒蛋白和核酸进行荧光单细胞可视化。这种方法可以应用于各种系统。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于缺乏能够灵敏和同时标记病毒核酸和蛋白质的强大原位杂交（ISH）技术，捕获病毒的动态复制和组装过程受到了阻碍。传统的DNA荧光原位杂交（FISH）方法通常与免疫染色不兼容。因此，我们开发了一种成像方法 MICDDRP （multiplex immunofluorescent c ell-basedd etection of D NA， RNA和 Protein），该方法能够同时进行DNA，RNA和蛋白质的单细胞可视化。与传统的DNA鱼相比，MIDDRP采用支链DNA（bDNA）ISH技术，可显著提高寡核苷酸探针的灵敏度和检测。MICDDRP的微小修饰能够同时对病毒蛋白进行成像，同时具有不同链的核酸（RNA或DNA）。我们已经应用这些协议来研究多种病毒病原体的生命周期，包括人类免疫缺陷病毒（HIV）-1，人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）-1，乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV），寨卡病毒（ZKV）和甲型流感病毒（IAV）。我们证明了我们可以有效地标记各种病毒中的病毒核酸和蛋白质。这些研究可以为我们提供对多种病毒系统的机理理解，此外，还可以作为在广泛的细胞系统中应用DNA，RNA和蛋白质的多重荧光成像的模板。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

虽然数以千计的商业抗体可用于通过常规免疫染色方法特异性标记蛋白质，并且虽然融合蛋白可以使用光优化荧光标签进行工程设计以跟踪样品中的多种蛋白质1，但蛋白质的显微可视化通常与传统的DNA荧光原位杂交（FISH）不兼容2.使用基于荧光的方法同时可视化DNA、RNA和蛋白质的技术限制阻碍了对病毒复制的深入了解。在感染过程中跟踪病毒核酸和蛋白质使病毒学家能够可视化病毒复制和组装的基本过程3，4，5，6。

我们开发了一种成像方法，即基于d na，rNA和Protein的成像方法m ultiplex immunofluorescent cell（MICDDRP）3，该方法利用支链DNA（bDNA）原位技术来提高核酸检测的灵敏度7，8，9.此外，该方法利用成对探针来增强特异性。bDNA序列特异性探针使用分支前置放大器和放大器DNA产生强烈的局部信号，改进了以前的杂交方法，该方法依赖于靶向DNA9中的重复区域。临床环境中的受感染细胞通常不含丰富的病毒遗传物质，为诊断环境中荧光核酸检测的灵敏方法提供了商品。通过RNAscope7和ViewRNA10等方法实现bDNA技术的商业化填补了这一空白。bDNA荧光成像的灵敏度在细胞生物学中也具有重要的用途，可以检测细胞培养模型中稀缺的核酸种类。灵敏度的巨大提高使基于bDNA的成像方法适用于研究病毒。然而，一个潜在的缺点是这些方法专注于可视化RNA或RNA和蛋白质。所有复制细胞和许多病毒在其复制周期中都具有DNA基因组或形成DNA，因此非常需要能够对RNA和DNA以及蛋白质进行成像的方法。

在MICDDRP协议中，我们使用RNAscope方法进行bDNA FISH以检测病毒核酸，并修饰7。该方案的主要修改之一是化学固定后蛋白酶处理的优化。蛋白酶处理有助于去除与核酸结合的蛋白质，从而提高探针杂交效率。蛋白酶处理后用支链寡核苷酸探针孵育。应用bDNA探针后，洗涤样品，随后与信号前置放大器和放大器DNA一起孵育。多重原位杂交（ISH），标记多个基因靶标，需要具有不同颜色通道的靶标探针进行光谱分化7。用DNA扩音器孵育后进行免疫荧光（IF）。

