通过马来酰亚胺-硫醇化学与分选酶A介导连接制备位点特异性细胞毒性蛋白偶联物

摘要

本文提供了利用马来酰亚胺-巯基反应和分选酶A介导的连接技术，对蛋白质进行位点特异性偶联细胞毒性药物的详细实验方案。

摘要

癌症目前是全球第二大常见死因。癌细胞的特征是其表面存在特定的标志蛋白，例如生长因子受体。这一特性使得人们能够开发出高度选择性的治疗药物——蛋白偶联物，这类药物由靶向蛋白（抗体或受体配体）通过特定连接子与高细胞毒性的药物连接而成。由于靶向蛋白具有极高的亲和力和选择性，这些偶联物能够识别癌细胞表面的标志蛋白，并通过受体介导的内吞作用进入细胞内部。细胞内的囊泡运输系统最终将偶联物运送至溶酶体，在溶酶体中，蛋白水解作用将游离的细胞毒性药物从偶联物的蛋白质核心上释放出来，从而触发依赖药物的癌细胞死亡。目前已有多种蛋白偶联物被批准用于癌症治疗，同时还有大量候选药物正处于研发或临床试验阶段。

在生物偶联物制备过程中，一个主要挑战是将细胞毒性药物以位点特异性的方式连接到靶向蛋白上。近年来，在开发用于将细胞毒性药物与蛋白进行化学或酶法修饰的策略方面取得了巨大进展。本文提供了两种位点特异性地将细胞毒性弹头分子引入靶向蛋白的详细实验方案：一种是采用马来酰亚胺-巯基化学的化学方法，另一种是依赖于分选酶A介导连接的酶法。我们以成纤维细胞生长因子2的工程化变体以及人免疫球蛋白G的可结晶片段作为代表性靶向蛋白，以单甲基澳瑞他汀E和甲氨蝶呤作为模型细胞毒性药物。所有所述策略均可高效地生成具有明确分子结构、生物活性的细胞毒性偶联物，有望用于多种癌症的选择性治疗。

引言

数十年的科学研究极大地推动了我们对调控癌症发生与进展的分子机制的认识。然而，由于药物缺乏选择性导致的不良反应、肿瘤的高度异质性以及长期治疗后产生的耐药性，目前的治疗手段仍然受到很大限制。近年来，靶向抗癌疗法作为一种新颖且极具前景的方法，受到越来越多关注，可用于治疗多种肿瘤。靶向治疗依赖于精密的药物递送系统，能够将细胞毒性药物精准地输送至癌细胞，同时保护正常细胞。这类系统主要包括多种纳米颗粒、脂质体以及基于蛋白质的药物载体。

癌细胞表面通常会暴露较高水平的特定标志蛋白。抗体药物偶联物（ADC）是一类新型的基于蛋白质的抗癌治疗药物，它将单克隆抗体的高度特异性与药物的强细胞毒性在单一分子中结合起来。一旦结合到癌细胞表面，ADC便通过受体介导的内吞作用进入细胞。随后，ADC通过内体区室被转运至溶酶体，在溶酶体中蛋白酶降解ADC并释放出具有活性的细胞毒性药物。目前，美国已批准八种ADC用于治疗多种肿瘤，包括三阴性乳腺癌、HER2阳性乳腺癌、尿路上皮癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、血液系统恶性肿瘤、霍奇金淋巴瘤和急性髓系白血病。此外，还有大量ADC正处于研发阶段或等待批准¹。值得注意的是，蛋白质工程方法已推动了多种可替代单克隆抗体的蛋白支架及其细胞毒性偶联物的发展，这些包括不同的抗体片段^2,3、DARPins

