基于DNA/Ki67的流式细胞术检测法用于分析疫苗接种小鼠中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期

摘要

克隆扩增是抗原特异性T细胞反应的关键特征。然而，对抗原应答T细胞的细胞周期研究较少，部分原因是技术上的限制。本文介绍了一种流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结中发生克隆扩增的抗原特异性CD8 T细胞。

摘要

体内抗原特异性T细胞的细胞周期已通过少数几种方法进行研究，但这些方法均存在一定的局限性。溴脱氧尿苷（BrdU）可标记处于S期或近期完成S期的细胞，而羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）可在细胞分裂后用于检测子代细胞。然而，这些染料无法在分析时确定细胞所处的细胞周期时相。另一种方法是利用Ki67，这是一种在细胞周期各时相中均有高表达、但在静息期G0除外的标记分子。₀遗憾的是，Ki67 无法进一步区分处于 S 期并已承诺进入有丝分裂的细胞与处于 G 期的细胞₁ 可以保持在此阶段_, 进入细胞周期循环，或进入G期₀.

此处，我们描述了一种用于捕获的流式细胞术方法 "快照" 小鼠次级淋巴器官中不同细胞周期阶段T细胞的分析。该方法结合了Ki67与DNA染色、主要组织相容性复合物（MHC）-肽-多聚体染色以及一种创新的设门策略，使我们能够成功区分处于G₀，在 G₁ 以及在 S-G 期₂细胞周期中脾脏的M期 并在接种携带人免疫缺陷病毒（HIV）-1模型抗原gag的病毒载体后，获取小鼠的引流淋巴结。

该方法的关键步骤包括DNA染料的选择以及设门策略的优化，以提高检测的灵敏度，并纳入那些按照当前分析标准容易被遗漏的高度活化/增殖的抗原特异性T细胞。DNA染料Hoechst 33342能够实现G₀/G₁期与G₂/M期DNA峰之间的高质量区分 ，同时保持细胞膜及细胞内染色的完整性。该方法在增进对体内T细胞应答的理解以及改进免疫监测分析方面具有巨大潜力。

引言

初始T细胞在抗原启动后会发生克隆扩增和分化。分化后的T细胞表现出效应功能，这些功能对于清除抗原以及维持抗原特异性记忆至关重要，而后者是实现长期保护的关键。在初次免疫应答的早期阶段，初始T细胞与淋巴器官内特定微环境中抗原提呈细胞（APCs）的相互作用，对于诱导大量T细胞增殖（即克隆扩增阶段的特征）具有决定性作用^1,2,3。T细胞与APC之间的相互作用受到抗原浓度与持续性、共刺激信号以及可溶性因子（如细胞因子和趋化因子）的精细调控，这些因素共同影响T细胞克隆后代的数量和质量^4,5,6,7。

尽管对T细胞克隆扩增已进行了大量研究，但目前仍不清楚抗原致敏的T细胞是否在抗原识别位点完成整个细胞周期，还是在细胞周期进展过程中迁移至其他器官。这一知识空白源于现有细胞周期分析工具的局限性 。这些工具包括针对核标记物Ki67的单克隆抗体（mAbs），以及能够识别已进入细胞周期S期的细胞的细胞染料（例如 溴脱氧尿苷（BrdU）），或用于区分子代细胞与其祖先细胞的染料（例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE））。

然而，细胞标记染料（如 CFSE 和 BrdU）无法确定在特定器官中发现的细胞是局部增殖，还是在分裂后迁移至该部位^8,9。此外，细胞核内蛋白 Ki67 仅能区分处于 G₀ 期（Ki67 阴性细胞）与处于其他任何细胞周期阶段（Ki67 阳性细胞）的细胞。因此，Ki67 分析无法区分处于活跃增殖状态（即 S、G₂ 或 M 期）的细胞与处于 G₁ 期的细胞，后者可能迅速进入分裂，也可能长期停留在 G₁ 期或返回静息状态^10,11。

本文介绍了一种新的流式细胞术方法，用于分析接种疫苗小鼠脾脏和淋巴结（LNs）中抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期¹²（图1）。该方法利用了Ki67与DNA染色的联合应用，此前该组合已被用于分析小鼠骨髓（BM）造血细胞的细胞周期^13,14。在此，我们将Ki67联合DNA染色与近期发表的创新性设门策略¹²相结合，成功应用于CD8 T细胞克隆扩增的分析。我们能够清晰地区分接种疫苗小鼠脾脏 及引流淋巴结中处于G₀期、G₁期以及S-G₂/M期的抗原特异性CD8 T细胞。

方案

小鼠饲养于Plaisant动物实验中心，实验操作均在意大利卫生部授权编号1065/2015-PR下进行。本实验方案遵循国家和国际法律法规及政策所规定的动物护理指南（欧盟指令2010/63/UE；意大利立法法令26/2014）。

1. 培养基和染色液的配制

1. 制备完全培养基：RPMI（Roswell Park Memorial Institute） 含 2 mM 谷氨酰胺、100 U/mL 青霉素/链霉素、50 µM β-巯基乙醇和 10% 体积比（v/v）的培养基 胎牛血清（FBS）
2. 制备染色缓冲液：不含 Ca 的磷酸盐缓冲液²⁺/毫克²⁺ （PBS）含1% 质量/体积（w/v）牛血清白蛋白（BSA）和2 mM 乙二胺四乙酸二钠盐 (EDTA)