bDNA ISH通过放大靶标特异性信号来改善信噪比，并减少非特异性杂交事件的背景噪声7，11。靶探针是使用公开可用的软件程序设计的，这些软件程序预测非特异性杂交事件的概率，并计算探针-目标杂交7，11的熔解温度（Tm）。靶探针包含一个与靶DNA/RNA序列互补的18至25碱基区域、一个间隔序列和一个14个碱基的尾部序列。一对靶探针，每个探针具有不同的尾序列，杂交到目标区域（跨越~50个碱基）。两个尾序列形成前置放大器探针的杂交位点，其中包含20个放大器探针的结合位点，此外还包含20个标记探针的结合位点。例如，核酸分子上的一千碱基（kb）区域被20个探针对靶向，从而创建一个分子支架，用于与前置放大器、放大器和标记探针进行顺序杂交。因此，这可以使每个核酸分子的理论产量达到8000个荧光标记，从而能够检测单个分子，并且比传统的FISH方法7有了巨大的改进（bDNA信号扩增示意图见图1A）。要为多路复用 ISH 设置探针，每个目标探针必须位于不同的颜色通道（C1、C2 或 C3）中。这些具有不同颜色通道的目标探针具有不同的14碱基尾序列。这些尾部序列会将不同的信号放大器与不同的荧光探针结合，从而实现跨多个目标的光谱分化。在所提出的方案中，步骤9中的表4提供了有关荧光标记靶探针的更多信息。此外，图2和图3提供了我们如何选择合适的放大器4-FL（A，B或C）（荧光探针和最终杂交步骤）的示例，以实现HIV-1和HTLV-1感染后多个病毒核酸靶标的特异性荧光标记。

我们已经展示了同时对RNA，DNA和蛋白质进行荧光可视化的几种应用，以高时空分辨率3，4，5观察病毒复制的关键阶段。例如，病毒RNA，细胞质和核DNA以及蛋白质的同时单细胞可视化使我们能够可视化HIV-1感染期间的关键事件，包括在核进入和前病毒DNA3整合之前跟踪细胞质中含有核心的RNA。此外，我们还应用MICDDRP来表征宿主因子和药物治疗对病毒感染和复制的影响4，5。在Ukah等人中，我们跟踪了用不同潜伏逆转剂处理的潜伏期细胞模型中HIV-1转录的再激活，以可视化HIV转录和潜伏期逆转4。此外，MICDDRP可以让我们可视化与小分子治疗或宿主因子限制引起的抗病毒抑制相关的表型变化。作为我们方法稳健性和广泛适用性的概念证明，我们已经证明，我们可以使用我们的方案的修改来有效地标记病毒核酸，以跟踪感染，不仅在人类免疫缺陷病毒（HIV）-1，而且在人类嗜T淋巴细胞病毒（HTLV）-1，乙型肝炎病毒（HBV），丙型肝炎病毒（HCV）， 寨卡病毒（ZIKV）和甲型流感病毒（IAV）。由于HIV-1生命周期由病毒DNA和RNA物种组成，因此我们已经根据HIV-1复制动力学对MICDDRP进行了大部分优化。然而，此外，我们已经证明，我们可以跟踪ZIKV，IAV，HBV和HCV等病毒中或两种感觉（+）和反义（-）链的不同病毒RNA转录本的合成，以监测病毒转录和复制3，4，5，6。这些研究旨在提高对几种病毒过程的机制理解，并作为将这种荧光成像技术应用于各种细胞模型的指南。

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方案

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1.盖玻片或腔室载玻片上的种子细胞（悬浮液 与 贴壁细胞）（提供的方案使用盖玻片）。

  1. 悬浮细胞的接种
    1. 通过首先将盖玻片在乙醇（EtOH）中孵育5分钟（灭菌盖玻片并去除任何残留物）来制备聚-D-赖氨酸（PDL）包被的盖玻片（促进悬浮细胞粘附到盖玻片上）。然后在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中洗涤2x，然后在室温（RT）下将盖玻片在PDL（20μg/ mL）中孵育30分钟（分钟）。
    2. 去除 PDL 并在 PBS 中洗涤 2 次。沉淀细胞（先前根据所需的成像条件感染/处理）并将 106 个细胞重悬于 50 μL PBS 中。在玻璃上点缀 50 μL 细胞（PDL 包衣），并在室温下孵育 30 分钟。
  2. 贴壁细胞的接种
    1. 将细胞放在无菌盖玻片上培养，置于6孔培养皿中，用病毒颗粒感染细胞或用感兴趣的化合物处理。在成像实验的样品制备之前，让细胞达到50-70%的汇合度。

