一种通过短暂双侧颈总动脉阻塞诱导的缺血性视网膜损伤小鼠模型

摘要

本文介绍了一种通过暂时性双侧颈总动脉结扎并结合夹闭法建立的小鼠视网膜缺血模型。该模型有助于理解由心血管异常引发的视网膜缺血的病理机制。

摘要

糖尿病性视网膜病变、视网膜动静脉阻塞以及眼缺血综合征等多种血管性疾病均可导致视网膜缺血。为研究视网膜缺血的病理机制，需要建立相应的实验模型。从解剖学角度看，主要的视网膜供血血管为眼动脉（OpA），而OpA起源于颈总动脉（CCA）的颈内动脉。因此，破坏CCA可有效引发视网膜缺血。本文通过短暂性双侧颈总动脉阻塞（tBCCAO）建立了一种小鼠视网膜缺血模型：用6-0丝线结扎右侧CCA，并使用夹子暂时阻塞左侧CCA 2秒，结果显示tBCCAO可诱导急性视网膜缺血，进而导致视网膜功能障碍。该方法仅需使用手术针和夹子，减少了对复杂手术器械的依赖；同时缩短了阻塞时间，以最大限度降低动物意外死亡率（这在大脑中动脉阻塞小鼠模型中较为常见），并保持了常见视网膜缺血表型的可重复性。该模型可用于研究小鼠缺血性视网膜病变的病理生理机制，并进一步用于体内药物筛选。

引言

视网膜是视觉功能的神经感觉组织。由于视觉功能需要大量氧气，视网膜被认为是体内耗氧量最高的组织之一¹。由于氧气通过血管输送，视网膜容易受到血管性疾病的影响。多种类型的血管疾病，如糖尿病性视网膜病变和视网膜血管（静脉或动脉）阻塞，均可诱发视网膜缺血。为了研究视网膜缺血的病理机制，建立可重复且具有临床相关性的实验性视网膜缺血模型被认为是必要的。通过插入血管内缝线阻塞大脑中动脉（MCAO）是目前最常用的建立体内啮齿类动物实验性脑缺血模型的方法^2,3。由于眼动脉（OpA）与大脑中动脉（MCA）位置邻近，MCAO模型也被同时用于研究视网膜缺血的病理生理机制^4,5,6。为了同时诱导脑缺血和视网膜缺血，通常需要通过颈总动脉（CCA）或颈外动脉（ECA）切口插入较长的缝线。这些方法操作困难，完成手术所需时间较长（每只小鼠超过60分钟），且术后结果变异度较高⁷。因此，开发一种更优的模型以解决上述问题仍具有重要意义。

在本研究中，我们仅使用短暂的双侧颈总动脉夹闭（tBCCAO）方法，通过针头和动脉夹诱导....

方案

本文所述所有方法均已获得庆应义塾大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 手术器械和动物的准备

1. 将手术器械进行高压灭菌，并保存在70%乙醇中。每次新的手术操作前，需使用70%乙醇仔细清洁手术器械。
2. 在特定病原体阴性（SPF）环境中准备雄性BALB/cAJc1小鼠（6周龄，26–28 g），以确保手术前后及手术过程中维持无菌条件。

2. 短暂性双侧颈总动脉阻断（tBCCAO）

1. 通过腹腔注射给予小鼠麻醉剂混合物（midazolam 40 μg/100 μL、medetomidine 7.5 μg/100 μL 和 butorphanol tartrate 50 μg/100 μL），该混合物称为“MMB”，具体方法如前所述^8,9。用手固定小鼠背部皮肤，防止其在完全麻醉前因活动而碰撞眼睛。
   1. 通过轻捏小鼠脚趾判断麻醉深度，直至小鼠无反应，此方法常用于评估是否达到完全麻醉状态¹⁰。
      注意：通常小鼠在5分钟内即可入睡。不同机构可能采用不同的全身麻醉配方。
2. 向眼睛滴加一滴0.1%的纯....