2. 小鼠处理

1. 通过在股四头肌中肌肉注射（i.m.）表达人免疫缺陷病毒（HIV）-1-gag的黑猩猩腺病毒载体（ChAd3-gag），对7-8周龄的雌性Balb/c小鼠进行初次免疫，剂量为10⁷病毒颗粒。
2. 初次免疫后1-4个月，通过肌肉注射（i.m.）给予一次加强免疫，使用表达HIV-1-gag的改良安卡拉痘苗病毒（MVA-gag），剂量为10⁶空斑形成单位。
3. 加强免疫后第3天，通过颈椎脱位法处死加强免疫的小鼠，并与未处理小鼠平行进行分析。
4. 采集加强免疫组和未处理组小鼠股四头肌引流的淋巴结（髂、腘窝和腹股沟淋巴结）以及脾脏。此外，从两条后肢采集未处理小鼠的骨髓，并将此骨髓用于流式细胞仪设置及作为细胞周期分析的阳性对照（图2）。
   ​注意：ChAd3-gag和MVA-gag载体的制备方法如前所述^12,15,16,17。

3. 引流淋巴结、脾脏和骨髓细胞的分离

1. 脾脏和淋巴结细胞的分离
   1. 在两个 15 mL 离心管中各加入 5 mL 完全培养基，并将其置于冰上，以备收集器官。
   2. 通过颈椎脱位法处死一只成年小鼠。
   3. 将小鼠仰卧放置，并用 70% v/v 乙醇对皮肤表面进行消毒。
   4. 为收集腹股沟淋巴结，用剪刀在腹部做一条约 1 cm 的纵向切口，并用镊子撑开切口。
   5. 在皮肤内表面观察腹股沟淋巴结，并用镊子将其摘取。将腹股沟淋巴结放入步骤 3.1.1 中准备好的两个 15 mL 离心管之一中。
   6. 为收集脾脏，用剪刀做腹腔切口并取出脾脏。剪除周围结缔组织后，将脾脏放入步骤 3.1.1 中准备好的第二个 15 mL 离心管中。
   7. 为收集髂淋巴结，将肠道移开，在下腔静脉附近观察髂淋巴结，然后用镊子采集。将髂淋巴结放入与腹股沟淋巴结相同的离心管中。
      ​注意：为了获得足够用于染色的淋巴结细胞（见第 4 节），通常需要合并一只小鼠的腘窝、腹股沟和髂淋巴结。这些淋巴结均引流股四头肌（肌肉注射免疫接种的部位）。本方案仅使用一个含有混合淋巴结的 15 mL 离心管。
   8. 为收集腘窝淋巴结，抓住后肢皮肤并轻轻向下拉，以暴露肌肉。然后将镊子插入膝关节下方的肌肉之间，采集腘窝淋巴结。将腘窝淋巴结放入与腹股沟和髂淋巴结相同的离心管中。
      ​注意：参见 3.1.7 后的注释。
   9. 将脾脏放入装有 5 mL 完全培养基的 60 mm 培养皿中的 70 µm 细胞滤器上。使用 5 mL 注射器活塞轻轻研磨器官，直至完全解离。
   10. 移除滤器，将细胞悬液转移至一个洁净的 15 mL 离心管中。
   11. 向培养皿中加入 5 mL 完全培养基，仔细冲洗培养皿和滤器，以确保所有细胞均被回收。将冲洗液与其余脾细胞悬液合并至 15 mL 离心管中。
   12. 对于合并的腹股沟、髂和腘窝淋巴结，采用与步骤 3.1.9 至 3.1.11 中脾脏处理类似的方法制备单细胞悬液。
   13. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 PBS 中。
   14. 使用红细胞裂解缓冲液和 PBS 中的 0.04% v/v 台盼蓝，通过牛鲍计数板对细胞进行计数。
2. 骨髓细胞的分离
   1. 在 15 mL 离心管中加入 5 mL 完全培养基，并将其置于冰上，以备后肢的收集。
   2. 通过颈椎脱位法处死一只成年小鼠。
   3. 用 70% v/v 乙醇对皮肤表面进行消毒。
   4. 用剪刀在腹部皮肤做一条约 1 cm 的横向切口，牢固抓住切口两侧的皮肤，并轻轻向下拉，以暴露后肢肌肉。
   5. 为去除后肢背面的皮肤，保持 小鼠仰卧位，将止血钳置于膝关节下方并向上拉，以暴露肌肉。
   6. 在一条后肢的两个端点处切断骨骼：骨盆/髋关节和踝关节。
   7. 将两条后肢转移至步骤 3.2.1 中准备好的 15 mL 离心管中。将离心管保持在冰上。
   8. 从 15 mL 离心管中取出后肢并转移至滤纸上。在膝关节下方切断后肢以分离胫骨。从周围肌肉中解剖出股骨和胫骨，用剪刀去除多余组织，并润湿滤纸。
   9. 用剪刀剪去骨的两端以暴露内部骨髓腔。将胫骨和股骨插入骨髓提取管中（见 3.2.9.1–3.2.9.2¹⁸ 的准备步骤），宽端朝下。
      1. 在 200 µL 移液器吸头末端上方的刻度线和 100 µL 刻度线处剪断吸头。
      2. 将中间部分插入吸头上部较大的一端，并将此装置放入 1.5 mL 微量离心管中。
   10. 以 800 × g 转速离心骨髓提取管 1 分钟。
   11. 弃去骨骼，并在 1 mL 完全培养基中剧烈重悬沉淀以去除任何细胞团块。将细胞悬液通过置于 15 mL 离心管顶部的 70 µm 滤器过滤。
   12. 每次用 1 mL 完全培养基洗涤骨髓提取管两次。每次均通过 70 µm 滤器过滤，并将滤液与步骤 3.2.11 中获得的其余细胞悬液合并。
       ​注意：一个 15 mL 离心管将包含一只小鼠两条后肢的细胞。
   13. 在 4 °C 条件下，以 400 × g 离心 10 分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于 PBS 中。
   14. 使用红细胞裂解缓冲液和 PBS 中的 0.04% v/v 台盼蓝，通过牛鲍计数板对细胞进行计数。