2. 细胞固定:保存细胞形态以进行荧光成像研究

注意:在细胞固定前，将 4% PFA 和 PBS 保持在室温至少 30 分钟。

  1. 吸出细胞培养基，在PBS中在盖玻片上洗涤细胞3次，并将细胞固定在4%多聚甲醛（PFA）中30分钟。吸出PFA并在PBS 2x中洗涤细胞。
    注意:如果实验者希望在另一个日期恢复实验，细胞现在可以脱水和储存。固定细胞在储存前可以在EtOH中脱水。
    1. 细胞固定后洗涤后去除PBS，并用500μL的50%EtOH（水中v / v）替换。在室温下孵育5分钟。
    2. 去除 50% 的 EtOH，并用 500 μL 的 70% EtOH 代替。在室温下孵育5分钟。
    3. 去除 70% 乙醇，并用 500 μL 100% 乙基醇代替。在室温下孵育5分钟。
    4. 去除100%环氧乙烷，并用新鲜的100%乙醇代替。
      注意:脱水细胞可以在-20°C下储存6个月。储存前用胶带或封口膜密封板，以防止乙二醇蒸发。
    5. 对细胞进行再水化以转移到细胞/病毒的多重荧光标记上。
    6. 去除 100% 乙醇，并用 500 μL 70% 乙基醇代替。在室温下孵育2分钟。
      注意:任何时候都不要让细胞变干。始终使用足够的溶液来淹没所有细胞。
    7. 去除 70% 的 EtOH，并用 500 μL 的 50% EtOH 代替。在室温下孵育2分钟。
    8. 去除 50% 的 EtOH，并用 1x PBS 代替。
      注意:在蛋白酶处理（步骤4） 和目标探针应用（步骤5）之前准备蛋白酶稀释液，杂交探针和洗涤缓冲液。有关试剂制备的具体说明在每个相应步骤的开头提供。
试剂其他注意事项
蛋白酶溶液在 1X PBS 中制备
目标寡核探针在杂交缓冲液中稀释
洗涤缓冲液按照靶标杂交步骤洗涤
杂交缓冲液配方如表3所示

表 1:MICDDRP 方案中的关键试剂。

3. 细胞透化:增加大分子（抗体、核酸杂交探针）进入细胞和细胞器的通道

  1. 细胞固定或补液后取出 1x PBS，并在 1x PBS 中用 500 μL 的 0.1% （v/v） 吐温-20 替换。在室温下孵育10分钟。逐个替换。用 500 μL 1x PBS 洗涤一次，然后加入新鲜的 1x PBS。

4. 玻片盖 玻片 固定和 蛋白酶处理 ，去除固定病毒/细胞核酸中的核酸结合蛋白，提高杂交效率

注意:在细胞透化过程中制备稀释的蛋白酶III（参见 材料表中的试剂细节）溶液。让蛋白酶在透化前达到室温10分钟。

  1. 将一小滴指甲油放在无菌载玻片上。干燥背部（没有细胞层的一面），并将盖玻片的边缘放在指甲油滴上，粘附细胞朝上的一侧朝上。在固定的盖玻片上加入几滴PBS以防止干燥。
    1. 使用疏水屏障笔（使试剂定位在细胞上的憎水笔）在现在粘附在载玻片上的盖玻片周围画一个圆圈（距离盖玻片约 3 毫米）。
  2. 在 1x PBS（100 μL/盖玻片）中稀释蛋白酶 III。
    注意:蛋白酶浓度可能需要根据细胞类型、探针或靶核酸的差异通过经验优化进行调整（参见 讨论）。为了在不同病毒系统中实现最有效的RNA / DNA标记，我们成功地进行了下表2所示的以下稀释，稀释范围为（1至 2 ）-（1至15）（蛋白酶至1x PBS）。
探测目标蛋白酶稀释在 1X PBS 中（蛋白酶 III 至 1X PBS）
HIV-1 DNA/RNA1 到 5
HTLV-1 脱氧核糖核酸/核糖核酸1 到 5
乙肝病毒核糖核酸和总乙肝病毒核糖核酸1 到 15
亚病毒核酸核糖核酸1 到 15
齐克病毒核糖核酸1 至 2