方案

1. Fc结构域与MMAE的偶联

注意：在进行位点特异性偶联之前，需准备关键试剂：高纯度的目标蛋白（本实验中为Fc片段和经改造的FGF2变体，起始用量为1–5 mg重组蛋白，按Sokolowska-Wedzina¹⁸），马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-p-氨基苄醇（PABC）-单甲基澳瑞他汀E（MMAE）（注意：高细胞毒性试剂，需谨慎操作），三（2-羧乙基）膦‎ （TCEP）和分选酶 A¹⁶甲氨蝶呤连接四甘氨酸肽（GGGG-MTX）（注意：MTX 为高细胞毒性试剂，操作时需谨慎）可通过固相肽合成（SPPS）方法中的 Fmoc 策略在固相载体上合成¹⁹ 或从商业来源获得。

1. 为了还原 Fc 片段内的二硫键图1)，加入相对于 Fc 蛋白十倍摩尔过量的 TCEP（39 µM) 在 PBS（100 mM NaCl，18 mM NaH₂PO₄，33 mM Na₂HPO₄ pH 7.4）并在 37 ℃ 下孵育 ˚C下反应1小时。TCEP储存液应使用0.1 M NaOH调节pH至6.0，以防止因pH变化导致蛋白质沉淀。
....

结果

本文所述方案介绍了将不同细胞毒性药物偶联到目标蛋白的两种不同策略。此外，还展示了一种联合使用上述策略的方法，可实现位点特异性的双有效载荷细胞毒性偶联物的构建。

如图2所示（第2道与第3道对比），马来酰亚胺-巯基反应可实现MMAE与Fc片段偶联的效率接近100%（由于MMAE的结合导致分子量增加，Fc条带发生明显迁移）。由于Fc片段存在多个潜在的偶联位点，我们尚不能完全排除第3道中存在单一位点和双位点偶联Fc混合物的可能性。为解决这一问题，可进一步通过质谱分析或分光光度法对所得偶联产物进行验证，以确定药物与蛋白的比例，具体方法参见Chen的实验方案²⁰。

采用上述方案，对改造后的 FGF2 变体进行偶联反应也获得了高效率（图 3）。通过 SDS-PAGE 估算，甲氨蝶呤（MTX）经由分选酶 A 介导与改造 FGF2 C 末端 LPETGG 标签的连接产率接近 10.......

讨论

由于人们对设计针对多种癌症类型的特异性治疗药物具有高度兴趣，因此迫切需要开发能够实现将不同载荷特异性地连接到靶向蛋白上的策略。靶向蛋白的位点特异性修饰至关重要，因为它可确保所开发的生物活性偶联物具有均一性，这是现代治疗药物的先决条件。目前已有多种化学和酶学方法可用于将载荷特异性地连接到目标蛋白上。在大多数情况下，这些方法在生成目标偶联物之前需要进行蛋白工程化改造步骤。根据所选方法的不同，蛋白的制备过程可能较为繁琐且成本较高。

本文提供了一种实验方案，展示了两种针对蛋白质进行位点特异性修饰的不同策略（以IgG1的Fc片段和工程化FGF2为例），分别采用化学方法（马来酰亚胺-巯基化学）和酶法（利用分选酶A进行蛋白质连接），这两种方法均具有高效且相对快速的特点。Fc片段是抗体药物偶联物（ADC）策略中治疗性抗体的核心组分，而工程化FGF2是一种经过修饰的生长因子，可特异性靶向FGFRs。此外，本文还提供了一种将两种不同偶联策略相结合的实验方案，以获得携带两种不同载荷分子的靶向蛋白（在本例中为两种不同的细胞毒性药物——MMAE和MTX）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CM-Sepharose 柱	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	CCF100
肝素 Sepharose 柱	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-0407-01
HiTrap 脱盐柱	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE17-1408-01
HiTrap MabSelect SuRe 柱	GE Healthcare, Chicago, IL, USA	GE11-0034-93
马来酰亚胺基己酰基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯基丁酸-单甲基奥瑞他汀 E（MMAE）	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA	HY-100374	有毒
N,N-二甲基乙酰胺（DMAc）	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	185884
三(2-羧乙基)膦（TCEP）	Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA	646547