4. 脾脏、淋巴结和骨髓细胞的染色

1. 将待染色的细胞样品分为3个亚组： 用于补偿的细胞样本，包括未经处理小鼠的骨髓细胞，仅用 Hoechst 33342（以下简称 Hoechst）染色，以及未经处理小鼠的脾细胞，用于制备死/活细胞混合物以进行死细胞染料补偿； 细胞周期分析的阳性对照，包括来自未经处理的小鼠的骨髓样本；以及 实验样本 包含未治疗和已接种疫苗小鼠的脾脏和淋巴结样本。
   注意：确保脾脏和淋巴结细胞数量足够，以分析到足够数量的gag特异性CD8 T细胞。通常需要合并3只免疫小鼠的脾细胞和淋巴结细胞，并对两份或更多相同的细胞混合样本进行染色，每份样本含3 × 10⁶ 细胞。在Hoechst染色步骤合并相同的样品。同样，对来自3只未经处理小鼠的脾细胞和淋巴结细胞进行染色，并在最后合并相同的样品。留出一部分 未染色样品 用于仪器设置和补偿调节的未经处理小鼠的脾细胞
2. 制备死/活细胞混合物用于死细胞染料补偿（该细胞混合物仅用死细胞染料染色）。
   1. 将水浴加热至 65 °C。
   2. 取一份脾细胞（约 3 × 10⁶).
   3. 将细胞悬液转移至微量离心管中，放入 65 °C 水浴 5 分钟，然后立即置于冰上 10 分钟。
   4. 将热灭活的细胞与活的脾细胞（约 3 × 10⁶) 按1:1比例混合，并将一半混合物转移至96孔圆底板（约3 × 10⁶ 每孔细胞数（用于死细胞染色对照）
3. 用于细胞周期分析的实验样本死细胞染色、阳性对照及死/活细胞混合物
   1. 转移脾脏、淋巴结、骨髓细胞（3 × 10⁶ 细胞/孔）以及死/活细胞混合物（第4.2节）按照染色方案（步骤4.1）加入96孔圆底板中，并于400 × g 4 °C下离心3分钟。
   2. 将每个细胞沉淀重悬于50 µL用PBS稀释的死细胞染料中，并立即用移液器吹打3次混匀。
   3. 4 °C 避光孵育 30 分钟。
   4. 用染色缓冲液洗涤细胞2次，第一次加入200 µL，第二次加入250 µL；每次洗涤均以400 × g离心培养板 g 4 °C下持续3分钟
   5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于20 µL PBS中。
4. 使用主要组织相容性复合物（MHC）-肽多聚体和单克隆抗体对细胞膜进行染色。
   1. 根据染色方案确定所需的必要体积（流式细胞仪设置， 表1），准备以下试剂：
      1. 根据适当的稀释比例，将mAb 2.4G2用染色缓冲液稀释（参见 材料表）；每份待染色样品使用10 µL该稀释液。
         注意：2.4G2 单克隆抗体可阻断免疫球蛋白与 FcγIII 和 FcγII 受体之间的非抗原特异性结合。
      2. 将H-2k(d) AMQMLKETI别藻红蛋白（APC）标记的四聚体（Tetr-gag）用染色缓冲液稀释至适当浓度（参见 材料表）；每个待染色的样品使用 20 µL 此稀释液。
      3. 根据适当的稀释比例，将单克隆抗体（mAbs）用染色缓冲液稀释，配制抗体混合液（参见 材料表在滴定实验中已预先确定的抗体混合物；每份待染色样品使用 20 µL 该抗体混合物。
         ​注意：此处使用了抗 CD3e 藻红素蛋白-花青素5.5（PerCP-Cy5.5）（克隆号 145-2C11）、抗 CD8a 亮紫外荧光染料805（BUV805）（克隆号 53-6.7）以及抗 CD62L 藻红蛋白-花青素7（PECy7）（克隆号 MEL-14）。
   2. 加入10 µL先前稀释的2.4G2单克隆抗体（步骤4.4.1.1），4 °C避光孵育10分钟。
   3. 加入20 µL先前稀释的Tetr-gag APC（步骤4.4.1.2）和10 µL H-2k(d) AMQMLKETI藻红蛋白（PE）五聚体（pent-gag）。4 °C避光孵育15分钟。
   4. 加入20 µL先前配制的抗体混合液（步骤4.4.1.3），在4 °C避光孵育15分钟。
      注意：因此，每孔终体积为 80 µL（步骤 4.3.5，步骤 4.4.2 至 4.4.4）。
   5. 用 200 µL 染色缓冲液洗涤细胞。在 400 × g 4 °C 下离心 5 分钟。
   6. 将细胞沉淀重悬于250 µL染色缓冲液中，转移细胞悬液至5 mL离心管。向管中加入1 mL染色缓冲液，400 × g 4 °C下离心5分钟。
   7. 取骨髓细胞等分试样（3 × 10⁶ 细胞）（参见第4.1节细胞样本列表），用于补偿Hoechst通道（Hoechst 33342由 紫外激光（流式细胞仪设置（表2），并将细胞悬液转移至一个5 mL离心管中。向管中加入1 mL染色缓冲液，以400 × g 4 °C下离心5分钟。

