本文提供了一种基于CRISPR/Cas9的原代人B细胞基因组编辑的详细分步实验方案，用于基因敲除（KO）和敲入（KI），以研究基因在B细胞中的生物学功能以及B细胞治疗药物的开发。
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本文内容
摘要
摘要
B细胞是由造血干细胞衍生而来的淋巴细胞，是适应性免疫系统体液免疫分支的关键组成部分。由于B细胞易于从外周血中分离、可在体外扩增，并且在体内具有较长的存续时间，因此成为细胞治疗的理想候选细胞。此外，B细胞正常的生物学功能——大量产生抗体——可被利用来高效表达大量治疗性蛋白，例如用于抗感染的重组抗体，或用于治疗酶缺陷病的酶。本文提供了从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离原代人B细胞以及在体外激活和扩增分离B细胞的详细方法。随后，我们展示了利用CRISPR/Cas9系统在B细胞中实现内源基因位点特异性敲除（KO）的操作步骤。该方法可高效敲除多种基因，可用于研究目的基因的生物学功能。接着，我们演示了将CRISPR/Cas9系统与重组腺相关病毒（rAAV）载体联合使用，以实现外源基因表达盒在B细胞中高效、位点特异性整合的操作流程。综上所述，本实验方案提供了一个逐步操作的工程化平台，可用于原代人B细胞中基因生物学功能的研究，以及B细胞治疗药物的开发。
引言
B细胞是一类来源于造血干细胞的淋巴细胞亚群。它们通过在免疫应答中产生大量抗体，在适应性体液免疫系统中发挥关键作用1。B细胞同时也是记忆B细胞和终末分化的长寿浆细胞的前体，从而提供持久的体液免疫2。特别是浆细胞，在免疫细胞中具有独特性，能够持续产生大量特异性抗体，并存活数年甚至数十年3。此外，由于B细胞系易于从外周血中分离，因此成为新型细胞治疗的理想候选者4。
此前，已有研究采用随机整合方法（例如使用慢病毒载体或Sleeping Beauty转座子）对B细胞进行基因工程改造，以实现外源基因的递送与表达5,6,7,8。然而，这些方法具有非特异性的特点，难以在B细胞中研究特定基因的生物学功能，并且在治疗应用中存在插入突变的固有风险，以及外源基因表达水平不一或发生沉默等问题。
CRISPR/Cas9 系统是一种强大的基因组编辑工具，可使研究人员精确地编辑多种物种中各类细胞的基因组。最近，包括我们实验室在内的两个研究团队已成功开发出在体外扩增并靶向编辑原代人B细胞基因组的方法9,10。本文将介绍从白细胞分离样本中纯化原代人B细胞的流程。随后，我们将描述我们更新后的B细胞扩增及分离B细胞活化方案。接下来，我们将介绍通过电穿孔将CRISPR/Cas9 mRNA与CD19单导向RNA（sgRNA）共同导入活化的B细胞，以敲除分化簇19（CD19）——一种特异性B细胞受体及B细胞标志性分子——的实验步骤。
Cas9 mRNA 被翻译后与 CD19 sgRNA 结合，形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物（RNP）。随后，该复合物中的 sgRNA 引导 Cas9 在基因第2个外显子的目标序列上产生双链断裂（DSB）。细胞将通过“非同源末端连接”方式修复该 DSB，插入或删除核苷酸，从而导致移码突变，使基因被敲除。随后，我们将通过流式细胞术检测 CD19 的表达缺失，并通过分解追踪插入缺失（TIDE）分析来评估插入缺失（indel）的形成情况。
接下来，我们将描述使用CRISPR/Cas9系统联合重组AAV6载体（rAAV6，作为同源定向修复（HDR）的供体模板）在腺相关病毒整合位点1（AAVS1）基因处介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的位点特异性插入。AAVS1基因是人类基因组中一个具有活性但无已知生物学功能的基因座，同时也是腺相关病毒的天然整合位点，因此被视为基因组编辑的“安全港”。本文报道，B细胞的扩增与活化可在7天培养期内实现最高达44倍的扩增（图1）。电穿孔处理后的B细胞在转染后24小时表现出整体细胞活力的轻微下降（图2A）。对CD19标志物的散点图分析显示，在基因编辑后的细胞中，CD19表达最高降低了83%（图2B和图2C）。
