使用DNA进行细胞简单、经济且模块化图案化的技术

摘要

本文介绍一种利用DNA编程黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行微图案化的实验方案。该方案采用台式光刻平台在玻璃载片上构建DNA寡核苷酸的图案，随后使用 commercially available 互补寡核苷酸对细胞膜进行标记。寡核苷酸之间的杂交实现了程序化细胞黏附_。

摘要

细胞之间的相对位置是微环境组织细胞间相互作用的关键特征。为了研究同种或不同类型细胞之间的相互作用，微图案技术已被证明十分有效。DNA程序化细胞组装（DPAC）是一种利用DNA杂交来调控细胞与基底或其他细胞之间黏附的微图案技术。DPAC中最基本的操作首先是在细胞膜上修饰脂质修饰的寡核苷酸，然后将这些细胞流经已用互补DNA序列进行图案化处理的基底。细胞仅在遇到互补DNA序列的位置选择性地黏附于基底，未黏附的细胞被冲洗去除，从而显现出黏附细胞的特定图案。其他操作还包括进一步的细胞-基底或细胞-细胞黏附步骤，以及将DPAC形成的图案转移至包埋用的水凝胶中以实现长期培养。以往，对表面进行寡核苷酸图案化以及在细胞上修饰DNA序列的方法分别需要专用设备和定制化的DNA合成。我们报道了一种更新版的实验方案，采用低成本的台式光刻装置，并使用市售的胆固醇修饰寡核苷酸（CMO），以模块化方式实施。经CMO标记的细胞能够高效地黏附到带有DNA图案的基底上。该方法可用于高精度同时图案化多种细胞类型，并构建嵌入细胞外基质中的微组织阵列。该方法的优势包括高分辨率、能够在不破坏微图案的前提下将细胞嵌入三维微环境，以及在图案化任意细胞类型方面的灵活性。

引言

细胞在组织中彼此之间的空间定位是微环境的一个重要特征^1,2,3,4。将活细胞排列成空间可控结构的技术，是研究细胞分化^4,5,6,7,8、细胞运动性⁹、形态发生^10,11,12、代谢¹³以及细胞间相互作用^7,14的重要实验工具。目前已有多种细胞图案化方法，每种方法各有其优势与局限性^3,4。通过构建细胞外基质（ECM）蛋白的黏附性“岛”区域的方法，如微接触印刷和激光切割掩膜，操作简单且易于扩展。然而，由于不同细胞类型对不同ECM分子的黏附特性往往相似，因此同时排列一种以上细胞类型较为困难^15,16,17。利用光诱导分子吸附（LIMAP）技术可构建更复杂的微图案，该方法使用紫外光消融聚乙二醇（PEG）包被区域，从而允许后续蛋白质吸附^18,19。此过程可重复进行，以实现多细胞类型的高分辨率微图案。然而，细胞可能与不同蛋白区域发生交叉结合，导致图案特异性较差¹⁹。物理方法，例如将细胞接种到可重构的微机械培养装置上，能够实现具有动态控制的有序共培养，但在图案设计灵活性方面不如微接触印刷或LIMAP^14,8。与其他技术不同，生物打印技术可在水凝胶中构建三维细胞排列结构^20,21。然而，生物打印结构的分辨率远低于其他微图案化技术，其特征尺寸通常在数百微米量级²²。理想的细胞图案化方法应具备高分辨率、支持多种细胞类型排列、使用易于获取的设备和试剂，并能将成功的图案嵌入水凝胶中以进行三维（3D）细胞培养。本文介绍CMO-DPAC，这是一种利用DNA杂交的灵活性和快速性来靶向调控细胞在基底上黏附的细胞微图案化技术。该方法在我们先前的实验方案^{23, 24}基础上进行了改进，使其更具成本效益、模块化和可及性。根据本实验方案，任何实验室均可在无需特殊设备或专业技术的情况下建立一套完全功能化的系统。