5. 固定/通透

1. 根据制造商说明书，将1份固定/破膜浓缩液与3份固定/破膜稀释液混合，配制新鲜的固定/破膜缓冲液。
2. 弃去上清液，短暂涡旋振荡样品，彻底分散沉淀物。
3. 向每支试管中加入1 mL新配制的固定/破膜缓冲液，包括一支含有未染色脾细胞的试管（3 × 10⁶，参见细胞样品列表，第4.1节），然后涡旋混匀。
4. 在4 °C下孵育16小时。
   ​注意：本步骤可暂停。

6. 胞内染色

1. Ki67 染色
   1. 根据制造商说明书，用蒸馏水将 10x 破膜缓冲液稀释制备新鲜的 1x 破膜缓冲液。使用前，必须将 1x 破膜缓冲液通过 0.45 μm 滤膜过滤，以去除聚集体。
   2. 将 Ki67 单克隆抗体荧光素异硫氰酸盐（FITC）（克隆号 SolA15）用 1x 破膜缓冲液稀释（参见材料表），稀释比例依据前期滴定实验确定（每样本终体积为 100 μL）。
   3. 向每管中加入 3 mL 1x 破膜缓冲液，在室温（RT）下以 400 × g 离心 5 分钟。
   4. 弃去上清液，并重复步骤 6.1.3。
   5. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 100 µL 已预先稀释的 Ki67 单克隆抗体 FITC 溶液中（步骤 6.1.2）。
   6. 在室温下避光孵育 30 分钟。
   7. 用 4 mL 1x 破膜缓冲液洗涤细胞两次，每次洗涤均在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
   8. 根据以下体积将细胞沉淀重悬于 PBS 中：需直接上流式细胞仪检测的样本，使用 350 µL PBS；需在流式细胞术前短时间孵育 Hoechst 的样本（见第 6.2 节），使用 250 µL PBS。
2. DNA 染色
   1. 向每个样本中加入 250 µL 含 4 µg/mL Hoechst 的 PBS 溶液（Hoechst 终浓度为 2 µg/mL）。
      ​注意：若已制备两份或以上各 250 µL 的相同 PBS 样本，可在本步骤合并，并加入等体积的 4 µg/mL Hoechst PBS 溶液（Hoechst 终浓度为 2 µg/mL）。细胞数量对 DNA 染色步骤影响显著，每个样本应使用相同的细胞数量。需注意，即使细胞数量略有减少（例如因前期洗涤步骤中细胞丢失），也会导致 Hoechst 与 DNA 的结合增加，从而引起 Hoechst 荧光强度升高。  
   2. 在室温下避光孵育 15 分钟。
   3. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。
   4. 将细胞沉淀重悬于 350 µL PBS 中。

7. 补偿微珠样本的制备

1. 将单克隆抗体（mAb）用染色缓冲液适当稀释，制备5 µL抗体溶液。
   注意：实验中使用的每种荧光染料标记的单克隆抗体，均需制备相应的补偿微珠样本。
2. 使用前将阴性对照微珠（Negative Control CompBeads）和抗大鼠/仓鼠Ig,κ微珠（Anti-Rat/Hamster Ig,κ Comp Beads）充分涡旋振荡。
3. 对于每个样本，加入一滴（约20 μL）阴性对照补偿微珠和一滴抗大鼠/仓鼠Ig,κ补偿微珠。
4. 向试管中加入5 µL预稀释的抗体（步骤7.1），并用移液器吹打混匀。
5. 在4 °C避光孵育15分钟。
6. 用2 mL染色缓冲液洗涤样本，在4 °C以400 × g离心5分钟。
7. 弃去上清液，向每管中加入500 µL PBS重悬沉淀，并涡旋振荡混匀。