对色谱图的TIDE分析（图3A）显示，插入缺失（% indels）比例与流式细胞术检测的蛋白表达缺失比例（% protein loss）相似（图3B）。对敲入（KI）实验的流式细胞术分析表明，接受AAV载体（图4）与RNP共同转导的细胞中，EGFP阳性细胞比例最高达64%（图5A），后续通过连接片段聚合酶链式反应（junction PCR）证实了成功整合（图5B）。细胞计数结果显示，所有样本在基因编辑后3天内迅速恢复（图5C）。
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方案
健康供者的白细胞单采样本取自当地血库。本研究所描述的所有实验均经明尼苏达大学机构审查委员会（IRB）判定为豁免研究，并经机构生物安全委员会（IBC）批准。
注意：所有实验均按照血液传播病原体的通用预防措施进行，采用无菌/无菌技术以及适当的生物安全二级设备。
1. 准备用于B细胞扩增培养基的补充剂
- 将CpG寡核苷酸重悬至浓度为1 mg/mL。
- 将CD40配体（CD40L）重悬至浓度为100 μg/mL。
- 将重组人IL-10（rhIL-10）重悬至浓度为50 μg/mL。
- 将重组人IL-15（rhIL-15）重悬至浓度为10 μg/mL。
注意：每种添加剂应分装成小份，于-20 °C至-80 °C保存，可保存长达6个月。
2. 准备基础培养基
- 将B细胞基础培养基与5%（v/v）的体外免疫细胞扩增培养基添加剂（例如CTS Immune Cell SR）以及1%（v/v）的青霉素和链霉素混合。
- 使用0.22 µm滤器接头将基础培养基过滤除菌至无菌瓶中。
- 将基础培养基在4 °C保存，最长可保存1个月。
3. 准备B细胞扩增培养基
- 将所需量的基础培养基转移至无菌容器中，用于以 5 × 105 个细胞/mL 的密度培养 B 细胞。
- 在基础培养基中添加 1 μg/mL CpG、100 ng/mL CD40L、50 ng/mL rhIL-10 和 10 ng/mL rhIL-15。
- 使用 0.22 µm 滤器过滤 B 细胞扩增培养基。
- 将 B 细胞扩增培养基置于组织培养孵箱中，在 37 °C、5% CO2 及湿度条件下平衡至少 30 分钟后使用。
注意：B 细胞扩增培养基需现配现用，仅限当日使用。不可配制后用于多日。该培养基配方可促进记忆 B 细胞及活化的人原代 B 细胞的增殖。
4. 人B细胞的纯化与扩增
注意：根据制造商的说明，将99–100%的异丙醇加入温度可控的冷冻容器中，并在开始步骤4.1之前将冷冻容器预冷至4 °C。
- 从白细胞单采术样本中分离外周血单个核细胞
- 将一份白细胞单采术样本（约8–10 mL）转移至无菌的50 mL锥形管中。
- 用无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）定容至35 mL。
- 将35 mL的白细胞分离样本小心地叠加在15 mL密度梯度介质上。
- 500 × g 离心 g 25分钟内不刹车离心，小心移除血浆层，避免扰动白膜层（PBMC层），从界面处收集PBMCs，并转移至新的无菌50 mL离心管中。
- 用1×PBS将PBMCs调整至50 mL。
- 500 × g 离心 g 5 分钟，无需刹车。移除上清液时注意不要扰动 PBMC 沉淀，该沉淀可能呈红色。
- 加入7 mL氯化铵-氯化钾裂解缓冲液，用移液器轻轻吹打混匀3次，室温孵育3分钟。
- 用1×PBS定容至50 mL。
- 400 × g 离心 g 用低阻力刹车离心5分钟。弃去上清液，注意不要扰动沉淀。沉淀物应呈粉红色或白色。
注意：为了持续培养新分离的B细胞，在开始B细胞分离之前（步骤4.2），请预先准备好B细胞扩增培养基。
- 使用人原代B细胞阴性分离试剂盒从外周血单个核细胞中分离B细胞
- 用分离缓冲液重悬PBMCs，使其浓度为5 × 107 cells/mL
注意：如果PBMCs总数少于5 × 107 细胞，缩小分离缓冲液体积以维持 5 × 107 细胞/mL。细胞悬液的最小和最大体积分别为0.25 mL和8 mL。 - 转移最多 8 mL（5 × 107 细胞/mL）加入无菌聚丙烯圆底带盖离心管中。
- 向 PBMCs 中加入 50 μL/mL 的 Cocktail Enhancer。
- 向PBMCs中加入50 μL/mL分离混合液，盖紧管盖，倒置混匀2–3次。
- 室温孵育 5 分钟；在第 4 分钟时th 孵育1分钟后，涡旋振荡磁珠至少30秒。
- 每1 mL PBMCs中加入50 μL磁性微珠，盖紧管盖，倒置混匀2–3次。