DNA程序化细胞组装（DPAC）是一种强大的组织工程技术，能够以单细胞分辨率对细胞进行图案化排列，并精确控制细胞间的间距和组织几何结构。在DPAC中，通过使用两种经脂质修饰的寡核苷酸（oligos），使其在细胞膜上杂交，从而将DNA寡核苷酸修饰到细胞膜表面。由于这些寡核苷酸与疏水性脂质共价连接，它们会快速分布至细胞膜²⁵并发生杂交，增加非共价结合分子的整体疏水性，从而延长其在细胞表面的存留时间²⁶。这些寡核苷酸在细胞表面呈现的方式使其能够与其他细胞或DNA功能化玻璃片上的互补寡核苷酸杂交，从而形成具有特定组成、细胞间距和几何构型的二维或三维细胞图案^{23, 24}。所形成的微组织可通过酶解方式从基底上分离，并包埋入水凝胶中进行长期的三维培养。当与原代细胞或干细胞联合使用时，这些细胞集合可经历形态发生过程并形成类器官^23,27,28。DPAC已被应用于研究成体神经干细胞命运在多种信号竞争条件下的动态变化^6,29，探究乳腺上皮细胞的自组织行为^23,28，以及通过间充质细胞聚集生成"组织折纸"结构²⁷。

DPAC 能够精确定位多种细胞群体，其分辨率显著优于基于挤出的生物打印技术（达到微米级）^22,23。此外，与微接触印刷等基于细胞外基质（ECM）的图案化方法不同，DPAC 不需要不同细胞类型在 ECM 包被表面具有差异性黏附能力^15,23。该方法非常适合用于研究组织组成如何影响其行为、细胞在做出决策时如何整合多种细胞及微环境信号^6,29，以及成对细胞之间的相互作用。相较于其他微图案化方法，该技术的一个优势在于可用于单成像平面内的三维细胞培养，便于对组织自组织和类器官形态发生进行延时研究^{23, 27,30}。

尽管具有这些优势，DPAC 的成功实施仍需要合成定制的寡核苷酸试剂，并依赖用于 DNA 图案化的专用设备^23,24，这限制了其广泛应用。例如，原始方案中使用的最佳脂质修饰寡核苷酸（LMOs）必须定制合成，用 二十四烷酸或棕榈酸进行修饰，并经过纯化²⁶。该过程需要使用 DNA 合成仪和高效液相色谱仪，同时需采购甲胺等配套试剂，而甲胺属于受机构和联邦法规管制的物质。作为替代方案，LMOs 可批量定制采购，但这需要在技术上进行较大的前期投入。

为了克服这些局限性，我们开发了一种改进版的DPAC技术，采用 commercially available 胆固醇修饰寡核苷酸（CMOs）替代定制合成的LMOs。为进一步降低成本并提高平台的灵活性，我们改用了一种模块化的三寡核苷酸系统。使用者无需为每一种独特的细胞群体单独订购新的胆固醇修饰寡核苷酸，而是可以在所有细胞群体中使用相同的胆固醇修饰寡核苷酸（"通用锚定链"和"通用共锚定链"），然后使用一种廉价且未经修饰的寡核苷酸（"适配链"），该寡核苷酸可同时与通用锚定链以及细胞表面的氨基功能化DNA或另一种细胞类型的适配链发生杂交。

原始DPAC方案的另一个局限性在于，其通过高分辨率液体打印机（例如Nano eNabler，BioForce Nanosciences）来制备DNA图案化载玻片^23,24。尽管该仪器具有极高的分辨率和较低的试剂消耗量，但大多数机构无法获得，并且其打印速度相对较慢（约每秒生成1个特征图案）。最近，已开发出两种光刻方法用于在表面构建DNA特征图案。Viola及其同事采用了一种聚丙烯酰胺与苯甲酮涂层，在紫外光照射下可将单链DNA寡核苷酸共价固定于表面³⁰。利用该方法，他们成功构建了组织支架，这些支架能够因细胞收缩力和自组织作用而发生大规模、程序化的形状变化。Scheideler等人开发了一种方法，通过紫外光照射正性光刻胶，选择性地将氨基修饰的DNA寡核苷酸暴露于醛基功能化的载玻片表面²⁹。经过烘烤和还原胺化反应后，氨基修饰的DNA被共价结合到表面。该方法已被用于研究成年神经干细胞对空间呈现的自我更新和分化信号的响应。本文采用了Scheideler等人方案的改进版本，以制备可捕获CMO标记细胞的DNA图案。这种光图案化方案无需洁净室即可完成，使用价格低廉且市售可得的设备，可方便地在实验台或通风橱中进行。采用低成本或自制（do-it-yourself, DIY）的光刻设备，提高了缺乏洁净室设施的研究人员对该技术的可及性，使其能够在无需大量时间和资源投入的情况下尝试该技术^31,32。然而，若使用洁净室中常见的商用匀胶机和掩模对准仪，则可以获得更高的分辨率，并实现多个DNA特征图案的精确对准。

