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使用扫描电子显微镜进行靶向获取体积信息的阵列断层成像工作流程

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DOI：

10.3791/61847

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2021年7月15日

 , 
1Thermo Fisher, 2Universite de Lausanne

本文内容

摘要

我们介绍了连续切片带的制备方法，以及将其收集在大型转移支撑材料上以用作阵列断层成像样本的流程，同时包括在扫描电子显微镜中进行自动成像的操作步骤。该方案可实现对局部稀有事件的筛选、定位与靶向成像，并支持大规模数据的采集。

摘要

电子显微镜被广泛应用于生物学和医学领域，以纳米级分辨率对细胞及其结构细节进行成像。历史上，透射电子显微镜（TEM）为研究细胞超微结构提供了重要见解；然而在近十年中，现代扫描电子显微镜（SEM）的发展改变了我们观察细胞内部的方式。尽管在需要蛋白质水平结构细节时，TEM的分辨率更优，但对于大多数与细胞器水平相关的细胞生物学问题，SEM的分辨率已足够使用。技术的进步推动了自动体积成像方法的发展，例如连续块面成像（SBF-SEM）和聚焦离子束扫描电镜（FIB-SEM）。然而直至今日，当目标区域的识别与精确定位至关重要时，这些方法仍效率低下。若缺乏在成像前精确定位目标区域的手段，操作者不得不采集远超实际所需的数据量（在SBF-SEM中），或者更糟的是，制备大量载网并逐一成像（在TEM中）。我们提出一种在SEM中利用阵列断层成像（Array Tomography）进行“横向筛选”的策略，可有效定位感兴趣区域，随后对样品总体积中的相关部分实施自动化成像。阵列断层成像样品在成像过程中得以保存，并可整理为切片文库，便于反复成像。本文展示了多个实例，表明通过横向筛选能够分析其他任何方法都极难获取的结构细节。

引言

尽管电子显微镜（EM）相关技术具有重要意义，但掌握这些技术所需付出的努力使得该领域仍局限于少数专家之中。其中一个主要困难在于，如何在为电镜观察而保存的样品中识别并定位感兴趣的区域（Region of Interest, ROI）。同一样品在光学显微镜下观察与经过电镜制样处理后的外观存在显著差异。化学制备样品所经历的变化包括：脱水步骤后产生的各向异性收缩（每个维度约10%），以及在固定和染色过程中使用锇酸（osmium）导致荧光信号的丧失。图1A）。对于超薄切片，样品需采用不同方法包埋于环氧树脂或丙烯酸树脂中（图1B）。为获得理想的制备结果，必须将整个样品分割成不超过1 mm × 1 mm的片段。为了满足标准透射电子显微镜（TEM）观察条件的要求，还需将该微小样品进一步切成50–150 nm厚的超薄切片。所得灰度图像能够比其他任何显微技术更详细地展示整个样品中极小部分的组织结构和细胞器形态。图1C）。典型的透射电子显微镜（TEM）数据集提供二维信息，理论上需外推以理解细胞和组织三维空间中自然发生的过程。 图1D 提出了超微结构体积成像所面临的挑战：若将一个边长为1,000 µm的立方体以50 nm的厚度进行切片，需要20,000个切片才能覆盖整个体积；对于边长为500 µm的立方体，则需要10,000个切片；而要覆盖50 µm × 50 µm × 50 µm的体积，则需要1,000个切片 "仅" 可能是必要的。手动获取该体积几乎不可能，而通过自动化方式实现也极为困难。如果除了样本深度外，还需要覆盖此类假想立方体的整个表面，那么1 µm的覆盖范围2 以合理的分辨率获取表面信息成为一个严峻的后勤问题（图1E）。尽管对于连接组学等超大规模项目而言，大量的切片至关重要，但对于大多数 "平凡的" 在电子显微镜项目中，生成更多用于观察的切片会带来显著的劣势。

获取三维超微结构信息的方法有多种：连续切片透射电子显微镜（TEM）、TEM断层扫描、阵列断层扫描（AT）、连续块面成像扫描电子显微镜（SBF-SEM）以及聚焦离子束扫描电子显微镜（FIB-SEM）。这些方法之间的主要区别在于切片策略，以及图像采集是否与切片生成过程相耦合1。在连续切片TEM中，依次将切片收集到载网槽上，从这些序列中获取TEM图像并进行对齐2,3,4,5。在TEM断层扫描中，通过对载网上150–300 nm厚的切片进行倾斜系列成像，若结合连续切片，则可获得极高分辨率，但成像体积相对较小6,7,8。AT方法采用物理切片，并以多种手动或半自动方式将切片收集在较大支撑物上，例如玻璃盖玻片、硅晶圆或特殊胶带。在图像采集时，将该支撑物置于扫描电镜（SEM）中进行分析，可采用多种不同的图像采集策略9,10,11,12,13,14,15。对于SBF-SEM，切片通过安装在SEM腔室内的一台微型切片机和金刚石刀完成，SEM图像则来自树脂块表面16,17,18,19。对于FIB-SEM，离子源逐层去除样品表面的薄层，随后由SEM自动对暴露出的新表面进行成像20,21。TEM断层扫描和AT方法产生的是物理切片，必要时可重新成像，而SBF-SEM和FIB-SEM在成像后即消除切片。最近出现的一种结合多束SEM对物理切片进行成像的新方法，融合了多种技术优势，解决了图像采集速度的"瓶颈"问题22。这些技术中的每一种都革新了电镜数据的获取与分析方式，且每种方法在应对特定科研问题时均具有实际应用价值。

由于制备的性质以及超微结构尺度的限制，很难预测特定目标结构在样品块中的确切位置（图1D、E）。为实现感兴趣区域（ROI）的定位，一种解决方案是从一开始就以所需分辨率记录整个样品块的图像。这样可以在离开显微镜后于所获取的数据体积中查找目标结构。然而，该策略涉及的采集时间和数据处理量较大，存在实际困难。尤其当ROI远小于组织块时（例如目标对象为特定类型的细胞而非整个器官），减少记录数据量尤为必要。当荧光信号在样品制备前后得以保留并精确定位时，不同的相关光镜与电镜技术（CLEM）可取得成功23，24，25，26，27，28，29。然而，许多细胞结构即使在无荧光标记的情况下，仅凭已知的超微结构特征也可被识别。对于此类情况，我们认为横向筛选阵列断层成像技术在ROI定位所需投入与超微结构信息质量之间提供了良好的平衡。采用该策略时，可在硅片上按一定间隔规律性地筛选部分切片，筛选间隔可根据ROI的大小和特性确定。一旦发现ROI，即可设置连续切片的数据采集流程，从锚定切片之前开始，至其后结束，从而有针对性地获取相关信息。