- 用分离缓冲液定容至10 mL，轻轻吹打混匀2–3次。
- 将试管置于磁力架上，室温孵育3分钟。
- 将磁铁和离心管一同握住，一次性同时翻转磁铁和离心管，将细胞悬液倒入新管中。弃去旧管。
- 重复步骤4.2.8（将孵育时间缩短至2分钟），并将B细胞悬液倒入洁净的锥形管中。
- 富集的B细胞已准备好使用。若需立即使用细胞，请继续进行第4.3节（人B细胞扩增）。可通过流式细胞术检测分离B细胞的纯度（可选步骤）。若需在使用前冻存细胞，请继续进行步骤4.2.12。
- 为冻存B细胞，于400 × g离心 g 5 分钟后，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。
- 用冻存液重悬细胞，密度为 107 细胞/mL，每支冻存管分装1 mL。
- 将冻存管放入预冷的冻存盒中，于 -80 °C 保存过夜；随后将冻存管转移至液氮罐中；冻存细胞可保存长达1年。
注：分离获得的B细胞预期产量为总PBMC的2%–8%，细胞活力为95%–99%。
- 用分离缓冲液重悬PBMCs，使其浓度为5 × 107 cells/mL
- 人B细胞扩增
注意：若使用 freshly isolated 的 B 细胞，可跳过步骤 4.3.1–4.3.5。计数细胞后，将所需数量的细胞转移至无菌锥形管中，随后继续进行步骤 4.3.6。- 预先将胎牛血清（FBS）在水浴中预热，然后再解冻B细胞。准备20 mL B细胞扩增培养基，转移至T25培养瓶中，并在组织培养孵箱（37 °C，5% CO₂）中预平衡培养基。2，使用前至少在湿度条件下平衡15分钟。
- 将B细胞置于37 °C水浴中解冻。等待期间，将2 mL预热的FBS转移至无菌的15 mL锥形管中。
- B细胞完全解冻后，立即将1 mL预热的胎牛血清逐滴加入样品中，室温孵育1分钟。
- 轻轻吹打以重悬样品，并将全部体积逐滴转移至含有2 mL预热胎牛血清（FBS）的锥形管中。
- 用无菌1×PBS将体积调至15 mL，盖紧管盖，轻轻倒置试管2–3次。
- 400 × g 离心 g 5 分钟。
- 弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀，用1 mL预平衡的B细胞扩增培养基重悬细胞沉淀，并进行细胞计数。总细胞数应约为107 细胞
- 将细胞转移至含有20 mL预平衡B细胞扩增培养基的培养瓶中。细胞的终浓度应约为5 x 105 cells/mL
- 将培养瓶垂直放入组织培养箱中孵育。
- 每2天完全更换一次扩增培养基，将B细胞的全部培养液体转移至无菌锥形管中，并重复步骤4.3.6–4.3.9。
注意：T25 培养瓶可容纳 10–20 mL 培养基；T75 培养瓶可容纳 20–60 mL 培养基。
5. 原代人B细胞的基因工程操作
- 在扩增/活化后 48 ± 2 小时对 B 细胞进行基因编辑，以获得最佳效果。准备 B 细胞扩增培养基，将 1 mL 培养基分装至 48 孔组织培养板中，并在使用前于组织培养箱中预平衡至少 15 分钟。
注意：设计目标基因的 CRISPR/Cas9 sgRNA 时，请遵循以下步骤。
- 使用在线工具设计 sgRNA11。
- 在编码所有蛋白异构体共有的外显子上设计 sgRNA。
- 从信誉良好的公司订购化学修饰的 sgRNA。
- sgRNA 通常以冻干形式提供；用无菌无 DNase/RNase 的 Tris-EDTA (TE) 缓冲液重悬 sgRNA，配制成 1 μg/μL 的浓度。 - 每转染反应中，将 1 μL（1 μg/μL）化学修饰的 sgRNA 与 1.5 μL（1 μg/μL）化学修饰的 Streptococcus pyogenes Cas9 (S.p. Cas9) 核酸酶混合，制备 CRISPR/Cas9 转染底物。作为对照，使用 1 μL TE 缓冲液代替 sgRNA。
注意：若在基因敲除实验中使用 CD19 sgRNA，请参见 图 2 的结果。若在基因敲入实验中使用 AAVS1 sgRNA，请参见 图 5 的结果。- 所有组分均需置于冰上。
- 轻轻混匀，并将每反应 2.5 μL 的 CRISPR/Cas9 转染底物转移至 0.2 mL 8 孔排管中的一个管内；置于室温备用。
- 开启核转染仪（电穿孔仪），并按 表 1 所示准备转染试剂。