本文介绍一种利用基于DNA的黏附技术在单细胞分辨率下对细胞进行图案化的方法。首先，采用正性光刻胶进行光刻，将经胺基修饰的DNA高分辨率图案化至经醛基修饰的玻璃基底上。随后，对载玻片进行处理以减少非特异性细胞黏附，并构建聚二甲基硅氧烷（PDMS）流体池，以将细胞限制在图案化区域。接着，用短链DNA寡核苷酸标记细胞，这些寡核苷酸经胆固醇修饰，因而可插入细胞膜中。然后将细胞流经DNA微图案区域。细胞表面DNA与玻璃表面DNA之间发生杂交，从而使细胞特异性地黏附于DNA图案上。洗去未黏附的细胞后，即可显现出黏附细胞的图案。该过程可重复进行，以实现多种细胞类型的图案化或构建多层结构。如需要，还可将细胞完全包埋于细胞外基质（ECM）中，用于三维细胞培养。

方案

1. 设计实验

1. 规划所需的实验，考虑特征尺寸、特征间距、涉及的细胞类型数量以及细胞之间的相对排列方式。参考补充文件1（实验设计指南）和补充文件2（包含示例寡核苷酸序列）。
2. 使用计算机辅助设计软件设计光掩模。示例光掩模见补充文件3。
   1. 绘制一个标准显微镜载玻片尺寸的矩形（25 mm × 75 mm）。
   2. 在载玻片上均匀分布四个矩形区域，每个区域宽10 mm、长10 mm。
   3. 在每个区域内绘制实验所需尺寸、形状和间距的特征结构。实验中细胞将仅附着于这些特征上。
   4. 若需为多种细胞类型创建对齐的光掩模，请先创建包含所有特征集合的主图，然后保存对应每种细胞类型的版本。
   5. 根据该CAD图纸订购高分辨率（至少20,000 dpi）透明光掩模，其中1.2.3步骤中的特征为透明，其余大区域为黑色。