表2:用于病毒核酸杂交的PBS中的蛋白酶III稀释液。

  1. 固定后在盖玻片上倒出1x PBS，并应用稀释的蛋白酶III。
  2. 在40°C的加湿烤箱中孵育15分钟。
  3. 倒出蛋白酶溶液并将载玻片浸没在 1x PBS 中。在室温下用摇摆盘搅拌2分钟，用新的1x PBS重复洗涤。
    1. 对于仅DNA检测，用无核酸酶水洗涤样品三次，每次2分钟，然后用在PBS中稀释的5mg / mL RNase A在37°C下孵育30分钟。
    2. 倒出RNase A溶液，用超纯水洗涤3次2分钟。继续对目标探针进行 ISH。
      注意:杂交缓冲液可在不影响所提供结果的vRNA染色效率的情况下改进vDNA检测（代表性结果）。用杂交探针 1:1 稀释 DNA 通道 1 （C1） 探针。在杂交缓冲液中稀释RNA C2和C3探针。我们的成像研究中使用的C2和C3探针采用50X溶液（1:50;靶探针 到 杂交缓冲液）。
  4. 按照以下分步程序在无核酸酶水中制备杂交缓冲液:
    1. 在 15 mL 管中，加入 700 μL 无核酸酶水、300 μL 50%（重量/体积 （w/v））葡聚糖硫酸盐、300 μL 5 M NaCl、125 μL 200 mM 柠檬酸钠 （pH 6.2） 和 375 mg（粉末）碳酸乙烯酯。
    2. 使用涡旋充分混合以溶解碳酸乙烯酯（确保所有粉末溶解并澄清溶液）。
    3. 加入 25 μL 10%（体积/体积 （v/v））吐温-20 和足够的无核酸酶水以完成 2.5 mL（2x 溶液）。
      注意:所示杂交缓冲液的配方可在下面的 表3 中找到。溶液稳定一周。确保吐温-20洗涤剂充分混合，同时注意防止溶液起泡。
试剂库存集中度附加说明
无核酸酶水那
葡聚糖硫酸盐50% （w/v）非常粘稠
氯化钠5 米
柠檬酸钠（pH 6.2）200 毫米储存在4°C
碳酸乙烯酯那粉
吐温-2010% （V/V）

表3:试剂杂交缓冲液列表。

5. 与 DNA/RNA 靶标杂交探针孵育:靶寡核苷酸探针与目标区域结合，形成用于前置放大器、放大器和荧光探针结合的分子支架。

注意:如果没有包括RNase处理，则在40°C下加热DNA / RNA探针10分钟（在细胞透化期间），并冷却至RT至少10分钟。如果在靶标探针杂交之前需要RNase处理或进一步的样品处理，请相应地加热探针。升温后旋转C2和C3探针，并在杂交缓冲液中稀释。稀释后，可以短暂加热C2和C3探头。在40°C下温热50x洗涤缓冲液（详见 材料表 ）10-20分钟，并在分子生物学级水中稀释至1x。

  1. 在加入杂交探针之前，将 200 μL 杂交缓冲液在 67 °C 下孵育 10 分钟。在杂交缓冲液中稀释探针（ 配方如表2所列）。加入 50 μL/盖玻片。
  2. 在40°C的加湿炉中孵育2小时（h）。倾析探针并将载玻片浸没在 1x 洗涤缓冲液中。在室温下摇动培养皿搅拌2分钟，用新的1x洗涤缓冲液重复洗涤。

6. 扩音器（放大器）1-FL 杂交:添加与靶 DNA/RNA 探针尾序列互补的前置扩音器（步骤 5）

注意:放大器在使用前应处于室温状态。使用前 30 分钟将每个单独的放大器从冰箱中取出，然后放在室温工作台上。

  1. 从 1x 洗涤缓冲液中取出载玻片并轻拍/吸收以去除多余的液体。
  2. 在盖玻片上加入 1 滴 Amp 1-FL。在40°C的加湿炉中孵育30分钟。
  3. 倒出放大器 1-FL 并浸没在 1x 洗涤缓冲液中。在室温下摇动培养皿2分钟搅拌，用新的1x洗涤缓冲液重复洗涤。

7. Amp 2-FL 杂交:与具有同源识别序列的信号放大器一起孵育到前置放大器 （Amp 1-FL）

  1. 从 1x 洗涤缓冲液中取出载玻片并轻拍/吸收以去除多余的液体。
  2. 在盖玻片上加入 1 滴 Amp 2-FL。在40°C的加湿炉中孵育15分钟。
  3. 倒出安培 2-FL 并浸没在 1x 洗涤缓冲液中。在室温下摇动培养皿2分钟搅拌，用新的1x洗涤缓冲液重复洗涤。

8. Amp 3-FL 杂交:与第二个信号放大器一起孵育

  1. 从 1x 洗涤缓冲液中取出载玻片并轻拍/吸收以去除多余的液体。
  2. 在盖玻片上加入 1 滴 Amp 3-FL。在40°C的加湿炉中孵育30分钟。
  3. 倾析放大器 3-FL 并浸没在 1x 洗涤缓冲液中。在室温下摇动培养皿2分钟搅拌，用新的1x洗涤缓冲液重复洗涤。

9. Amp 4-FL杂交:荧光标记和最终杂交步骤

注意:首先，请参阅表 4，根据目标探头的通道选择合适的 Amp 4（A、B 或 C）- FL。评估标记目标 DNA/RNA 所需的 Amp 4-FL。下表提供了一个示例:

一个BC
DNA 通道 1 （C1）488550550
DNA/RNA 通道 2 （C2）550488647
核糖核酸通道 3 （C3）647647488

表 4:用于多重 ISH 的 Amp 4（A、B 或 C）-FL 荧光探针的选择。

注意:对于多路复用 FISH（多个靶标），选择正确的 Amp 4（A、B 或 C）- FL 对于正确标记感兴趣的靶标至关重要。目标探针（步骤5）具有不同的颜色通道（C1、C2或C3），这些通道根据所选的Amp 4-FL决定其各自的荧光标记（Alexa 488，Atto 550或Alexa 647）。选择荧光团组合进行多重成像的示例如图 2 和 图3所示。作为另一个示例，选择 Amp 4B-FL 将选择性地使用 Atto 550 标记 DNA C1 探针，使用 Alexa 647 标记 RNA C3 探针。

  1. 从 1x 洗涤缓冲液中取出载玻片并轻拍/吸收以去除多余的液体。
  2. 在盖玻片上加入 1 滴 Amp 4-FL。在40°C的加湿炉中孵育15分钟。
    注意:按照步骤9.2，盖住样品，避光。
  3. 倾析放大器 4-FL 并浸没在 1x 洗涤缓冲液中。在室温下摇动培养皿搅拌2分钟，用新的1x洗涤缓冲液重复洗涤。用 1x PBS（2 分钟）清洗并存放在 PBS 中。

10. 蛋白质免疫染色:标记感兴趣的蛋白质

  1. 倒出 PBS 并向盖玻片中加入 200 μL 封闭缓冲液（1% w/v BSA，10% v/v FBS 在 PBS 中，0.1% v/v 吐温-20 （PBST））。在室温下孵育1小时。
  2. 倒出封闭缓冲液并应用在PBST + 1% w/v BSA中稀释的200 μL一抗。在室温下孵育1小时。
  3. 用PBST在室温下摇动洗涤载玻片两次10分钟。
  4. 在室温下以PBST + 1% w / v BSA应用所选的二抗1小时。
  5. 用PBST在室温下摇动洗涤载玻片10分钟。

11. 核染色:免疫染色后的复染细胞核

  1. 倒出PBST并在室温下应用DAPI或所选的核染色剂1分钟。
  2. 用PBS在室温下摇动洗涤载玻片两次10分钟。

12. 安装

  1. 将 1 滴抗淬灭溶液（例如 Prolong Gold）放在新的无菌载玻片上（首先，用 EtOH 清洁载玻片并晾干以确保玻璃上没有残留物）。使用相同的尖端，铺开抗淬灭溶液滴剂以覆盖大约盖玻片大小的区域。
    注意:防淬灭溶液非常粘稠，可能难以移液。在移液前切断 200 μL 吸头可能会缓解这些问题。
  2. 从载玻片上取下带有细胞样品的盖玻片，然后浸入PBS中，以使用镊子和PBS去除背部残留的指甲油。使用Kimwipe擦干镊子和盖玻片的背面。
  3. 将盖玻片轻轻嵌入抗淬灭溶液液滴中，将盖玻片的样品侧（带有细胞层的一侧）放在液滴上）。
  4. 让样品干燥过夜。

13. 成像

  1. 用落射荧光显微镜成像。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MICDDRP的示意图如图 1所示。标记DNA和RNA之后进行免疫染色。支化放大器的使用增加了信号，允许检测单个核酸分子。

figure-results-1
图 1:MICDDRP 和分步工作流程示意图。 （A）bDNA信号通过分支前置放大器和放大器DNA放大，以增强对病毒DNA（1）和RNA物种（2）的检测。寡核苷酸探针成对（原理图中的ZZ）杂交到感兴趣的靶标，为前置放大器（Amp 1-FL，协议中的步骤6），放大器（Amp 2-和3-FL）和荧光探针（Amp 4，协议中的步骤9）创建支架。请参阅表 4，为多路复用 ...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