注意：如有需要，可将所有试剂置于冰上暂停操作；恢复实验时再从冰上取出。当使用 S.p. Cas9 蛋白时，研究者必须在使用前将 1 μg sgRNA 与 5 μg S.p. Cas9 蛋白混合，预先形成 CRISPR/Cas9-sgRNA 核糖核蛋白复合物，避免产生气泡，并在室温孵育至少 20 分钟，以获得最佳效果。 - 计数后，将每转染反应 106 个 B 细胞转移至无菌锥形管中。
- 用无菌 1× PBS 将体积补至 15 mL，于 400 × g 离心 5 分钟。等待期间，准备原代细胞转染试剂（表 2），并置于室温备用。
- 弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
- 用 10 mL 无菌 1× PBS 重悬细胞沉淀，并于 400 × g 离心 5 分钟。
- 完全弃去上清液，注意不要扰动细胞沉淀。
- 每 106 个 B 细胞向细胞沉淀中加入 0.5 μg 化学修饰的 GFP mRNA（作为转染报告基因）（可选步骤）。
- 每 106 个 B 细胞用 20 μL 原代细胞转染试剂重悬细胞沉淀；通过移液枪轻柔吹打 5–6 次混匀。将每转染反应 20.5 μL 混合液转移至含有 2.5 μL CRISPR/Cas9 转染底物的 0.2 mL 8 孔排管管中。
- 上下吹打一次以混匀，并将全部体积（23 μL）转移至电穿孔杯中。盖上杯盖，轻敲电穿孔杯底部，确保液体均匀覆盖杯底。
- 在核转染仪上使用人原代 B 细胞程序进行转染。
注意：核转染仪（电穿孔仪）可置于组织培养超净台外使用。盖上电穿孔杯盖以确保无菌。 - 将电穿孔后的细胞在电穿孔杯中于室温静置 15 分钟。
- 从组织培养板中取出 80 μL 预平衡的 B 细胞扩增培养基，加入电穿孔杯中的转染反应体系。将电穿孔杯放入组织培养箱中孵育 30 分钟。
- 轻柔吹打数次混匀，然后将电穿孔杯中全部样品转移至含有 1 mL B 细胞扩增培养基的 48 孔组织培养板的相应孔中。最终细胞浓度应为 106 个细胞/mL。
- 若进行基因敲入实验，在电穿孔后约 45 分钟，向相应孔中加入感染复数为 500,000 的 rAAV6 载体。rAAV6 载体构建示例见 图 4A。
注意：例如：对照样本不使用 CRISPR/Cas9 或 rAAV6 载体进行电穿孔；仅载体对照样本使用 rAAV6 载体进行转导但不进行 CRISPR/Cas9 电穿孔；敲入样本则同时进行 CRISPR/Cas9 电穿孔和 rAAV6 转导。rAAV6 载体必须在目标双链断裂位点上下游包含同源臂，以支持同源定向修复（HDR）。 - 将培养板置于 37 °C、5% CO2 及湿度饱和的组织培养箱中培养。
- 在基因编辑后第 1 天计数细胞并记录细胞活力。
- 每 2 天更换一次 B 细胞扩增培养基：先计数细胞，然后将全部细胞转移至洁净的 1.5 mL 微量离心管中。于 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用 100 µL 新鲜 B 细胞扩增培养基重悬细胞，转移至 24 孔组织培养板的相应孔中，并补充培养基至最终细胞浓度为 5 × 105 个细胞/mL。
注意：48 孔板每孔最多可容纳 1 mL 培养基；24 孔板每孔最多可容纳 2 mL 培养基；12 孔板每孔最多可容纳 4 mL 培养基；6 孔板每孔最多可容纳 8 mL 培养基。 - 在进行流式细胞术分析、TIDE 分析和连接 PCR 等下游分析前，让基因编辑后的细胞至少扩增 5 天。
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结果
更新后的扩增与活化方案可在7天内实现B细胞最高达44倍的快速扩增（图1；n = 3 名供体）。在敲除实验中，通过台盼蓝染色检测B细胞数量，结果显示，在电穿孔后24小时，对照组和CD19基因敲除样本中存活细胞均超过80%，但细胞回收率略有下降图 2A；p ≥ 0.05，n = 3 名供体）。该结果表明电穿孔对B细胞整体健康状况影响较小。转染后第5天收集B细胞，用于流式细胞术和TIDE分析。对照组和基因敲除样本的代表性散点图分别显示14%和95%的CD19阴性细胞（图 2B). 流式图谱的定量分析显示，与对照组相比，基因敲除样本中CD19表达显著降低图2B；p ≤ 0.0001，n = 3 名供体）。基因组测序色谱图（引物序列见 表3)在CD19基因敲除的B细胞中显示出双峰，表明经CRISPR/Cas9介导的双链断裂后发生了核苷酸的插入/缺失，而对照组中仅观察到单峰，表明...