我们提出了一种简化并加速获取多个切片中感兴趣区域或事件的连续切片电子显微镜（AT）操作流程，可生成更精确对齐的三维图像数据集。通过横向筛选和多步采集策略，可在精确靶向的区域内获得极高分辨率的数据。本文所述方法解决了三维电子显微镜（3D EM）数据采集中的多项挑战，具体包括：适用于多种类型的样品，且无需从根本上改变样品制备流程；实现切片与扫描电镜（SEM）成像的靶向定位；减少设置过程中的时间和操作负担；在多个切片中对目标区域进行成像，并实现更优的图像数据集对齐；以及通过平滑的拼接与对齐流程，将不同图像整合为一幅完整的拼接图。我们选择来自已发表及正在进行的研究项目的多个样本，以展示本方法的优势。我们认为，该方法可显著促进靶向电子显微镜数据的生成与采集，即使对于电子显微镜经验有限的研究人员亦具有良好的适用性。

方案

注意：样品制备方法在其他文献中有详细描述14,30,31，本文未予涵盖。简而言之，所示样品先用戊二醛化学固定，再用1% OsO4进行后固定，然后在包埋于包埋树脂前用1%醋酸铀酰水溶液处理。或者，样品也可采用高压冷冻法固定，随后在丙酮中用0.1%醋酸铀酰进行冷冻置换，最后包埋于丙烯酸树脂中。样品块采用平面包埋法制备，该方法可清晰观察样品，便于切片时进行定位（图1B）。

1. 芯片生成流程

  1. 包埋样品的定位与修块
    1. 使用双目镜/显微镜，通过剃须刀片在包埋块表面轻轻划痕，识别并标记感兴趣区域（ROI）。这有助于在超薄切片机中对样品进行定向，并减少切片面积。
    2. 将样品固定在超薄切片机的样品夹上（图2A）。
    3. 用剃须刀片先对样品周围的树脂进行粗修，再使用金刚石修块刀进行精细修块（图2A）。使用刃角为20°或90°的刀具，以确保包埋块的顶面和底面与刀刃切割边缘平行。
      ​注意：此步骤对连续切片和获得平直的切片带至关重要。
    4. 按3:1比例混合二甲苯与胶水，用粘附在牙签上的睫毛将该混合物涂抹于修好的包埋块顶部和底部边缘。待其充分干燥。
  2. 准备阵列支撑材料A（即硅片）
    1. 使用硅片切割工具（EMS）切割硅片，并根据实验需求调整尺寸。2 cm × 4 cm 的尺寸适用于光学显微镜和电子显微镜观察。
    2. 用蒸馏水清洗硅片，去除碎屑。
    3. 使用标准设备进行辉光放电/等离子清洗。具体参数取决于所用仪器。可先采用载网放电的参数，并根据经验调整处理时间。此步骤对切片在支撑材料上干燥过程中的良好展开至关重要，不可省略。
  3. 准备阵列支撑材料B（即玻璃盖玻片）
    1. 若计划进行多重免疫标记实验，应将样品转移至盖玻片上，以便更好地检测荧光信号。为提高盖玻片的粘附性，可采用先前描述的明胶包被详细步骤9。
    2. 通过蒸发镀膜法在载玻片表面镀上氧化铟锡（ITO）或金，以提高导电性。将制备好的盖玻片保存在洁净环境中。按照步骤1.2.3所述进行辉光放电处理。

2. 样品切片

  1. AT刀具准备
    注意：为生成切片阵列，使用一种经过改造的刀具（ATS），该刀具设计用于便于获取长条状切片带。Histo-Jumbo刀具 或类似专为在大面积支撑材料上制备切片而设计的刀具，也可用于AT切片。
    1. 使用泡沫胶带将针固定在刀具底部并刺穿之（图2B）。将ATS刀具安装至超薄切片机的持刀架上，角度设为0°。按照标准操作程序，调整刀刃与样品块表面平行。
    2. 将修整好的样品块移至刀刃边缘，准备开始切片。
    3. 将晶圆/盖玻片放入刀槽内，并加水至与刀刃齐平。确保刀具的金刚石刃口充分润湿，必要时使用附带的注射器吸除多余水分（图2C）。
  2. 切片阵列的制备与转移
    1. 将切片机设置为所需的切片参数。使用ATS刀具时，建议切片厚度为50–100 nm，切片速度为0.6–1 mm/s。开始切片（图2Di）。
    2. 获取一段足够长度的切片带以覆盖目标z轴体积，随后停止收集。根据样品块大小、组织均一性及树脂类型，切片带可能相对平直（图2D-ii）。尽管已投入努力并使用特定刀具，许多样品仍无法产生完全平直的切片带。
    3. 根据最终目标，可制备一条长切片带或数条短切片带并排排列。一块2 cm × 4 cm的支撑材料可方便地承载100至1,000张切片。将切片带排列于支撑材料上的步骤需要技巧和稳定的手部操作，但该技能的学习曲线较短，易于掌握。
    4. 使用粘有洁净无粘性睫毛的牙签轻触刀刃，使切片带从刀刃上脱离（图2Diii）。
    5. 用睫毛轻轻将切片带移至支撑材料中心上方。此时如需展平切片，可使用氯仿或加热笔。但需注意，此类操作可能导致切片带断裂或变形。
    6. 通过拉动注射器开始排水。对于更脆弱的切片带或需要更缓慢排水的情况，可将注射器从软管上取下，让水自然滴落。当水位降至晶圆表面高度时，控制切片带位置，必要时轻轻推动使其居中。待切片带完全沉降于晶圆表面后，继续排水直至刀槽内残留水分完全排尽。
      注意：若未使用底部排水型ATS刀具，应小心从ATS刀具两侧缓慢减少水量，避免产生湍流。
    7. 将切片连同支撑材料留在水槽中，使其彻底干燥。根据支撑材料的疏水性及环境湿度水平，水分蒸发速率会有所不同（图2Div）。缓慢干燥样品至关重要，以减少或完全避免样品出现褶皱。
    8. 将干燥后的样品转移至密封盒中，防止灰尘污染，并置于60 °C烘箱中至少30分钟。如有需要，可使用重金属对切片进行复染，以增强整体对比度。
    9. 操作结束后，严格按照制造商说明小心清洁刀具。
      注意：将多个或连续切片转移至晶圆（图2E）与转移至网格载网（图2F）相比，会彻底改变透射电镜（EM）样品制备的体验。在单一支撑材料上连续切片并收集，可显著减少传统连续切片过程中常见的切片与收集错误。一张晶圆上收集的100张尺寸为1000 µm × 500 µm的切片，相当于33张网格载网的容量（图2G）。