同时可视化 RNA、DNA 和蛋白质通常需要广泛的优化。两种常用的方法是5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EdU）标记和DNA FISH。EdU标记已被应用于同时可视化病毒DNA和蛋白质，因为EdU被掺入新生DNA中，随后通过点击化学 用 含叠氮化物的荧光染料标记。因此，EdU标记可用于监测DNA病毒的天然病毒复制动力学或具有DNA模板的病毒进行复制12。然而，EdU标记的一个缺点是，在分裂细胞中，复制基因组将结合EdU，产生高背景和混杂图像分析。DNA FISH可以通过将核酸探针直接杂交到相应的靶标来规避这些问题，而不管细胞周期如何。然而，传统的FISH通常依靠高温来实现高效的探针杂交，阻碍了免疫染色甚至同时进行RNA染色13。MICDDRP可以潜在地规避这些问题，在各种细胞系统中对DNA，RNA和蛋白质进行强大的同时荧光标记。

虽然我们已经证明可以使用MICDDRP方案同时标记蛋白质和核酸，但需要跨不同系统进行优化。我们必须优化的第一个主要参数是蛋白酶处理。我们在不同的条件...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作全部或部分得到了美国国立卫生研究院的支持（R01 AI121315，R01 AI146017，R01 AI148382，R01 AI120860，R37 AI076119和U54 AI150472）。我们感谢Raymond F. Schinazi博士和Sadie Amichai提供感染甲型流感病毒的细胞。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4% PFA
50% 硫酸葡聚糖Amreso198用于 DNA 杂交缓冲液
50X 洗涤缓冲液ACD 生物320058
6 孔板
放大器 1-FLACD 生物
放大器 2-FLACD 生物
放大器 3-FLACD
放大器 4-FLACD 生物咨询方案中的 Amp-4 表
抗 HCV NS5a 抗体Abcamab13833小鼠单克隆抗体;适用于 HCV 基因型 1a、1b、3 和 4
抗 HIV-1 p24 单克隆抗体NIH 艾滋病试剂计划3537
抗 Mov10 抗体Abcamab80613兔多克隆抗体
抗 PB1 抗体GeneTexGTX125923流感蛋白
血清白蛋白免疫染色封闭试剂
含补充剂适用于细胞模型的培养基
盖玻片
DAPIACD Bio细胞核染色（来自 ACD Bio 的 RNAscope 试剂盒）
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （1X PBS）Gibco14190250不含钙和镁
碳酸乙烯SigmaE26258
胎牛血清 （FBS）根据血清二抗的产生物使用特异性 FBS（例如山羊 FBS）
Fisherbrand colorfrost 加显微镜载玻片Fisher Scientific12-550-17/18/19预清洁
HCV-GT2a-sense-C2探针ACD Bio441371HCV（+） sense RNA探针
HIV-gagpol-C1ACD Bio317701HIV-1 cDNA探针
HIV-nongagpol-C3ACD Bio317711-CHIV-1 RNA探针
HybEZ杂交炉ACD Bio321710/321720
ImmEdge疏水屏障笔Vector LaboratoriesH-4000
指甲油用于在蛋白酶处理前将盖玻片固定到载玻
无核酸酶水AmbionAM9937
聚-d-赖氨酸 （PDL）涂覆 20 &微量盖玻片;g/mL PDL 持续 30 分钟
探针稀释剂ACD Bio300041用于稀释 RNA C2 或 C3 探针
延长金抗淬灭InvitrogenP36930
蛋白酶 IIIACD 生物322337
RNAscope® 探针-V-Influenza-H1N1-H5N1-NPACD 生物436221
RNase AQiagen
二抗
载玻片
氯化用于 DNA 杂交缓冲液
柠檬酸钠，pH 6.2用于 DNA 杂交缓冲液
Tween-20用于 DNA 杂交缓冲液和 PBS-T
V-HBV-GTD生物441351总 HBV RNA
V-HBV-GTD-01-C2ACD 生物465531-C2HBV pgRNA 探针
V-HCV-GT2a 探针ACD 生物441361HCV（-） 正义 RNA 探针
V-HTLV-HBZ-sense-C3ACD 生物495071-C3HTLV-1 （-） 靶向 HBZ
的正义 RNA 探针V-HTLV1-GAG-C2ACD Bio495051-C2HTLV-1 DNA 探针
V-HTLV1-GAG-POL-senseACD 生物495061HTLV-1（+） 正义 RNA 探针
V-流感病毒-H1N1-H5N1-NPACD 生物436221IAV RNA 探针
V-ZIKA-pp-O2ACD 生物464531寨卡（+） 正义 RNA 探针
V-寨卡-pp-O2-sense-C2ACD 生物478731-C2寨卡（-） 正义 RNA探针
生物抗体 牛的细胞培养基 酯 片上 时间 钠

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zheng, Q., Lavis, L. D. Development of photostable fluorophores for molecular imaging. Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).
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