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方法文章

通过马来酰亚胺-硫醇化学与分选酶A介导连接制备位点特异性细胞毒性蛋白偶联物

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DOI：

10.3791/61918

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2021年1月5日

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1Department of Protein Engineering, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw, 2Department of Protein Biotechnology, Faculty of Biotechnology, University of Wroclaw

本文内容

摘要

本文提供了利用马来酰亚胺-巯基反应和分选酶A介导的连接技术，对蛋白质进行位点特异性偶联细胞毒性药物的详细实验方案。

摘要

癌症目前是全球第二大常见死因。癌细胞的特征是其表面存在特定的标志蛋白，例如生长因子受体。这一特性使得人们能够开发出高度选择性的治疗药物——蛋白偶联物，这类药物由靶向蛋白（抗体或受体配体）通过特定连接子与高细胞毒性的药物连接而成。由于靶向蛋白具有极高的亲和力和选择性，这些偶联物能够识别癌细胞表面的标志蛋白，并通过受体介导的内吞作用进入细胞内部。细胞内的囊泡运输系统最终将偶联物运送至溶酶体，在溶酶体中，蛋白水解作用将游离的细胞毒性药物从偶联物的蛋白质核心上释放出来，从而触发依赖药物的癌细胞死亡。目前已有多种蛋白偶联物被批准用于癌症治疗，同时还有大量候选药物正处于研发或临床试验阶段。

在生物偶联物制备过程中，一个主要挑战是将细胞毒性药物以位点特异性的方式连接到靶向蛋白上。近年来，在开发用于将细胞毒性药物与蛋白进行化学或酶法修饰的策略方面取得了巨大进展。本文提供了两种位点特异性地将细胞毒性弹头分子引入靶向蛋白的详细实验方案：一种是采用马来酰亚胺-巯基化学的化学方法，另一种是依赖于分选酶A介导连接的酶法。我们以成纤维细胞生长因子2的工程化变体以及人免疫球蛋白G的可结晶片段作为代表性靶向蛋白，以单甲基澳瑞他汀E和甲氨蝶呤作为模型细胞毒性药物。所有所述策略均可高效地生成具有明确分子结构、生物活性的细胞毒性偶联物，有望用于多种癌症的选择性治疗。

引言

数十年的科学研究极大地推动了我们对调控癌症发生与进展的分子机制的认识。然而，由于药物缺乏选择性导致的不良反应、肿瘤的高度异质性以及长期治疗后产生的耐药性，目前的治疗手段仍然受到很大限制。近年来，靶向抗癌疗法作为一种新颖且极具前景的方法，受到越来越多关注，可用于治疗多种肿瘤。靶向治疗依赖于精密的药物递送系统，能够将细胞毒性药物精准地输送至癌细胞，同时保护正常细胞。这类系统主要包括多种纳米颗粒、脂质体以及基于蛋白质的药物载体。

癌细胞表面通常会暴露较高水平的特定标志蛋白。抗体药物偶联物（ADC）是一类新型的基于蛋白质的抗癌治疗药物，它将单克隆抗体的高度特异性与药物的强细胞毒性在单一分子中结合起来。一旦结合到癌细胞表面，ADC便通过受体介导的内吞作用进入细胞。随后，ADC通过内体区室被转运至溶酶体，在溶酶体中蛋白酶降解ADC并释放出具有活性的细胞毒性药物。目前，美国已批准八种ADC用于治疗多种肿瘤，包括三阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、尿路上皮癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、血液系统恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病。此外，还有大量ADC正处于研发阶段或等待批准1。值得注意的是，蛋白质工程方法已推动了多种可替代单克隆抗体的蛋白支架及其细胞毒性偶联物的发展，这些包括不同的抗体片段2,3、DARPins4,5、knottins6,7、centyrins8、affibodies9,10以及工程化受体配体11,12。

一种成功的基于蛋白质的细胞毒性偶联物必须满足若干关键要求，即偶联物的稳定性、极高的特异性、对癌症特异性标志物的高亲和力、偶联物快速内化进入癌细胞内部、高效转运至溶酶体，以及活性载荷在细胞内的有效释放。另一个重要特征是偶联物的均一性，这在很大程度上取决于将载荷连接至靶向蛋白所采用的策略。目前已有多种实现蛋白质与细胞毒性药物位点特异性偶联的方法，例如修饰蛋白侧链上的半胱氨酸或赖氨酸残基、将药物连接到整合入靶向蛋白中的非天然氨基酸，或对靶向蛋白进行酶促修饰（如使用转谷氨酰胺酶、糖基转移酶、甲酰甘氨酸生成酶、分选酶A）。大多数情况下，位点特异性偶联方法需要对靶向分子进行改造（例如通过半胱氨酸工程化或引入短肽标签），但相应地可高效地生成均一的目标偶联物。