8. 流式细胞仪的仪器设置、补偿调节及实验样本采集

注意：请参考流式细胞仪设置（表 2）以获取细胞仪配置信息。

1. 通用仪器设置与补偿设置
   1. 打开样本采集软件（参见材料表），在工作区功能区中点击新建实验，然后选择新建空白实验，以创建一个新实验。
   2. 双击已创建的实验以打开它。
   3. 在流式细胞仪设置窗口中，点击参数，并选择染色面板中使用的所有通道（例如 PE、APC 等），包括前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）参数。
   4. 取消勾选对数刻度，选择线性刻度作为 Hoechst 参数，并在 FSC、SSC 和 Hoechst 参数中勾选电压脉冲的宽度（W）。
      ​注：除 FSC 和 SSC 默认为线性刻度外，所有参数默认显示为对数（log）刻度。所有参数均通过电压脉冲的面积（A）和高度（H）进行分析。
   5. 在全局工作表中，创建一个点图，以 FSC-A 为横轴，SSC-A 为纵轴。
   6. 在采集仪表板中点击采集数据，运行未染色的脾脏样本。
   7. 通过修改参数部分中的电压值，设置适当的 FSC 和 SSC 参数以显示细胞，并在全局工作表的工作区工具栏中点击多边形门控，在 FSC-A/SSC-A 点图中创建门控以选择所有显示的细胞。
   8. 将门控后的细胞以直方图形式显示，每个荧光参数作为横轴。
   9. 运行未染色和完全染色的脾脏样本，调整荧光检测器（PMT），使每个荧光参数的染色细胞中阴性与阳性信号之间具有清晰的分离。
   10. 进行补偿设置时，在工作区功能区中点击实验，在补偿设置部分选择创建补偿对照。取消勾选包含未染色对照管/孔，然后点击确定。
       ​注：此操作将创建一个名为补偿对照的样本，以及一个包含多个工作表的普通工作表，每个工作表对应一个选定的参数。
   11. 运行补偿微珠样本（见第 7 节）；在流式细胞仪窗口中，通过调整电压值并将 FSC 参数的采集阈值设为 5,000，以显示微珠。
   12. 在微珠群体上调整 P1 门控，并确认横轴上同时可见阳性和阴性峰。对每个补偿微珠样本重复此操作，最后在采集仪表板中点击记录数据保存每个样本文件（每个样本至少记录 5,000 个事件）。
   13. 对每个已记录的微珠样本，在阳性和阴性峰上分别设置 P2 和 P3 门控。
   14. 运行用于补偿的细胞样本（参见步骤 4.2 和 4.4.7，以及第 5 和第 6 节）。调整 FSC 和 SSC 电压及阈值以显示细胞，调整 P1 门控，最后记录每个样本文件（至少记录 10,000 个事件）。在阳性和阴性峰上分别设置 P2 和 P3 门控。
       注：对于 Hoechst 通道的补偿，使用 G₀/G₁ 作为阴性峰（P3），G₂/M 作为阳性峰（P2）。
   15. 在工作区功能区中点击实验，在补偿设置部分选择计算补偿。
   16. 为创建的补偿设置命名，链接并保存至当前实验。
2. 实验样本采集
   1. 在浏览器工具栏中点击新建样本以打开一个样本，并在全局工作表中建立门控策略。
      注：样本采集的门控策略与样本分析类似，如图 3和第 9 节所述。
   2. 在直方图中显示所有事件群体，横轴为 CD3-A。创建一个区间门控，仅选择 CD3⁺ 细胞。
   3. 在采集仪表板中，选择淋巴结样本的存储门控为所有事件，脾脏样本则选择所有事件或 CD3⁺ 细胞。
   4. 以低速运行实验样本，最后记录所有文件，确保从每只免疫小鼠中至少采集到 100–200 个抗原特异性 CD8 T 细胞。
      注：实验样本的文件通常较大（30–120 MB），尤其是当抗原特异性 CD8 T 细胞频率较低时。因此，必须采集大量事件（> 1 × 10⁶）才能记录至少 100–200 个抗原特异性 CD8 T 细胞。大文件可能会减慢后续数据分析过程。仅采集脾脏样本中的 CD3⁺ 细胞（见上述步骤 8.2.2）有助于减小文件大小。
   5. 运行并记录细胞周期分析的阳性对照，即未处理小鼠的骨髓（BM）样本。

9. 数据分析

1. 打开软件（参见材料表），在工作区功能区中点击创建组，为待分析的不同器官创建不同的组（例如，创建组 "a-LNs"；"b-spleen"；"c-BM"）。
   注意：新创建的组将显示在组列表中，而"补偿"组将由软件自动生成。
2. 双击组名称以打开修改组窗口，并确认新创建的组已同步。若未同步，请在同步功能前插入勾选标记。
3. 将每个 .fcs 文件拖入其对应的组中。
4. 从"a-LNs"组开始创建设门策略。
5. 双击组中的完全染色样本以打开图形窗口；x轴和y轴的标签与fcs文件中的标注一致（参见流式细胞仪设置，表2）。
6. 在点图中显示该样本获取的全部事件，x轴为DNA-A，y轴为DNA-W。
7. 在图形窗口的设门工具部分点击矩形，仅选择单细胞群体。
   注意：单细胞的DNA-A值如下：2N（低）、介于2N与4N之间（中等）或等于4N（高），而所有单细胞的DNA-W值均相同（图3的第1步）。
8. 双击矩形门的中心，以点图形式显示单细胞，x轴为FSC-A参数，y轴为死细胞染料信号。
9. 在图形窗口的设门工具部分点击多边形，仅选择活细胞群体。活细胞对死细胞染料呈阴性（图3的第2步）。
10. 双击多边形门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为FSC-A参数，y轴为SSC-A参数。
11. 点击矩形，创建一个"宽松"门，以包含该图中所有单个活细胞¹²（图3的第3步）。
12. 双击"宽松"门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为CD3，y轴为CD8。
13. 点击多边形，选择CD3⁺CD8⁺细胞（图3的第4步）。
14. 双击CD3⁺CD8⁺门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为Tetr-gag，y轴为Pent-gag。
15. 点击多边形，选择抗原特异性CD8 T细胞（Tetr-gag和Pent-gag均呈阳性）（图3的第5步）。
16. 双击gag特异性门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为DNA-A，y轴为Ki67（图4）。
17. 在图形窗口的设门工具部分点击四象限，根据不同的细胞周期阶段选择细胞。
    注意：处于G₀期的细胞为Ki67阴性且DNA低（左下象限）；处于G₁期的细胞为Ki67阳性且DNA低（左上象限）；处于S-G₂/M期的细胞为Ki67阳性且DNA中等或高（右上象限）（图4）。
18. 将在一个样本中创建的设门策略复制到对应组中，以将门应用于该组的所有样本。
19. 对"a-LN组"重复步骤9.5至9.18。
20. 检查"b-spleen"组中每个样本的门是否合适。为分析骨髓（BM）细胞中的细胞周期（阳性对照），点击"宽松"门的中心，以点图形式显示细胞，x轴为DNA-A，y轴为Ki67。
21. 检查三个组（即脾脏、LN和BM来源的细胞）中每个样本的所有门是否合适。
    注意：单细胞群体门（步骤9.7）和细胞周期四象限门（步骤9.17）在不同样本中可能具有不同的门坐标，主要由于各样本间Hoechst染料强度可能存在轻微差异（见第6.2节）。因此，可能需要对每个样本的单细胞群体门和细胞周期四象限门进行调整。操作方法如下：双击组名称，取消组属性中的同步。此操作允许修改一个样本中的门，而不会同时修改该组中其他所有样本的相同门。取消同步后，根据需要修改门。
22. 为可视化本分析所得结果，在工作区功能区点击布局编辑器以打开该功能。将设门策略中每个门的样本窗格拖至布局编辑器中，并按照设门策略的顺序排列图形。如有必要，双击布局中的相应图形，在图形定义窗口中选择适当的类型 以更改图形类型。
23. 在布局功能区点击组和按…迭代功能，以可视化各器官的分析结果，并比较不同样本。