3. 样品观察

注意：本节所述工作流程步骤使用一种市售软件实现（参见材料表）。虽然任何配备正确探测器的扫描电镜（SEM）上的图像采集软件均可使用，但具体用户操作会有所不同，且通常需要更多手动操作。

  1. 获取扫描电子显微镜（SEM）图像的概览图，以显示晶圆上各切片的位置。内置的光学相机图像有助于定义覆盖一排切片或所有切片的SEM图像拼接图。通过在样品的相机图像上使用鼠标右键点击并拖拽，创建拼接图，并启动自动采集。
    注意：使用非常粗糙的成像参数即可，例如1-2 µm的像素尺寸和1 µs的停留时间。该过程详见补充材料（第2-7页）。
  2. 使用切片查找自动检测功能或手动方式定位切片。该软件基于图像匹配自动获取切片的位置和轮廓。此过程的示例见补充材料（第8-15页）。
  3. 若概览图像未能清晰显示感兴趣区域（ROI），则对切片进行更高分辨率的成像。使用切片预览功能自动创建并采集图像。该过程详见补充材料第16-18页。成像参数的选择应根据用户所寻找的ROI的性质和大小而定。
    1. 为找到最佳参数，激活显微镜控制软件中的实时成像功能，并导航至一个ROI。调整成像参数，直至图像能清晰显示ROI，同时确保图像采集时间不过长。 
  4. 定义成像区域
    ​注意：提供多种不同策略。
    1. 若仅需对少数切片进行成像，可利用迄今已创建的切片图像导航至相关切片，并使用可缩放查看器（Zoomable Viewer），该查看器以原始相对位置显示所有已采集图像，以便查看所有切片。一旦发现需要高分辨率成像的切片，可通过点击并拖拽定义一个成像区域。选择高分辨率成像参数，并将这些参数保存为模板，以便后续切片重复使用。
    2. 为寻找特别微小或难以检测的稀有事件，可采用横向筛选方法。在每第十个切片或每条带中的一个切片上，手动创建具有高分辨率成像参数的成像区域并采集图像。检查图像，并在软件中标记包含ROI的切片，或做相应记录。
      1. 从包含ROI的切片出发，向前和向后浏览切片序列，并在结构仍可见的范围内，在相同相对位置创建高分辨率成像区域。此操作可手动完成，也可采用后续步骤中描述的程序。
    3. 对超过十个连续切片进行图像采集。按照操作手册所述，放大图像后点击开始位置优化，以提高已注册切片位置的精度。此操作可降低图像序列的位置变异性。该程序在补充材料第19-21页中有图示和说明。
    4. 在任意切片上按住Alt键并点击拖拽以定义成像区域，然后在释放鼠标按钮后弹出的上下文菜单中选择创建瓦片集阵列（Create Tile Set Array）。软件将在之前已发现或标记的所有切片的相同相对位置自动创建成像区域。可通过切片范围（Section Span）滑块限制成像的切片范围。
      注意：此程序可对任意数量的成像区域重复执行，从而允许在每个切片上记录多个小尺寸高分辨率图像，而非单个较大的图像。
    5. 创建后，根据需要为每个图像序列设置像素数量、像素尺寸、瓦片布局、像素停留时间等参数。图像序列创建并配置完成后，将全部列于任务队列中。
  5. 配置自动功能并启动图像采集
    1. 使用与前一步骤相同的方法，为自动功能创建独立的图像序列。将该图像序列移至切片上包含高对比度结构的位置。
    2. 将图像序列设置为1024 x 884像素，并选择与前一步骤中设定的图像序列所用最高分辨率相对应的像素尺寸。在自动功能列表中，勾选自动聚焦和自动消像散。
    3. 在采集序列控制中选择按切片（By Section），并确保自动功能图像位于列表首位。点击任务队列旁的运行按钮以启动图像采集。这些程序在补充材料第22-23页中有图示说明。
      ​注意：无需在每个切片上手动预先对焦。在记录过程中，每当显微镜前进至新切片时，系统将在该切片上所有其他图像采集前自动执行上述自动功能。

4. 数据比对与分析

  1. 数据导出
    1. 确保数据以 .tif 格式保存，因此无需专用导出功能。将数据按与图层树中的图层和元素直接对应的文件夹结构进行分类整理。
    2. 图像马赛克记录完成后，使用 StitchAll 功能自动拼接所有图块。
  2. Fiji 中的图像栈对齐与裁剪
    ​注意：许多软件包（免费和商业）可用于处理阵列断层成像数据。以下步骤使用开源程序 Fiji32 进行演示，因其广泛可用且包含所有必需功能。
    1. 将一组图像（或已拼接的图像）作为虚拟栈导入 Fiji。
    2. 若需标准化对比度/亮度，请从 Process 菜单中选择 Enhanced Contrast…。将 Saturated Pixels 设置为 0.1 或更低，并勾选 Process all Slices。
    3. 从 Plugins 菜单中选择 Registration | Linear Stack Alignment with SIFT。
    4. 在 Expected Transformation 下拉菜单中选择 Rigid 或 Affine 。其他参数保留默认设置。点击 OK 开始对齐。
      注意：将数据作为虚拟栈加载可使 Fiji 处理任意大小的图像栈。对齐结果将在内存中生成；然而，这可能会限制可处理栈的最大尺寸。在此情况下，请使用 Register Virtual Stack Slices，该工具是对相同配准算法的文件夹到文件夹实现方式。配准完成后，将输出数据作为虚拟栈加载。
    5. 点击 Crop 裁剪图像栈，使其仅包含感兴趣区域（ROI）。
    6. 将图像栈保存为单个 .tif 图像或一系列 .tif 图像。
      注意：阵列断层成像的关键步骤如 图 3 所示。