本文提供了将靶向蛋白与细胞毒性药物进行高效位点特异性偶联的实验方案。作为示例蛋白，我们使用了两种不同的分子：人IgG的可结晶片段（Fc）以及人成纤维细胞生长因子2（FGF2）的工程化变体。Fc片段是典型抗体药物偶联物（ADC）的重要组成部分，同时也存在于其他类型的偶联物中，例如细胞毒性肽体或抗体片段偶联物。FGF2是一种天然的成纤维细胞生长因子受体（FGFR）配体，已成功经过工程化改造，可生成一种选择性细胞毒性偶联物，靶向FGFR过表达的癌细胞。

我们提出了两种不同的偶联策略，可实现细胞毒性药物的位点特异性整合。首先，提供了基于Hermanson方案13的通过马来酰亚胺-巯基化学法将药物偶联至Fc片段中半胱氨酸侧链的实验方案（图1A,B）。在该方案中，首先使用三(2-羧乙基)膦（TCEP）还原两个二硫键，生成的游离巯基再通过马来酰亚胺-巯基化学法与单甲基奥瑞他汀E（MMAE）进行偶联（图1B）。由于重链恒定区2和3（CH2与CH3）结构域之间的相互作用，药物连接的Fc二聚体结构得以保持。其次，介绍了生成双弹头FGF2偶联物的策略，该方法结合了半胱氨酸工程改造与分选酶A介导的连接技术，可将两种不同的药物以位点特异性方式整合至FGF2中（图1A,C）。该策略使用一种无内源半胱氨酸的FGF2变体，其N端带有额外的KCKSGG序列并含有一个暴露的半胱氨酸残基，C端则带有LPETGG短肽标签12。马来酰亚胺-巯基反应可使MMAE与本课题组设计的KCKSSG连接子中的半胱氨酸残基发生偶联14,15。随后通过依赖分选酶A的步骤（基于Chen等人的方法）16，将连接有甲氨蝶呤（MTX）的四甘氨酸肽GGGG-MTX连接至C端的LPETGG序列，从而生成两种类型的单弹头偶联物（图1C）。分选酶A是一种半胱氨酸蛋白酶，可催化LPETGG与GGGG基序之间的转肽反应。该酶首先结合于蛋白质C端的LPETGG基序，随后苏氨酸与甘氨酸之间的酰胺键被水解，形成酶-底物复合物；下一步为硫酯键的氨解反应，其中四甘氨酸基序的甘氨酸残基提供伯氨基作为亲核试剂17。结合上述两种方法，可生成位点特异性的FGF2双弹头偶联物（图1C）。原则上，所提供的偶联方案可成功应用于任何经工程化改造的靶向蛋白，以生成具有选择性的细胞毒性偶联物。此外，该策略的多功能性使其也适用于多种其他蛋白-蛋白或蛋白-肽的连接需求，以及可用于将脂质、聚合物、核酸和荧光基团等分子连接至含有可及巯基（或通过还原天然二硫键而产生）和/或引入了小肽标签的蛋白质上。

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方案

1. Fc结构域与MMAE的偶联

注意：在进行位点特异性偶联之前，需准备关键试剂：高纯度的目标蛋白（本实验中为Fc片段和经改造的FGF2变体，起始用量为1–5 mg重组蛋白，按Sokolowska-Wedzina18），马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄醇（PABC）-单甲基澳瑞他汀E（MMAE）（注意：高细胞毒性试剂，需谨慎操作），三（2-羧乙基）膦‎ （TCEP）和分选酶 A16甲氨蝶呤连接四甘氨酸肽（GGGG-MTX）（注意：MTX 为高细胞毒性试剂，操作时需谨慎）可通过固相肽合成（SPPS）方法中的 Fmoc 策略在固相载体上合成19 或从商业来源获得。