2. 将DNA光刻至醛基化玻片上（实验方案改编自Scheideler等人的研究²⁹）

1. 若需对多种细胞类型进行图案化，应在醛基化载玻片上进行任何DNA图案化之前制作定位标记，以方便特征对齐。其他创建定位标记的方法见 补充文件 1.
   1. 制作金属定位标记时，按照步骤 2.3 - 2.11 所述方法涂布 S1813 正性光刻胶。使用包含较大特征图案的光掩模，以便后续易于对准。将这些特征图案整合到用于 DNA 图案化的光掩模设计中。
   2. 使用电子束蒸发法在载玻片上沉积一层钛薄膜（100 埃）²⁹用丙酮去除多余的金属和光刻胶，然后进行DNA光图案化。
2. 配制20 µM的5'-氨基修饰寡核苷酸溶液于DNA缓冲液中（50 mM磷酸钠水溶液，pH = 8.5）。参见 补充文件 2 有关建议的寡核苷酸序列。
   注意：某些图案和应用中可使用低至 5 µM 的胺修饰寡核苷酸，因此可能需要优化表面 DNA 浓度。
3. 将加热板预热至 100 °C。
4. 使用双面胶带或真空泵将醛基功能化的玻璃载片固定在旋涂仪的转子上。
   警告：旋涂过程中载玻片脱落存在安全风险。务必在带盖的密闭容器（如亚克力盒）内使用旋涂仪。
   注意：使用金刚石刻笔或类似工具在玻片的一角进行刻痕标记，以便在光刻胶被洗去后识别玻片及确定其方向。
5. 使用一次性移液管将正性光刻胶滴加到醛基化载玻片上。为获得均匀的涂层，应在载玻片表面分散滴加少量光刻胶，而不是在中央滴加一大滴。补充图1A).
6. 使用旋涂仪，以3000 rpm的转速旋转载玻片30秒。
7. 将载玻片置于100 °C加热板上加热1.5分钟（软烘），以交联光刻胶。
8. 从加热板上取下载玻片。将带有本实验所需图案的光掩模放置在载玻片表面，并用一块玻璃压住光掩模以固定补充图1B、C）。将整个装置用不透明盒子罩住（补充图1D）。使用紫外灯照射（波长365 nm，功率360 mW，距离载玻片5英寸，总辐射能量密度100 mJ/cm²）²2分钟
   注意：紫外光会破坏光刻胶在光掩模透明区域下方的聚合物键，从而形成后续可使DNA附着的区域。
9. 将玻片浸入显影液中显影 3-5 分钟（补充图1E).
10. 用水冲洗掉多余的显影液。在气流或氮气流下吹干。补充图1F).
11. 在显微镜下观察载玻片，确认光刻是否成功。由于光刻胶对紫外光敏感，此步骤应迅速完成，随后将载玻片避光保存，以便准备其他载玻片（如适用）。
    注意：成功制备的图案化载玻片应具有清晰的特征边缘，无裂纹，且边缘无特征形变。正确与错误的光刻示例见于 补充图 2A如果光刻未能达到预期的特征质量，请参见表1中的故障排除建议。
12. 将20 µM氨基修饰的寡核苷酸溶液（步骤2.1）的液滴分别加到载玻片的每个光刻区域上。用移液枪头轻轻将液滴均匀铺展至整个区域，注意避免划伤载玻片。补充图1G).
13. 将载玻片置于65-70 °C的烘箱中烘烤，直至DNA溶液完全干燥并附着于载玻片表面（约1 h）。
14. 将经过图案化处理并烘烤的载玻片放入一个15 cm的细胞培养皿中，并置于摇床上，再将培养皿放入通风橱内。称取100 mg硼氢化钠。在通风橱内，加入40 mL磷酸盐缓冲液（PBS），轻轻混匀后倒入盛有图案化载玻片的培养皿中。在轻柔振荡条件下反应15分钟。
    注意：寡核苷酸上的氨基首先与载玻片表面的醛基形成席夫碱。这是一种可逆的共价键，必须在用于DPAC之前转化为不可逆键。加入还原剂（硼氢化钠）通过还原胺化反应将席夫碱转化为仲胺。
    警告：硼氢化钠与水反应会产生氢气，且自反应开始后可连续数小时乃至数天持续释放。还原胺化步骤须在通风橱内操作，并将所有含硼氢化钠的溶液废液置于通风橱内敞口或松盖容器中至少24小时。
15. 用水中含0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）洗涤两次以去除未反应的DNA，随后用蒸馏水洗涤三次。在氮气或空气流下干燥载玻片。
16. 用丙酮冲洗载玻片，以去除残留的光刻胶。
    注意：此时，DNA 已不可逆地共价结合到载玻片上，所有未反应的醛基功能团均已转化为醇基。光刻胶不再需要。
17. 如果需要对多个寡核苷酸进行图案化，返回步骤2.4，利用定位标记对齐光刻掩模，并重复该过程。
    ​注意：实验可在此处暂停。将载玻片存放于真空干燥器中。在干燥条件下，载玻片可保存长达3个月而不影响质量。

3. 使载玻片具有疏水性（可选）（方案改编自 Todhunter 等人²⁴）

注意：对载玻片的表面化学性质进行修饰以使其更加惰性和疏水是有利的，但并非必需。在这些表面上，细胞的非特异性附着会减少³³，从而减轻细胞在载玻片未图案化区域的非特异性结合。此外，如果最终需要将图案化的细胞嵌入水凝胶中并从载玻片上转移下来，则表面处理对于确保载细胞水凝胶在载玻片表面可靠移动而不发生形变或撕裂至关重要。使用（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）二甲基氯硅烷进行硅烷化处理，可在载玻片表面引入疏水性的氟烷基基团。

注意：从步骤 3.1 开始的所有操作均须在化学通风橱中进行，以避免接触乙酸和二氯甲烷蒸气。

1. 用10%乙酸冲洗载玻片，然后在气流下干燥。
2. 在玻璃染色缸中，配制60 mL二氯甲烷、0.6 mL三乙胺和0.6 mL（十三氟-1,1,2,2-四氢辛基）二甲基氯硅烷的混合溶液。用金属刮刀搅拌使其混合均匀。
   注意：这些试剂对水分敏感，应保存在干燥条件下，并尽可能使用新鲜配制的溶液。
3. 将载玻片放入盛有硅烷溶液的染色缸中，将染色缸置于摇床（转速设定为60–80 rpm）上，使硅烷与载玻片反应15分钟。
4. 用金属镊子将载玻片从硅烷溶液中取出，浸入盛有二氯甲烷的染色缸中1分钟，以去除载玻片上多余的硅烷。
5. 将载玻片浸入盛有乙醇的50 mL锥形管中，振荡。再将载玻片浸入盛有蒸馏水的50 mL锥形管中，振荡。
   注意：二氯甲烷与水不互溶，因此在最后用水冲洗前，需用乙醇冲洗以去除残留的二氯甲烷。
6. 从水中取出载玻片并进行检查。载玻片应较为干燥，残留水滴的接触角应大于90°。让载玻片完全干燥，并存放于真空干燥器中，直至使用。
   ​注意：实验可在此处暂停。将载玻片保存在干燥环境中。