结果

以下示例旨在展示推荐工作流程的多功能性。这些案例研究是我们采用其他技术难以获得满意结果的项目。我们选择成年 Drosophila 来说明在处理多种类型样本时可能遇到的典型挑战。这种管状器官长约6 mm，横截面直径为500–1000 µm，分为多个具有独特功能和细胞组成的区域（图4A）33。根据切片方向的不同，肠道轮廓的尺寸及其在切片上的形态也会有所变化。无论是横切面还是纵切面，切片面积都相对较大，因此单个透射电镜（TEM）载网上只能放置少数几个切片（图2F）。在聚焦离子束（FIB）中只能对组织的一小部分进行成像，而对序列块面扫描电镜（SBF-SEM）而言，其困难程度与任何非均质样本类似。阵列断层成像（AT）为这类样本的分析提供了高效的折中方案，且平面包埋有助于目标区域（ROI）的定位。仔细修除所选区域周围多余的树脂（图4B）对于高效地从相关区域收集切片阵列至关重要（图4C）。数百个切片可按顺序或随机方式收集到单个硅片上（图4D）。根据具体的研究问题，样本筛选与数据采集需要采用不同的策略，我们将其任意划分为若干场景。为了更有针对性地说明所呈现的不同场景，我们从多个研究项目中选取了若干案例进行阐述。

分析大量随机分布的、尺寸在 1-10 µm 范围内的结构（图 4E）
通常需要超微结构数据来验证通过多种实验方法提出的假设，这些假设往往源于对标准条件与实验干预条件之间的比较。在此类情况下，通常会在载网上随机收集多个切片，并进行筛选，以定位和成像感兴趣的区域。该策略通常缺乏系统性，且仅限于分析少量切片。我们建议对特定切带上的数十至数百张中等分辨率切片进行概览成像（图 4D）。对于典型的 70 nm 厚切片，200 张切片的总厚度约为 14 µm，可包含大量完整或部分细胞，整个过程可在半小时内完成。首先，记录整条切带的低分辨率概览图像，以便排除存在制样伪影（如皱褶、污物）的切片区域。随后，可在选定区域的手动或自动模式下，对切片的局部或整体进行单幅成像或拼接成像（mosaic imaging），并进行图像拼接（图 4E）。之后，可针对选定区域采用高分辨率参数进行图像采集。例如，线粒体、细胞核和微绒毛等结构可显著受益于这种统计学上更优的方法（图 4Ei-iii）。

分析多个微小、稀疏分布的结构（500–1,000 nm 范围内）（补充视频 1）
在此情况下，无法仅通过低倍率的概览扫描简单确定感兴趣区域（ROI），而需要高分辨率图像。在传统的透射电子显微镜（TEM）样品中，必须反复进行放大与缩小操作，直至找到目标结构。通常，从多个样品中成像若干独立位置在统计学上比生成单个大体积数据更具意义。在这种情况下，手动采集的复杂性呈指数级增长。尽管已有多种TEM解决方案可实现自动采集或多网格筛选，但网格尺寸及连续切片的技术难题常常使这些方法难以适用于许多样品。针对类似情况，我们对多个切片中的整体感兴趣区域生成完整的中等分辨率图谱，其分辨率足以识别目标结构。在此横向筛选过程中，建议每次跳跃多个切片，以随机接近时至少能捕获目标结构的一部分。这在很大程度上取决于结构的整体尺寸：例如，若结构总大小为500 nm，切片厚度为50 nm，则连续九个切片很可能均包含该目标结构的某一部分。因此，跳跃6–7个切片将有助于在多个区域高效发现多种不同类型的结构。对选定切片自动采集高分辨率拼接图谱，可在采集后对其进行细致筛查。一旦获得此类高分辨率图谱，即可从中裁剪出多个感兴趣区域，或用于进一步定义局部成像区域（Supplementary Movie 1）。高尔基体、中心粒、连接结构、微管以及不同类型的囊泡，均是适用于此策略的典型结构示例（Supplementary Movie 1）。

在大样本中分析稀疏分布的大尺寸感兴趣区域（图4F-4H）
该情况涉及罕见事件，常被描述为“大海捞针”，其难点不在于感兴趣区域的识别，而在于其定位。对于许多样本而言，相关显微方法并非可行选择，但感兴趣区域通常具有特征性的超微结构，一旦定位成功，即可被高度可靠地识别。针对此类样本，必须采用多层级成像策略，首先对经过预筛选的样本进行中等分辨率成像，样本包含数十至数百个连续切片。在本研究所使用的软件中，获取多个切片图像集有两种不同策略：以更高分辨率记录预览图像，或使用适当参数获取阵列拼接图像集（图4F）。在Drosophila肠道中，不同类型的特化细胞（例如干细胞、肠内分泌细胞）呈随机分布，并以随机方向被切成薄片。然而，在使用高分辨率参数获取的单个切片图像或连续图像序列中进行筛查后，这些细胞仍可被直观区分（图4G）。完成图像对齐后，可利用多种软件工具对图像堆栈进行三维重建与渲染（图4H，补充视频2）。

情景1：肠道类器官（图5A）
类器官正迅速成为现代生命科学中最前沿的工具之一。这种接近生理状态的三维干细胞来源器官模型，使得对多种体内生物学过程进行精确研究成为可能，包括组织更新、药物反应以及再生医学。近年来新出现的微型肠道管状结构34推动了新一代类器官技术的发展，其在组织生理、细胞类型组成及稳态方面更接近体内真实情况，为疾病建模、宿主-微生物相互作用以及药物发现提供了广阔前景。然而，当需要进行超微结构表征时，通过随机取样来定位此类较大组织中不同类型的细胞仍具挑战性。此外，在可变的“感染”实验中，确保分析能够揭示影响组织的不同发育阶段至关重要。对于此类研究，实现样本的统计学显著覆盖极为关键，但采用传统的透射电镜（TEM）网格法难以达成。在此类情况下，AT-情景1具有显著优势：可在晶圆上生成大量连续切片（图5Aii），并使用低分辨率参数进行筛选，以定位感兴趣的总体区域（图5Aiii；箭头所示）。随后可针对这些区域，采用高级成像参数进行进一步分析（图5Aiv 和 图5Av）。当检测到相关结构时（通常每100–300个切片中会出现一次包含5–10个切片的结构簇），可集中对每个感兴趣结构进行手动单幅成像，或利用自动化功能在多个连续切片上获取图像序列。