  1. 为了还原 Fc 片段内的二硫键图1)，加入相对于 Fc 蛋白十倍摩尔过量的 TCEP（39 µM) 在 PBS（100 mM NaCl，18 mM NaH2PO4，33 mM Na2HPO4 pH 7.4）并在 37 ℃ 下孵育 ˚C下反应1小时。TCEP储存液应使用0.1 M NaOH调节pH至6.0，以防止因pH变化导致蛋白质沉淀。
  2. 孵育后，使用0.2 µm 滤膜以去除蛋白质沉淀物。
  3. 向新的反应管中加入四倍摩尔过量的 MMAE（将 MMAE 溶于 N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）配制40 mM储备液）加入至蛋白-SH基团中。然后加入相对于Fc蛋白体积两倍的PBS缓冲液。最后加入步骤1.2中获得的还原型Fc片段。
    注意：此步骤中试剂的添加顺序至关重要。
  4. 在15℃下过夜进行偶联反应 ˚在温和旋转条件下进行。这些温和条件可防止蛋白质变性。
  5. 使用 0.2 μm 滤器过滤含偶联物的溶液 µm 滤膜以去除可能的沉淀物。
  6. 进行SDS-PAGE以分析反应效率。使用10%分离胶、10–250 kDa蛋白质标记物，并分析35至50 kDa之间的条带（图2).
    注意：此处可暂停实验流程，反应混合物可于4 °C或-20 °C保存 ˚用于短期储存，或置于 -80 ˚C 用于长期保存。然而，冻融可能导致额外的沉淀，降低偶联物的纯化得率。
  7. 将反应混合物上样至蛋白A偶联的珠子柱中，用含300 mM NaCl、18 mM NaH的洗涤缓冲液1洗去多余的MMAE2PO4，33 mM，Na2HPO4，0.1% Tween 20，2 mM EDTA，pH 7.4。然后用含650 mM NaCl、18 mM NaH的洗涤缓冲液2洗涤柱子2PO4，33 mM Na2HPO4，pH 7.4。
    注意：通过偶联物的Fc区与磁珠上的蛋白A之间的特异性相互作用，偶联物被吸附在柱上，而未反应的MMAE则被洗脱去除。此步骤对于获得高纯度的偶联物至关重要。
  8. 用 0.1 M 柠檬酸钠（pH 3.5）从柱中洗脱 Fc-MMAE 偶联物至含有 1 M Tris（pH 9.0）的 1.5 mL 离心管中（每 1 mL 蛋白质溶液加入 200 μL） µ1 M Tris pH 9.0 溶液
  9. 使用 Sephadex G-25 树脂柱将 Fc-MMAE 脱盐至 PBS（pH 7.4）。此步骤可防止偶联物变性，并使其可用于体外和体内实验。
    注意：此处可暂停本实验方案。
  10. 进行SDS-PAGE（10%）以分析最终的Fc-MMAE偶联物。使用10%分离胶、10–250 kDa蛋白标记物，并分析35至50 kDa之间的条带（图2).

2. 工程化 FGF2 的偶联

  1. 通过分选酶A介导的连接反应将GGGG-MTX与经改造的FGF2的C端LPETGG序列偶联
    1. 使用含G-25树脂的层析柱，将纯化的、含有N端KCKSGG和C端LPETGG序列（本步骤用于偶联）的经改造FGF2转移至分选酶A反应缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，10 mM (NH4)2SO4，5 mM CaCl2）中。用分选酶A反应缓冲液调节蛋白浓度至1 µM。
    2. 将溶于DMAc中的GGGG-MTX肽直接加入蛋白溶液中，使其终浓度为100 µM。
    3. 加入分选酶A至终浓度0.1 µM，在15 °C下轻柔旋转孵育12小时。步骤2.1.1–2.1.3中试剂的浓度主要取决于偶联产物的产率以及靶向蛋白的生化特性（蛋白纯化效率、溶解度和稳定性）。为实现有效的分选酶A反应，建议分选酶A的起始浓度为含LPETGG序列的靶蛋白浓度的十分之一至百分之一，而GGGG-MTX的浓度应为LPETGG标记蛋白浓度的100倍。
    4. 将反应混合物上样至肝素Sepharose层析柱。
    5. 用25 mM HEPES（pH 7.4）洗脱未反应的分子。
    6. 用含2 M NaCl的25 mM HEPES（pH 7.4）洗脱反应产物（FGF2.MTX）。
      注：本步骤可暂停。
    7. 使用SDS-PAGE分析偶联效率。采用15%分离胶、10–250 kDa蛋白分子量标记物，分析15–25 kDa范围内的条带（图3）。
  2. 通过马来酰亚胺-巯基反应将MMAE与经改造的FGF2的N端KCKSGG序列偶联
    1. 使用含Sephadex G-25树脂的层析柱，将含有N端KCKSGG和C端LPETGG序列的经改造FGF2脱盐置换至反应缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.0，10 mM (NH4)2SO4，10 mM甲硫氨酸，0.1 mM EDTA）中。用反应缓冲液调节蛋白浓度至25 µM。
    2. 将MMAE溶于DMAc中，配制40 mM的储存液。
    3. 在新的反应管中，首先加入相对于蛋白-SH基团四倍摩尔过量的MMAE。然后加入相对于FGF2蛋白体积两倍体积的PBS缓冲液。最后加入FGF2蛋白。
      注：本步骤中试剂的添加顺序至关重要。
    4. 在20 °C下轻柔旋转反应1小时。
    5. 将反应混合物上样至羧甲基（CM）-Sepharose层析柱，并用25 mM HEPES（pH 7.4）洗脱未偶联的过量细胞毒性试剂。这些温和条件可防止蛋白变性。
    6. 用含0.5 M NaCl的25 mM HEPES（pH 7.4）从柱上洗脱MMAE.FGF2偶联物。
      注：本步骤可暂停。
    7. 使用SDS-PAGE分析偶联效率。采用15%分离胶、10–250 kDa蛋白分子量标记物，分析15–25 kDa范围内的条带（图3）。
  3. 利用马来酰亚胺-巯基化学与分选酶A介导的连接反应组合制备经改造FGF2的双弹头偶联物
    注：为制备经改造FGF2的双弹头偶联物，需结合步骤2.1和2.2。首先通过马来酰亚胺-巯基化学法生成MMAE.FGF2偶联物（步骤2.2），再利用分选酶A将GGGG-MTX连接至MMAE.FGF2的C端LPETGG标签上（步骤2.1）。反之亦可（先进行分选酶A介导的偶联，再进行马来酰亚胺-巯基反应）。
    1. 使用步骤2.2.1–2.2.7制备单取代的MMAE.FGF2偶联物。
    2. 使用含Sephadex G-25树脂的层析柱，将缓冲液置换为分选酶A反应缓冲液（25 mM HEPES，pH 7.4，150 mM NaCl，10 mM (NH4)2SO4，5 mM CaCl2）。
    3. 按步骤2.1.2–2.1.7所述继续操作。