4. 准备实验用PDMS流动池和载玻片

注意：使用矩形 PDMS 流动池可将细胞富集到载玻片的图案化区域上。对于在三维条件下培养的实验，流动池可作为水凝胶的模具。

1. 制备用于PDMS流动池模具的SU-8母版。
   1. 将热板预热至95 °C。
   2. 在硅片上加入5 mL SU-8 2075。
   3. 在硅片上进行旋涂：先以500 rpm转速旋转10秒，随后以1,000 rpm转速旋转30秒。此步骤应可形成高达240 µm的结构³⁴。
   4. 将硅片置于热板上软烘至少45分钟。
   5. 从热板上取下硅片。将光掩模（见补充文件4）（乳剂面朝下）放置在硅片上方，并用玻璃圆片压住以确保光掩模与硅片之间充分接触。
   6. 使用紫外光（365 nm）照射，辐射能量密度为350 mJ/cm²。
   7. 将硅片在热板上烘烤12–15分钟。
   8. 将硅片放入宽口玻璃容器中，用SU-8显影液完全覆盖硅片。置于摇床上，持续振荡显影至少15分钟。
   9. 用镊子将硅片从显影液中取出。用喷瓶喷洒更多显影液冲洗5秒，再用异丙醇喷洒清洗。若出现白色沉淀物，则需将硅片重新放回显影液中继续显影更长时间。
   10. 在空气或氮气流下吹干硅片。
   11. 将硅片烘烤5分钟。
       ​注意：一旦母版硅片制备完成，只要其结构保持完整，即可无限次重复使用。
2. 准备PDMS。
   1. 在称量皿中按10:1的质量比加入聚二甲基硅氧烷弹性体和交联剂，充分搅拌以确保混合均匀。
   2. 将PDMS置于真空干燥器中脱气15–30分钟，直至无可见气泡。
   3. 将母版硅片放入15 cm组织培养皿中，将PDMS浇注于硅片表面。若出现气泡，可在真空干燥器中再次脱气数分钟。
   4. 在60 °C烘箱中烘烤3小时。
      ​注意：烘烤完成后，PDMS流动池可在实验台长期保存。
3. 为实验准备PDMS流动池。
   1. 在开始CMO-DPAC实验前不久，从母版硅片上切割出所需数量的PDMS流动池。使用10 cc/min的室内空气进行等离子氧化处理90秒，使表面具有亲水性。
   2. 逐个切割每个流动池，使每侧保留1–2 mm的PDMS，然后切开流动池的顶部和底部，形成进样口和出样口。
   3. 取出在步骤2和3中制备的图案化玻片，将其对齐放置在光掩模上方。
   4. 以光掩模为参考，将PDMS流动池放置在玻片上各图案区域对应的位置。
   5. 向每个流动池的进样口加入50 µL磷酸盐缓冲盐水（PBS）+ 1%牛血清白蛋白（BSA），如补充图1H所示。确认流动池完全被PBS + 1% BSA填充且无大气泡。随后立即进行步骤5和6。
      ​注意：用BSA封闭可最大程度减少细胞在玻片表面的非特异性黏附。