情景2： 果蝇 蛹背板 (图5B)
研究细胞分裂以及调控细胞周期进程的机制，对于理解多细胞生物体中的正常与异常过程至关重要。现有信息大多来源于单细胞系统，然而这种方法缺乏组织内细胞间三维相互作用的关键背景。背板（notum）发育过程中形成的单层单细胞 果蝇 幼虫是研究上皮细胞相互作用，特别是细胞分裂的理想模型35它是一个成熟的模型，可用于结合荧光显微镜数据与遗传操作手段，研究分子与细胞间的相互作用。胞质分裂的最后阶段——膜离断（abscission），确保了两个分裂细胞之间的最终分离，明确膜离断过程中发生的结构变化对于理解有丝分裂至关重要。然而，在胸膜（notum）中，有丝分裂事件在超微结构水平上难以精确定位：与膜离断区域相比，细胞的尺寸相对较大，图5B). 脱落区总体尺寸与需覆盖的截面面积之比较大（图5生物）。尽管可以使用透射电子显微镜（TEM）或聚焦离子束扫描电子显微镜（SBF-SEM）方法来定位脱落区36，该任务十分耗时。在此情况下，可利用自动获取的中等分辨率概览图像，以20-40个切片为跳跃间隔，定位正在分裂的细胞图5Bii）。一旦发现此类细胞，这些切片即可作为锚定点，用于对邻近区域的切片进行更细致的观察，从而能够发现并选取大量分裂中的细胞进行进一步分析。通过这种方法，可完整定位并成像整个分裂区（图5Biii）。根据研究问题的不同，可采集单张高分辨率图像或3至7张图像序列，以覆盖结构的整个深度范围。图5Biv).

情景3：小鼠室管膜细胞神经元（图5C）
小鼠是研究脑发育的成熟模型，在多个层面上均有详尽记录，包括电镜（EM）层面。尽管已有多种自动连续块面成像方法被广泛用于脑组织研究，但在某些情况下，阵列层析成像（AT）更适用于获取所需数据。下丘脑是神经科学中经典的模型脑区，包含多种功能各异的神经元类型。下丘脑室管膜细胞（tanycytes）是一类特殊的室管膜胶质细胞，位于第三脑室底部，具有异常细长的突起（长达300 µm）和较大的终足（约5 µm）37。这些结构特征使得它们难以通过透射电镜（TEM）或聚焦离子束（FIB）方法进行有效分析。当需要定位并分析多个独立的室管膜细胞时，该任务进一步复杂化。一种有助于解决此问题的方法是半相关性靶向定位，即在样本固定和包埋用于电镜分析之前，先获取荧光标记样本的荧光图谱。切片区域的确定基于荧光样本的位置信息与平面包埋塑料块的对应位置相结合。随后，可采用阵列层析成像情景3方案：首先生成高倍全景马赛克图像，以识别含有室管膜细胞终足簇的区域；然后利用软件中的自动化功能，设置对单个图像内一个或多个区域进行图像序列的采集，支持单幅或拼接模式。所获得的图像可单独分析，也可作为配准后的图像堆栈进行对齐，或进一步三维重建。

AT 方法的优势在于能够相对轻松地将数据从二维升级至三维：三维图谱可直接从初始采集获得，而三维体积数据则可从选定区域及其周围区域获取。所得到的图像序列可进行对齐并进一步渲染。必须预先确定寻找感兴趣区域（ROIs）所需的分辨率和图像质量。成像应足以识别感兴趣区域，但不应超过此必要水平，因为采集时间与像素驻留时间成正比，且与像素尺寸的平方成反比。

显示不同分辨率和体积下进行三维细胞分割和体数据分析的示意图。
图 1：电镜样品制备与体积成像面临的挑战。 （A）由于样品制备过程中重金属浓度较高以及脱水作用，会导致荧光信号丢失和样品收缩。（i）在光学显微镜下观察到的样品示意图；（ii）同一样品经电镜制备后变得完全不透明，并损失约10%的体积。（B）样品包埋通常使用环氧树脂或丙烯酸树脂。（i）传统包埋块适用于无需特定取向的均质样品；（ii）扁平包埋块则在需要在显微镜下精确定位并定向特定切片区时非常有用，例如在非均质样品或相关显微技术流程中。（C）在整个样品体积中，单个50 nm厚的切片仅能呈现其中一小部分，提供的是三维样品的二维图像，且常常处于不熟悉的取向。（D）为了说明记录过大体积与精确靶向之间的矛盾，我们选取了三个边长分别为1000、500和50 µm的同心立方体，用于包含一个假想的1000 × 500 × 500 µm样品（深紫红色）。若将这些假想的样品立方体以50 nm切片进行完全切片，覆盖整个体积将分别需要20,000、10,000和1,000张切片，以及相应的800 TB、100 TB和100 GB数据量（成像分辨率为5 nm × 5 nm × 50 nm，8位数据）。这表明规划电镜数据采集时，仅获取必要最小体积的重要性。（E）以高分辨率覆盖大面积样品表面所面临的问题与大体积成像类似。将多个高分辨率图像拼接为一幅图像是解决该问题的有效方法。然而，使用10,000倍放大下的2024 × 1048像素帧来覆盖1 mm × 1 mm的表面，将需要大量图像拼接，可能难以完成。此外，如果切片在切割过程中发生不同程度的压缩或形变，最终的数据堆栈将几乎无法对齐。 请点击此处查看该图的放大版本。