结果

根据图1中总结的方案，使用荧光DNA染料Hoechst和抗Ki67单克隆抗体对Balb/c小鼠脾脏、淋巴结和骨髓中细胞的细胞周期时相进行了分析。该染色方法可区分细胞周期的以下各时相：G₀期（Ki67阴性，DNA含量为2N，定义为DNAlow）、G₁期（Ki67阳性，DNAlow）以及S-G₂/M期（Ki67阳性，DNA含量介于2N至4N之间，或等于4N，定义为DNAintermediate/high）。

我们首先对骨髓（BM）细胞进行细胞周期分析，以重复此前已发表的结果^13,14，随后分析了目标细胞，即CD8 T细胞。图2展示了骨髓细胞周期分析的一个典型示例（图2A）。该方案获得的G₀/G₁和G₂/M期DNA峰的变异系数（CV）较低，表明DNA染色质量优异（图2B显示了一个CV < 2.5的示例；在所有实验中，CV始终 < 5）。

随后，我们将相同的方案应用于接种疫苗小鼠的抗原特异性CD8 T细胞。采用携带HIV-1 gag抗原的Chad3-gag进行初次免疫，并以MVA-gag进行加强免疫，对BALB/c小鼠进行疫苗接种。在加强免疫后第3天（d3），我们分析了脾脏和引流淋巴结（LNs）中gag特异性CD8 T细胞的频率。我们采用了新近定义的免疫应答早期T细胞设门策略，该策略与传统方法不同，适用于检测高度活化的抗原应答型CD8 T细胞¹²。该新策略共分为五个连续步骤执行。第一步，通过DNA-A/-W设门排除双联体或聚集体；第二步，通过排除死细胞标记物鉴定活细胞。第三步，采用一种非传统的“宽松”FSC-A/SSC-A设门（图3A），而非经典的狭窄淋巴细胞设门，以识别目标细胞群体¹²。在圈定CD3⁺CD8⁺细胞后（图3A的第4步），我们使用两种不同的MHC多聚体——Pent-gag和Tetr-gag——鉴定gag特异性CD8 T细胞（图3A的第5步）。我们使用两种多聚体而非一种，以提高在接种小鼠中检测gag特异性CD8 T细胞的灵敏度，同时不增加未处理小鼠的染色背景（图3B和C，第5步）。因此，我们成功区分了未处理小鼠（淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞分别为0.00%和0.00%）与接种小鼠（淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞分别为0.46%和0.29%，图3B和C）。

值得注意的是，该实验方案使我们在未经处理小鼠的淋巴结和脾脏中抗原特异性CD8 T细胞门控内的背景信号极低（通常为0.00%，最高不超过0.02%）。对gag特异性与非gag特异性FSC-A / SSC-A图谱的比较显示，gag特异性细胞具有较高的SSC-A和FSC-A值（图3D），这证实了需要采用“宽松”的FSC-A/SSC-A门控策略以捕获这些细胞。随后，我们评估了不同细胞周期阶段中gag特异性CD8 T细胞的比例（图4A）。结果发现，在加强免疫后第3天，脾脏中的gag特异性CD8 T细胞以及引流淋巴结中的此类细胞均含有较高比例处于S-G₂/M期的细胞（分别为18.60%和33.52%）。

此外，我们将同一器官中gag特异性的CD8 T细胞与总CD8 T细胞叠加分析发现，处于S-G₂/M期的gag特异性CD8 T细胞具有较高的FSC-A和SSC-A（图4B）。如预期的那样，gag特异性CD8 T细胞的CD62L表达水平较低，这符合活化T细胞的特征，仅在淋巴结（LNs）中G₀期的少数细胞例外（图4C）。综上所述，这些结果证实，“宽松”设门策略（图3A、B和C的步骤3）对于包含所有正在增殖的抗原特异性CD8 T细胞是必需的¹²。该方案对于在分析时“快照式”评估抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期时相，以及不同细胞周期时相细胞的CD62L表达情况极为有价值。