结果

在 FITC-葡聚糖全身循环 2 分钟后，检测了假手术小鼠和 tBCCAO 手术小鼠左眼和右眼视网膜的血管情况（补充图 1）。在假手术小鼠的双侧视网膜以及 tBCCAO 手术小鼠的左眼视网膜中，FITC-葡聚糖清晰可见；而在 tBCCAO 手术小鼠的右眼视网膜中仅能部分检测到 FITC-葡聚糖。

tBCCAO术后，检测了眼睑下垂情况（图2）。右眼出现轻度（评分2分；75%）和重度眼睑下垂（评分3分和4分；25%），而左眼均无下垂现象（评分1分；93.75%），仅有一只小鼠出现轻度下垂（评分2分；6.25%）。尽管在tBCCAO手术小鼠中未明显观察到伴有眼部分泌物的严重眼睑下垂，但仍有一只小鼠表现出该表型（评分4分；6.25%）。

组织中氧含量降低会导致HIF-1α的稳定以及一系列缺氧反应基因（如EPO、VEGF和BNIP3）的诱导表达¹⁹

讨论

在本研究中，我们已证明使用简单的缝线和夹子进行tBCCAO可诱导视网膜缺血及伴随的视网膜功能障碍。此外，我们表明，与先前报道的视网膜缺血损伤模型构建方案相比，当前建立小鼠视网膜缺血模型的方案更为简便快捷^2,3,7。

从解剖学上讲，左右大脑动脉可通过后交通动脉（PCAs）相互连接，后者在威尔里斯环（circle of Willis）中提供侧支循环，以在单根血管发生闭塞或狭窄导致血流中断时，维持中枢神经系统的充分血液供应^24,25（图1）。Lee 等人证明，在 C57BL6 小鼠中，通过永久性单侧颈总动脉结扎（CCAO）可使视网膜血流灌注延迟约10分钟（并非同侧视网膜血流灌注完全阻断）^13<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸阿替美唑	Zenoaq	Antisedan	用于拮抗麻醉
Applied Biosystems 7500 Fast	Applied Biosystems	-	用于qPCR
酒石酸布托啡诺	Meiji Seika Pharma	Vetorphale	用于麻醉
BZ-II分析仪	KEYENCE	-	用于图像合并
BALB/cAJc1	CLEA	-	小鼠品系
β-肌动蛋白（8H10D10）小鼠单克隆抗体	CST	3700	用于Western印迹
持针钳	World Precision Instruments	WPI 500451	用于手术
Dumont #5镊子	Fine Science Tools	11251-10	用于手术
DAPI溶液	Dojindo	340-07971	用于免疫组化
Envisu SD-OCT系统	Leica	R4310	用于OCT检测
异硫氰酸荧光素-葡聚糖	Merk	FD2000S	用于视网膜血流灌注
荧光显微镜	KEYENCE	BZ-9000	用于荧光检测
加替沙星水合物	Senju Pharmaceutical	Gachifuro	用于抗细菌感染
GFAP单克隆抗体（2.2B10）	Thermo	13-0300	用于免疫组化
加热垫	Marukan	RH-200	用于手术
HIF-1α（D1S7W）XP兔单克隆抗体	CST	36169	用于Western印迹
ImageQuant LAS 4000 mini	GE Healthcare	-	用于化学发光检测
咪达唑仑	Sandoz K.K	SANDOZ	用于麻醉
切片机 Tissue-Tek TEC 6	Sakura	-	用于组织切片
美托咪啶	Orion Corporation	Domitor	用于麻醉
持针器	Handaya	HS-2307	用于手术
PuREC	MAYO Corporation	-	用于视网膜电图（ERG）
手术剪	Fine Science Tools	91460-11	用于手术
透明质酸钠	Santen Pharmaceutical	Hyalein	用于眼部润滑
托吡卡胺/盐酸去氧肾上腺素	Santen Pharmaceutical	Mydrin-P	用于散瞳
6-0丝线缝合线	Natsume	E12-60N2	用于手术