薄层色谱过程；示意图；装置包括展开室、样品板和溶剂。
图2在大型载体上直接制备切片阵列的工作流程。 (A使用修块刀进行精细修块时，将样品块固定在切片机的样品夹中。此步骤有助于确保样品块的侧面相互平行，并减少样品周围多余的树脂。 (B一种用于获取AT切片的改良刀具。较大的样品槽有助于切片的转移及在样品切片和转移至载具过程中的操作。较大的容器便于对切片进行操作；排水系统可限制切片条带在排水过程中的移动，平坦的底部确保了载具逐步干燥的可靠性。C刀片已准备就绪，可用于切片，刀槽底部放置了经辉光放电处理的载片，水面已调节至与边缘齐平。刀片的结构设计使针头保持嵌入状态，且不会干扰支撑物。D) 芯片制备，微切片区域的俯视图。（i）最初的切片通常较易获得，因为它们彼此粘连并形成规则的切片带。（ii）当切片带中加入更多切片而变长时，切片带会失去稳定性并频繁弯曲。必须在图像采集步骤前保持切片序列的有序排列。（iii）当切片带达到所需长度时，使用一根睫毛小心地将其从刀刃上分离。（iv）将水槽中的水排干；晶圆保留在原位直至完全风干。此步骤至关重要，有助于展平切片并防止微小褶皱的形成。随后将晶圆放入烘箱中 60°C 至少30分钟，以使切片牢固附着于载片上。 (E) 转移切片后的示例晶圆。尽管获得平直且精确的切片条带较为方便，但在大多数情况下，实际样品会阻碍此类理想条带的形成。然而，即使“粗糙”的条带在绝大多数情况下仍具有重要信息价值，而“整齐”条带的重要性则取决于收集切片所对应的研究策略。比例尺 1 cm。F) 带有序列切片的载网槽位示例。即使在一个载网上收集了大量切片，其所占面积仍仅为单个晶圆可承载切片总量的极小部分。掌握将切片转移至载网（特别是槽载网）所需的技术，是电子显微镜样品制备技术掌握过程中的一个重要瓶颈。比例尺 500 µm. (G无论采用何种切片收集方法，与网格内收集相比，AT法的优势在于生成连续切片的相对简便性。如果 1000 µm x 500 µm 当考虑样本块时，一块2 cm × 4 cm的晶圆上可容纳约100个切片，不存在问题（i）。而相同尺寸的切片在载网槽上最多只能容纳每网格3个切片（ii）。我们提供了一张按比例绘制的图像，以展示覆盖相同数量切片所需的载网数量，更不用说在载网上收集连续切片的困难程度。比例尺 = 1 cm。 请点击此处以查看此图的放大版本。

显微成像流程示意图，包含步骤：切片定位、预览、精细调整、对齐、渲染。
图3：阵列断层成像工作流程的关键步骤。全自动获取高分辨率图像堆栈的工作流程示意图。所有准备步骤均已实现自动化（绿色齿轮符号），无需逐一切片进行手动操作。图像堆栈可在任何具备自动刚性或仿射对齐功能的图像分析软件中进行对齐。请点击此处查看该图的放大版本。

神经解剖学显微成像；透射电镜横切面及三维体积重建示意图
图4: 三种采集场景 果蝇 以成年肠道作为示范模型。 (A解剖示意图 果蝇 中肠，分为三个主要区域，以不同颜色标示：前部、中部和后部。B修整后的平整块，其中肠道已定位以进行横切。请注意，组织周围含有感兴趣区域（白色矩形）的空树脂量经过仔细平衡。C横切连续切片漂浮在AT刀槽内的水面上。所有图像均采用二次电子扫描电镜模式，通过镜像检测器以反差反转模式获取。D) 芯片上横断面连续切片的拼接镶嵌图像。比例尺为 1000 µm. (E横切面 果蝇 肠道。比例尺 20 µm图像为7 × 7幅中等放大倍数图像拼接而成的镶嵌图。插图为特定感兴趣区域的更高放大倍数和更高分辨率图像：(ii) 细胞核，(iii) 刷状缘，以及(i) 线粒体。比例尺 5 µm 为所有人。F) 肠道横切面的中倍图像，用于定位发育中的细胞（方框所示区域）。比例尺为 20 µm. (G) 根据F图中切片分析所定位的区域收集的目标连续切片阵列。比例尺为 10 µm. (H3D 模型是根据图 G 中目标序列采集获得的 50 个切片的堆叠序列重建而成。 请点击此处以查看此图的放大版本。

肠道类器官与果蝇 Notum 示意图；显微细胞结构分析
图5：AT应用场景的案例研究。 (A) 肠类器官中不同细胞结构的定位。(i) 嵌入式硅微芯片。比例尺 = 200 µm. (ii) 芯片中心区域127个横截面的拼接镶嵌图像。比例尺 = 1500 µm (iii) 肠类器官横断面完整区域的四幅低分辨率图像。箭头指向潜在的兴趣区域。比例尺为 20 µm. (iv) 针对选定用于进一步分析的低分辨率显微照片，设置不同的感兴趣区域（ROI）。比例尺 = 10 µm. (v) 目标感染细胞的高分辨率图像。如有需要，对相邻切片中相同区域的分析可提供靶向的三维信息。比例尺 = 5 µm. (B) 中体定位在 黑腹果蝇 蛹背片。(i) 解剖后的示意图 果蝇 蛹。去除保护性角质层（棕色）后，露出用于解剖的 nota 区域（米色）。黑线标示切面方向。（ii）图中所示区域的横截面。该图像由 3×7 张连续拍摄的高分辨率扫描电镜图像拼接而成一幅镶嵌图。黑色矩形框定包含分裂细胞的区域。比例尺为 15 µm. (iii) 来自 (ii) 面板中分裂细胞的放大图像。在此放大倍数和分辨率下，中间体清晰可见（白色箭头）。对整个切片区段进行分析以寻找分裂中的细胞。在横向筛选过程中，每隔 20-30 个切片区段跳跃式检查不同的切片带，有助于定位大量分裂细胞对。比例尺为 5 µm （iv）当定位到一个正在分裂的细胞时，从图（iii）中黄色方框划定的中体周围四个区域连续采集中体的图像。比例尺为 1 µm. (C) 小鼠下丘脑中伸展细胞终足的定位。（i）振动切片的荧光图像。伸展细胞表达tdTomato荧光蛋白（红色）。白色矩形框标示感兴趣区域。比例尺 500 µm(ii) 根据图（i）中荧光信息的间接关联，将对同一振动切片样本中感兴趣区域周围进行精细修块。白色虚线表示超薄切片区域。比例尺为 50 µm 两个图均适用。(iii) 感兴趣区域中振动切片的横截面。扫描电镜（SEM）马赛克图像由75张拼接图像组成。通过侧向筛选定位多个切片，并以相似参数成像。切片在“离线”状态下进行分析，以确定感兴趣区域（ROI）——终足细胞末端。黑色矩形框表示包含终足细胞末端的区域。该切片将作为后续分析的锚定点。比例尺为 15 µm（iv）包围血管的伸展细胞终足的高分辨率、高倍镜图像。在某一节段上初步定位感兴趣区域（ROI）后，从锚定节段上游的相邻节段采集z序列图像（图iii）。比例尺 5 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