图 1： 抗原特异性 CD8 T 细胞细胞周期分析实验方案示意图。 请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：骨髓细胞的细胞周期分析。 来自未处理的 Balb/c 小鼠的骨髓细胞经染色后通过流式细胞术进行分析。（A） 设门策略示例。我们在 DNA-A/-W 图中对单个细胞进行设门（左图），随后通过死细胞染料排除法筛选活细胞（中图）。然后，使用“宽松”的 FSC-A/SSC-A 设门圈选所有骨髓细胞（右图）。（B） 骨髓细胞细胞周期分析示例（左图）。我们联合使用 Ki67 和 DNA 染色来鉴定细胞周期中各时相的细胞：G₀ 期（左下象限，Ki67neg-DNAlow 细胞）、G₁ 期（左上象限，Ki67pos-DNAlow）、S-G₂/M 期（右上象限，Ki67pos-DNAintermediate/high）。图中同时展示了 Ki67 单克隆抗体的荧光减一（FMO）对照（中图）和 DNA 直方图（右图）。在 DNA 直方图中，左侧和右侧的门分别对应 G₀/G₁ 和 G₂/M 的 DNA 峰，数字表示各峰的变异系数（CV）。其余所有图中的数字均表示指定门内细胞所占的百分比。该图展示了 5 次独立实验中 1 次的代表性结果，每次实验分析来自 3 只小鼠的混合骨髓细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：来自淋巴结和脾脏的抗原特异性CD8 T细胞分析。 Balb/c小鼠通过肌内注射（i.m.）接种Chad3-gag进行初免，并以MVA-gag进行肌内加强免疫。加强免疫后第3天，收集疫苗接种小鼠和未处理对照小鼠的引流淋巴结及脾脏细胞，经染色后通过流式细胞术进行分析。（A） 门控策略示意图，共分五步：识别单细胞（第1步）；活细胞（第2步）；淋巴细胞（第3步）；CD8 T细胞（第4步）；以及gag特异性细胞（第5步）。（B–C） 典型图例：展示来自（B） 淋巴结和（C） 脾脏的未处理（上图）与疫苗接种（下图）小鼠细胞的分析结果。在第1步中，我们通过DNA-A/-W图识别单细胞；在第2步中，通过排除死细胞染料信号选择活细胞；在第3步中，我们采用一种非经典的“宽松”门控方式圈选淋巴细胞；在第4步中，通过CD3和CD8的双表达识别CD8 T细胞；在第5步中，根据细胞是否能够结合荧光标记的H-2kd-gag-五聚体（Pent-gag）或H-2kd-gag-四聚体（Tetr-gag），分别鉴定为gag特异性细胞或非gag特异性细胞。（D） 按上述门控策略分析后，gag特异性细胞（蓝色）与非gag特异性细胞（灰色）在FSC-A/SSC-A图中的分布情况。数字表示相应门控区域内的细胞百分比。本图展示了5次独立实验中1次的代表性结果。每次实验均分析来自3只疫苗接种小鼠和3只未处理小鼠的混合脾脏细胞与混合淋巴结细胞。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期分析。 小鼠的免疫接种方法同图3，在加强免疫后第3天进行gag特异性细胞的细胞周期分析，细胞门控策略如图3所示，共分5步。 (A) 来自免疫小鼠淋巴结（上图）和脾脏（下图）的gag特异性CD8 T细胞细胞周期分析示例。细胞周期各时相的划分方法同图2B。图中各图显示处于G₀、G₁以及S-G₂/M期（左图）的细胞，以及Ki67单克隆抗体的荧光减一（FMO）对照（右图）。数值表示指定门控区域内细胞的百分比。(B) FSC-A/SSC-A散点图，显示来自免疫小鼠淋巴结（上图）和脾脏（下图）的gag特异性CD8 T细胞中处于S-G₂/M期的细胞（红色），叠加于全部CD3⁺CD8⁺ T细胞（灰色）之上。(C) 偏移直方图，显示来自免疫小鼠淋巴结（上图）和脾脏（下图）的gag特异性CD8 T细胞在G₀ 期（绿色）、G₁期（蓝色）以及S-G₂/M期（红色）时CD62L的表达水平。y轴表示标准化后的事件数。本图展示了5次独立实验中1个代表性结果，共涉及15只小鼠。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充材料：流式细胞仪设置。 请点击此处下载该文件。

讨论

尽管T细胞克隆扩增已被广泛研究，但仍有一些方面尚不明确，主要原因在于可用于研究该过程的工具较少且各自存在局限性。基于这一背景，我们建立了一种高灵敏度的流式细胞术方法，用于在小鼠模型中分析疫苗接种后早期抗原特异性CD8 T细胞的细胞周期。该方案基于Ki67与DNA染色相结合的方法，此前该方法曾用于分析小鼠骨髓造血细胞的细胞周期^13,14。为了将该方案适用于抗原特异性CD8 T细胞，我们必须考虑若干关键问题，包括DNA染料的选择、获得不同样本间可比DNA染色效果的适当条件，以及数据分析的设门策略。

可用于DNA染色的染料有多种，包括碘化丙啶和7-氨基放线菌素D；我们选择Hoechst是因为它与膜染色兼容，并且适用于Ki67染色所需的温和固定和透化方案。同时，使用Hoechst染色能够获得高质量的DNA直方图，即G₀/G₁和G₂/M期DNA峰的变异系数（CV）明显低于使用其他DNA染料（如DRAQ5¹⁹）通常获得的DNA峰。事实上，Hoechst甚至可以在活细胞中对DNA进行染色²⁰。