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结果

本文所述方案介绍了将不同细胞毒性药物偶联到目标蛋白的两种不同策略。此外，还展示了一种联合使用上述策略的方法，可实现位点特异性的双有效载荷细胞毒性偶联物的构建。

如图2所示（第2道与第3道对比），马来酰亚胺-巯基反应可实现MMAE与Fc片段偶联的效率接近100%（由于MMAE的结合导致分子量增加，Fc条带发生明显迁移）。由于Fc片段存在多个潜在的偶联位点，我们尚不能完全排除第3道中存在单一位点和双位点偶联Fc混合物的可能性。为解决这一问题，可进一步通过质谱分析或分光光度法对所得偶联产物进行验证，以确定药物与蛋白的比例，具体方法参见Chen的实验方案20。

采用上述方案，对改造后的 FGF2 变体进行偶联反应也获得了高效率（图 3）。通过 SDS-PAGE 估算，甲氨蝶呤（MTX）经由分选酶 A 介导与改造 FGF2 C 末端 LPETGG 标签的连接产率接近 10...

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讨论

由于人们对设计针对多种癌症类型的特异性治疗药物具有高度兴趣，因此迫切需要开发能够实现将不同载荷特异性地连接到靶向蛋白上的策略。靶向蛋白的位点特异性修饰至关重要，因为它可确保所开发的生物活性偶联物具有均一性，这是现代治疗药物的先决条件。目前已有多种化学和酶学方法可用于将载荷特异性地连接到目标蛋白上。在大多数情况下，这些方法在生成目标偶联物之前需要进行蛋白工程化改造步骤。根据所选方法的不同，蛋白的制备过程可能较为繁琐且成本较高。

本文提供了一种实验方案，展示了两种针对蛋白质进行位点特异性修饰的不同策略（以IgG1的Fc片段和工程化FGF2为例），分别采用化学方法（马来酰亚胺-巯基化学）和酶法（利用分选酶A进行蛋白质连接），这两种方法均具有高效且相对快速的特点。Fc片段是抗体药物偶联物（ADC）策略中治疗性抗体的核心组分，而工程化FGF2是一种经过修饰的生长因子，可特异性靶向FGFRs。此外，本文还提供了一种将两种不同偶联策略相结合的实验方案，以获得携带两种不同载荷分子的靶向蛋白（在本例中为两种不同的细胞毒性药物——MMAE和MTX）。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由波兰科学基金会的“第一团队”（First TEAM）和“重新整合”（Reintegration）项目资助（POIR.04.04.00-00-43B2/17-00；POIR.04.04.00-00-5E53/18-00），上述项目由欧洲区域发展基金（European Regional Development Fund）根据欧洲联盟资助协议共同资助，授予 L.O 和 A.S。M.Z 的工作得到了波兰国家科学中心 OPUS 项目（2018/31/B/NZ3/01656）和 Sonata Bis 项目（2015/18/E/NZ3/00501）的支持。A.S.W 的工作得到了波兰国家科学中心 Miniatura 项目（2019/03/X/NZ1/01439）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CM-Sepharose 柱Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USACCF100
肝素 Sepharose 柱GE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-0407-01
HiTrap 脱盐柱GE Healthcare, Chicago, IL, USAGE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe 柱GE Healthcare, Chicago, IL, USAGE11-0034-93
马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯基丁酸-单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USAHY-100374有毒
N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA185884
三(2-羧乙基)膦（TCEP）Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA646547

参考文献

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