生物切片的电子显微镜观察；树脂剥离，超微结构，细胞细节，高亮插图
图6超微切片、切片收集及切片保存过程中可能出现的问题会导致伪影。 (A晶片上的脑组织切片。大部分空树脂从组织上脱落并自行折叠（深褐色）。黑色虚线框标示用于容纳整个切片的区域。比例尺 500 µm. (B) A 斑马鱼50纳米厚切片表面的小型局部折叠。比例尺 1 µm. (C70 nm小鼠脑切片表面的刀痕。比例尺 5 µm. (D晶圆表面部分覆盖斑马鱼肌肉切片的毛刺（星号）。黄色区域为分析靶区。粉色标记的细胞用于作为受影响区域大小的参照。比例尺 50 µm. (E右下角出现褶皱的斑马鱼脊索（黑色箭头），致密的神经组织（蓝色阴影）与较柔软的肌肉组织及空树脂相邻（黑色箭头）。比例尺 10 µm. (F50张图像堆栈的体积分割，如E所示，显示该区域在大多数切片中均出现皱褶。虚线多边形框出G中所示区域。比例尺 10 µm. (G) 与 F 中相同的体积分割的 XY 视图，显示皱褶为方块右半部分的短黑色条纹。注意，堆栈在组织其余部分中的排列不受皱褶影响。比例尺 5 µm. (H与G中相同区域的XZ投影，显示所有50个切片中的皱褶。比例尺 5 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

补充视频1：横切面高分辨率拼接图像 果蝇 前中肠 倒置的SE-MD扫描电镜图像的拼接图。在5 nm分辨率下自动获取了352个独立的图像图块，并将其拼接以呈现完整的横截面。使用同一图像可放大查看更多细节，从而对数据实现全面覆盖。放大后可观察到紧密连接、微管以及不同类型的囊泡。比例尺为 10 µm. 请点击此处下载此视频。

补充视频 2：果蝇肠道细胞三维重建。肠上皮分裂区域的 50 张连续切片镶嵌图像。IMOD 重建显示细胞边界（蓝色、青色和橙色）和细胞核（白色）。请点击此处下载该视频。

补充材料。 请点击此处下载该文件。

讨论

电子显微镜可揭示细胞和生物体的超微结构，通常需要在三维环境中对目标结构进行成像以获得更深入的认识。尽管已有多种用于超微结构分析的电子显微镜技术，但仍缺乏一种 "金标准" 溶液。主要原因是样本种类繁多，生物学问题多样，通常需要定制化的处理方法。所提出的AT工作流程旨在最大限度地减少样本处理、数据采集、分析和存储所需的时间。此外，改进的刀具为简化阵列采集提供了有力工具。切片在晶圆上的紧凑排布方式，既便于观察，也便于后续样本的保存。这种布局方式使得 "侧向筛选" 通过在不同条带间水平移动并仅扫描每条带的一个切片，显著缩短了定位感兴趣区域（ROI）所需的时间。所提出的数据采集方案有助于靶向定位小而随机分布的区域。一旦发现目标区域，AT/SEM 即可将高分辨率成像精确限制在感兴趣的体积范围内，无论该过程是手动操作还是借助自动功能完成。对于有限体积的AT，可由操作者手动完成，通过导航样品并逐个定义成像区域。软件的自动化模块为在大切片上成像小区域提供了灵活的图像采集策略。该软件的自动化功能支持在数百个切片上记录大尺寸高分辨率图像，实现与SBFI相当的成像体积。对所有切片记录概览图像可简化ROI的定位，并减少显微镜操作时间。由于在获取概览图像及较高分辨率预览图像的过程中不会损伤切片，AT/SEM 允许重复使用样品以收集其他ROI的数据或进行更高分辨率的成像。

图像采集时间是三维电子显微镜（3D EM）中最重要（也是成本最高）的因素之一，因此应在实验设计阶段予以充分考虑。尽管大范围成像所需时间长于小范围成像并不令人意外，但人们往往容易低估其影响：根据所选成像参数的不同，每张切片的采集时间可能从数秒到数小时不等。关键的成像参数包括视场大小、分辨率和像素停留时间。假设目标分辨率为每像素10 nm，像素停留时间为1 µs，则成像20 µm × 20 µm、100 µm × 100 µm 或 500 µm × 500 µm 的视场分别需要4秒、100秒或2,500秒。可通过将每张切片的成像时间乘以切片总数，来估算完成整个成像任务所需的总时间。如果切片数量较少，或不考虑显微镜使用成本，则较长的单张切片成像时间是可以接受的。

然而，在大多数情况下，有必要将记录时间限制在过夜或周末完成的任务范围内。另一个同样关键的3D电镜（3D EM）问题，是所产生图像数据的数量和结构。对上述成像区域在100个切片中进行记录，将分别生成400 MB、10 GB或250 GB的图像数据；而500 µm × 500 µm的图像还存在单个文件超过2 GB的问题。许多用于数据处理的软件程序无法打开如此大尺寸的图像。

为了缩短成像时间，选择合适的像素驻留时间以满足后续数据评估（如重建、追踪）所需的信噪比，并将记录范围限制在定义的感兴趣区域（ROI），这一点至关重要。该软件的AT扩展功能支持在连续切片的小区域内进行图像采集。软件支持手动和自动工作流程，以及多种半自动模式：用户可手动在每张切片上定位和聚焦成像区域，也可使用自动切片查找和位置对齐功能。根据所选的自动化程度以及样本类型或成像目标的支持情况，在数百张切片中设置图像采集所需的时间可能长达一整天（手动操作）或仅需几分钟。原则上，与其他三维电子显微镜方法相比，阵列断层成像（Array Tomography）在获取小ROI图像时更具挑战性；连续切片上ROI定位不精确的问题必须通过采集更大的区域来补偿。例如，若ROI大小为20 µm × 20 µm，而相邻切片间成像区域的位置偏差为10 µm，则需要采集40 µm × 40 µm的图像，才能确保每个切片上的ROI在每幅图像中都被完整捕获。实际成像位置的偏差范围从100 µm到<10 µm不等，具体取决于位置对齐软件功能的可用性或质量，以及操作者的耐心程度。使用该软件，在大多数样本中无需过多手动干预即可实现10 µm的定位精度。