为避免同一次实验中不同样本的Hoechst荧光强度出现波动，我们采用了一些策略。Hoechst染色应在流式细胞仪检测前立即进行，以最大限度减少染料随时间推移而发生的荧光衰减。对于希望在包含大量样本的大规模实验中重复本方案的研究者，我们建议每次仅对少量样本进行Hoechst染色。另一个明显的缺点是，细胞数量在染色孵育过程中会对Hoechst荧光强度产生显著影响。因此，我们强烈建议在DNA染色时，每个样本始终使用相同数量的细胞和相同的体积。如果流式细胞仪检测需要较多细胞，我们建议制备两个或更多完全相同的样本，并在Hoechst染色步骤前将它们合并。

该实验方案的一个关键点在于数据分析的设门策略。我们近期发表了一种在免疫应答早期阶段分析T细胞的新策略，该策略提高了抗原特异性T细胞检测的灵敏度¹²。我们对本文所示数据应用了该策略，具体步骤如下：首先，在DNA-A/W图中排除细胞聚集体；其次，在排除死细胞后，我们在FSC/SSC图中使用了一个相对宽泛的淋巴细胞门（"宽松设门"）。通过该策略，我们能够纳入那些通常被现有设门策略遗漏的、处于S-G₂/M期的高度活化的抗原特异性CD8 T细胞，因为这些细胞具有较高的FSC-A和SSC-A信号。总之，数据分析是该方法中的关键环节，对于实现对抗原特异性活化/增殖T细胞的高灵敏度检测至关重要。

该方法可避免在免疫应答早期阶段遗漏关键的T细胞数据，为T细胞免疫监测开辟了新的前景。未来的一个改进方向是加入磷酸化组蛋白3的染色，从而能够区分G₂期与M²¹期。目前的局限性在于，为了对核标记物Ki67进行染色，细胞必须经过固定和透化处理，因此无法用于其他类型的分析，例如分选及后续的功能分析。此外，包括Hoechst在内的DNA染料通常会干扰基因组DNA分析，不适用于此类评估。若能鉴定出与不同细胞周期阶段相关、且可在活细胞表面染色的膜标记物，则有望克服这一局限。总之，该方法在疫苗接种、感染、免疫介导性疾病以及免疫治疗等多种情境下，对活化/增殖T细胞的评估具有广阔的应用潜力。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-200 μL型通用适配散装吸头	康宁	CLS4866-1000EA
2.4G2 抗 FcγR mAb	BD	553141	10 μg/ml 终浓度
5 ml 注射器推杆	BD Emerald	307733
15 ml 离心管	默克密理博	SBHA025SB
60 mm 细胞培养皿（TC处理）	Falcon	353002
70 μm细胞滤筛	Falcon	352097
96孔透明圆底经组织培养处理的微孔板	Falcon	353077
抗大鼠/仓鼠Ig,k/阴性对照补偿微粒	BD-生物科学	552845
β-巯基乙醇	Sigma	M3148
牛血清白蛋白	Sigma	A07030
BUV805 大鼠抗小鼠 CD8a	BD-生物科学	564920	4 μg/ml 终浓度
不含钙不含镁的杜氏磷酸盐缓冲液	Euroclone	ECB4004L
Eppendorf Safe-Lock 离心管，1.5 mL	Eppendorf	30120159
乙醇	Sigma	34852-1L-M
乙二胺四乙酸二钠盐溶液（EDTA）	Sigma	E7889
胎牛血清	康宁	35-079-CV
Filcon，无菌，注射器式 70 μm	Falcon	352350
可固定的活力染料 eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	1:1000 终浓度
Foxp3 / 转录因子染色缓冲液套装	eBioscience	00-5523-00	该套装包含固定/透化浓缩液、稀释液以及10倍浓度的透化缓冲液
H-2k(d) AMQMLKETI 别藻红蛋白（APC）标记四聚体	由美国国立卫生研究院四聚体核心设施提供		6 μg/ml 终浓度
H-2k(d) AMQMLKETI 藻红蛋白（PE）标记五聚体	Proimmune	F176-2A-E - 176	10 μL / 样本
Hoechst 33342三盐酸盐三水合物 - 水溶液（10 mg/mL）	赛默飞世尔科技	H3570
Ki-67 单克隆抗体（SolA15），FITC	eBioscience	11-5698-82	5 μg/ml 终浓度
L-谷氨酰胺 100倍浓度（200 mM）	Euroclone	ECB3000D
Millex-HA 滤器 0.45 µm	BD	340606
青霉素/链霉素 100X	Euroclone	ECB3001D
PE/Cyanine7 抗小鼠 CD62L 抗体	Biolegend	104418	0.2 μg/ml 终浓度
PerCP-Cy™5.5 仓鼠抗小鼠 CD3e	BD-生物科学	551163	4.4 μg/ml 终浓度
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
5 mL 圆底聚苯乙烯管	Falcon	352058
不含L-谷氨酰胺含酚红的RPMI 1640培养基	Euroclone	ECB9006L
用于分析流式细胞术数据的软件包	FlowJo	v.10
流式细胞仪样本采集软件	BD FACSDiva	v 6.2
台盼蓝溶液	Euroclone	ECM0990D