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讨论
直到最近，对原代人B细胞进行精确的基因组编辑仍然具有挑战性9,10。我们此前已发表过利用CRISPR/Cas9技术对原代人B细胞进行基因工程改造的实验方案9。本文中，我们概述了改进后的B细胞分离、扩增和基因工程操作流程，可实现CD19的高效敲除或EGFP基因的敲入。
在此，我们证明了本扩增方案可在体外实现B细胞的快速扩增，在7天内最高可达44倍的扩增效果（图1）。本方案的扩增速度优于Johnson等人9和Hung等人10所报道的结果。确保原代B细胞健康且快速扩增的关键步骤包括：每隔两天用新鲜的激活因子补充培养基，并确保培养物中总B细胞数量不超过2 × 106 个细胞/mL。
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披露
一项关于制造和使用基因组编辑B细胞的方法的专利已提交，发明人为 M.J.J、K.L. 和 B.S.M。B.S.M 担任 Immusoft 公司的顾问，并持有该公司股票。Immusoft 公司曾资助 B.S.M 实验室的研究工作。
致谢
本工作由儿童癌症研究基金（CCRF）和美国国立卫生研究院（NIH）R01 AI146009 项目资助，资助对象为 B.S.M.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Alt-R S.p. Cas9 核酸酶 V3 蛋白，500 μg | IDT | 1081059 | 也可提供较小尺寸 |
| Amaxa P3 原代细胞 4D-电转染 X 试剂盒 S（32 次反应） | Lonza | V4XP-3032 | |
| 氯化铵-氯化钾（ACK）裂解缓冲液 | 高质量生物学 | 118-156-101 | |
| CleanCap 化学修饰的 Cas9 mRNA | Trilink Biotechnology | L-7206-1000 | |
| CpG ODN 2006（ODN 7909）5 mg | Invivogen | TLRL-2006-5 | 提供多种规格 |
| Cryostor CS10，100 mL | STEMCELL 技术 | 7930 | |
| CTS免疫细胞SR | 赛默飞世尔科技 | A2596101 | |
| EasySep 人B细胞分离试剂盒 | STEMCELL 技术 | 17954 | |
| eBioscience 可固定活力染料 eFlour 780 | eBiosciences | 65-0865-14 | |
| 无异源B细胞快速增殖培养基 | R&D Systems | CCM031 | B细胞基础培养基 |
| Falcon 14 mL 聚丙烯圆底管 | 康宁 | 352059 | |
| 胎牛血清（FBS） | R&D Systems | S11550 | 仅用于B细胞解冻 |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-03 | |
| GeneMate SnapStrip® 8联排0.2 mL PCR管，带独立铰链盖 | BioExpress | T-3035-1 / 490003-692 | |
| Hyclone 0.0067M PBS（无 Ca，无 Mg）或 1x PBS | GE 医疗生命科学 | SH30256.01 | |
| Lonza 4D Nucleofector 核心装置 | Lonza | AAF-1002B | |
| Lonza 4D Nucleofector X 电转染仪 | Lonza | AAF-1002X | |
| Mega CD40配体 | Enzo Life Sciences | ALX-522-110-C010 | |
| 弗罗斯特先生 | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | 用于细胞冻存 |
| 青霉素/链霉素 100X | Sigma-Aldrich | TMS-AB2-C | |
| PerCP 抗人 CD19 克隆 HIB19 | biolegend | 302228 | 也可提供较小尺寸 |
| rAAV6 SA-GFP 包装（使用我们的 SA-GFP 表达盒，见图4） | 维真生物科学 | N/A | 大规模包装，1e13 GC/mL，500 mL |
| 重组人 IL-10 蛋白 250 ug | R&D Systems | 217-IL-250 | 提供多种规格 |
| 重组人 IL-15 蛋白 25 μg | R&D Systems | 247-ILB-025 | 提供多种规格 |
| The Big Easy EasySep 磁力架 | STEMCELL 技术 | 18001 | 提供多种规格 |
| Tris-EDTA（TE）缓冲液 | Fisher Scientific | BP2476100 |
参考文献
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