与其他技术一样，AT 技术存在若干可能影响成功数据采集的薄弱环节，其中许多问题与其他基于切片的方法相似。树脂与组织分布不均可能导致切片条带弯曲或断裂。在极端情况下，切片可能从支撑膜上脱落（图6A）。切割过程中出现的压缩或拉伸不均可能导致折叠，进而在后续切片的不同区域破坏样本（图6B）。使用受损刀具时，收集的切片表面可能出现刀痕（图6C）。切片条件的差异可能引起偶尔的切片压缩以及厚度不一致。灰尘或杂质颗粒可能落在切片上，部分遮挡感兴趣区域（图6D）。图像采集可能因自动对比度、自动聚焦和自动消像散功能不完善而失败。自动创建的成像区域位置可能存在变异，可能无法在所有切片中完整捕获感兴趣区域（ROI）。

在拼接与对齐阶段可能会出现若干问题。自动拼接马赛克图块时可能失败，例如由于样品内部存在较大的空白区域。由于三维形态发生剧烈变化，图像堆栈的配准可能具有挑战性。专门开发的程序（如 IMOD、Fiji、TrackEM2、MIB 或 MAPS-AT）可辅助实现半自动对齐32,38,39,40。更具挑战性的部分可通过图像编辑软件进行手动对齐。遗憾的是，某些数据集可能无法实现正确对齐。

大样本在透射电镜连续切片中难以适配载网；另一方面，许多项目并不需要使用聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）或超薄切片扫描电镜（SBF-SEM）进行长时间的自动采集。阵列切片技术（AT）为繁琐的连续切片透射电镜提供了一种简便的替代方案，其在晶圆上收集和操作连续切片的过程比使用槽形载网更为简便。已有多种策略被开发用于促进切片阵列的收集，我们在此分享我们的方法，以扩展现有的技术工具集。在难以识别感兴趣区域（ROI）的情况下，AT-SEM具有显著优势，可高效地对样本进行筛选，实现跨50至500个切片、细胞器尺度分辨率的成像。对于更大的体积，若需要更多切片，也可高效地采用自动收集的AT策略。AT样本可多次重复成像，便于基于先前获取的概览图像对高分辨率区域进行靶向成像。我们认为，本文提出的AT/SEM靶向分析和减少过度采样的方法可降低工作量和数据存储需求。最终，切片文库可被收集并保存，供后续重复使用和查阅。对于体积成像，当感兴趣区域易于在块面识别或需要大体积三维数据进行分析时，FIB或SBF-SEM方法提供了极佳的解决方案。然而，当需要以靶向方式从特定感兴趣区域获取高分辨率图像堆栈时，FIB/SBF-SEM的效率较低。综上所述，本文提出的AT样本筛选方法及中等分辨率概览图像的使用，可将图像采集限制在切片阵列的相关区域，精确瞄准成像区域可加快数据获取速度并简化数据评估过程。

总之，尽管聚焦离子束-扫描电子显微镜（AT/SEM）的概念并非新颖，但其应用范围尚未达到其优势所应具备的普及程度。总体而言，该技术为其他现有的电镜方法提供了一种互补的手段。AT/SEM 与最广泛的样品制备方案和成像工作流程兼容，可在任何聚焦离子束/扫描电镜（FIB/SEM）或块面扫描电镜（SBF-SEM）设备上作为辅助技术实施。本文重点探讨了AT技术在获取那些难以通过其他方法成功处理的样品的超微结构数据方面的应用。我们希望，文中所述的便捷切片收集方法以及高度自动化的图像采集策略，能够帮助初次接触该技术的研究人员顺利开展工作，同时也有助于已有一定经验的使用者进一步优化该技术。

披露

作者 Tilman Franke 是生产电子显微镜及本文所用试点项目的 Thermo Fisher 的员工。

致谢

我们感谢洛桑大学电子显微镜平台的成员在AT技术不同步骤开发过程中提供的支持。感谢Gareth Griffiths、Marta Rodrigues、Urska Repnik、Christel Genoud、Helmut Gnaegi、Einat Zelinger、Paola Moreno-Roman、Lucy O'Brien和Lindsay Lewellyn在稿件撰写过程中参与讨论并提出宝贵的修改意见。我们谨向为本研究提供样本以展示不同应用场景的课题组表示感谢：Matthias Lutolf、Michail Nikolaev、Devanjali Dutta、Till Matzat和Fanny Langlet团队。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
切片
AT切片刀DiatomeDUATS3530Diatome Jumbo刀片
用于修整 90 的金刚石刀°DiatomeDTB90Diatome修块20°
玻璃刀
Pattex 接触胶水PattexPCL3C
硅片Ted Pella16015电阻：1–30 欧姆
P型：（硼）（1个主定位面）
粗糙度：2 nm
无 SiO₂ 表面涂层
TTV：= &小于20 µm
晶圆一侧经过抛光
超薄切片机Leica UC6替代方案：Leica UC7
晶圆切割工具包电子显微术7642EMF，小型样本切割器，货号 7652
图像采集
场发射扫描电子显微镜Thermo Fischer Helios1072419替代方案：Zeiss、Jeol、Hitachi、TESCAN
用于扫描电镜的 Correlative Workflow Maps 3 &与阵列断层成像赛默飞世尔科技1135932Maps 可实现 SEM 成像工作流程的自动化，并支持导入第三方数据用于 CLEM 及导航。
图像分析
Amira x.y赛默飞世尔科技1131599Amira 是一款用于 Array Tomography 数据重建的三维数据可视化与分析软件，具备多种实用功能。
图像处理开源Fiji（http://fiji.sc/#download）IMOD，MIB（参考正文中的文献）

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