5. 使用胆固醇修饰的DNA对细胞进行标记和分离

1. 制备胆固醇修饰的DNA溶液。
   1. 针对实验中的每组细胞，将3 µL浓度为100 µM的胆固醇修饰通用锚定链储备液与3 µL浓度为100 µM的适配链储备液混合，孵育1分钟，使寡核苷酸预先杂交。加入69 µL磷酸盐缓冲液（PBS），配制成4 µM的通用锚定链+适配链溶液。
   2. 针对实验中的每组细胞，将3 µL浓度为100 µM的通用胆固醇修饰共锚定链储备液加入12 µL PBS中，配制成20 µM的溶液。
2. 制备单细胞悬液。
   1. 对于贴壁细胞，使用胰蛋白酶或其他解离试剂将细胞从培养瓶中脱离，加入培养基以中和胰蛋白酶，并通过离心收集细胞沉淀。对于非贴壁细胞，直接收集细胞悬液并离心获得细胞沉淀。
   2. 将细胞沉淀重悬于1 mL冰浴PBS或无血清培养基中。取100万至300万个细胞转移至1.5 mL微量离心管中，于4 °C下以160 x g离心4分钟。
      注：若所用细胞类型易发生聚集或结团，在所有洗涤步骤中应使用不含钙离子和镁离子的PBS，以减少非特异性细胞聚集。若细胞活力是重点关注问题，建议使用无血清培养基代替PBS。含有胎牛血清的培养基不推荐用于细胞标记，因其可能阻碍脂质修饰寡核苷酸在细胞表面的结合。³⁵
3. 使用胆固醇修饰的寡核苷酸标记细胞。
   1. 将细胞沉淀重悬于75 µL冰浴PBS或无血清培养基中。在整个标记和洗涤过程中，将细胞置于冰上，以最大限度保持细胞活力，并减少胆固醇修饰寡核苷酸从细胞表面脱落。
      ​注：在加入DNA前先重悬细胞，可确保DNA在细胞群体中分布均匀。
   2. 向含有细胞悬液的微量离心管中加入75 µL在步骤5.1.1中制备的4 µM通用锚定链+适配链溶液，通过移液充分混匀，冰上孵育5分钟。
   3. 向微量离心管中加入15 µL通用共锚定链溶液，通过移液充分混匀，冰上孵育5分钟。
   4. 去除细胞悬液中未结合的寡核苷酸。向微量离心管中加入1 mL冰浴PBS或无血清培养基，使用P1000移液器混匀，于4 °C下以160 x g离心4分钟，弃去上清液，重复此洗涤步骤两次。
      注：若细胞易发生聚集，可在最后一次洗涤前将细胞悬液通过40 µm滤膜过滤。若细胞易吸附在微量离心管管壁上，可考虑预先用酪蛋白对管壁进行封闭处理。

6. 对DNA标记的细胞进行图案化

1. 将细胞重悬于预冷的 PBS 或无血清培养基中，制备浓度至少为 2500 万个细胞/mL 的高密度细胞悬液。
   注意：对于使用第 4 步中所述的四个 10 mm × 15 mm × 200 µm PDMS 流通池的载玻片，约需 100 µL 此高密度细胞悬液。尽管大多数细胞不会黏附于图案区域并最终被洗去，但在图案上方使用极高浓度的细胞悬液可显著提高细胞图案化的效率。
2. 拿起载玻片并轻微倾斜。向图案化载玻片上每个流通池的进样口加入 25 µL 细胞悬液。从出样口吸除 PBS + 1% BSA 溶液，使细胞悬液流入 PDMS 流通池中。在冰上或室温下孵育 30 秒。
   注意：此时在显微镜下观察流通池，应可见细胞密集排列，细胞之间几乎无间隙。参见补充图 2B。
3. 从载玻片的出样口吸取 5 µL 细胞悬液，并将其重新加入进样口。每个流通池重复此操作 10 次。
   注意：CMO 标记的细胞与 DNA 图案化载玻片的黏附几乎是瞬时的。多次使细胞流经图案区域可提高细胞流经特定 DNA 位点并被捕获的概率。
4. 用移液器将 PBS 或无血清培养基轻轻加入每个流通池的进样口，以洗去未结合的细胞。从出样口收集细胞悬液。重复清洗 2–4 次，或直至在显微镜下目视确认载玻片上无多余细胞残留。
   注意：保留第一次清洗所得的多余细胞可能具有优势。若图案化效率不理想，可将这些多余细胞离心后重悬于较小体积的 PBS 中，制备更高浓度的细胞悬液，然后从步骤 6.2 重新开始操作。
5. 对图案中的每组细胞重复步骤 6.1–6.4。当使用表面模板直接对多种细胞类型进行图案化时，应先处理丰度最低的细胞类型，最后处理丰度最高的细胞类型。
   ​注意：建议依次进行每一轮细胞组装，而非将细胞混合后一次性处理，即使在所有细胞均标记有正交 DNA 序列的条件下也应如此。混合细胞会有效稀释各细胞亚群，从而降低图案化效率。
6. 完成最后一轮细胞组装后，后续步骤将根据具体实验而定。若细胞需保留在玻片上，可向含有载玻片的培养皿中加入培养基，然后用镊子轻轻推动 PDMS 流通池，使其从载玻片上脱离。若需将细胞包埋于水凝胶中进行三维培养，则进入步骤 7。

7. 转移至水凝胶进行三维培养（可选）

1. 配制含有2% DNase的水凝胶前体溶液。
   ​注意：溶液的成分将根据实验设置的不同而有所变化。在此方案中，Matrigel 以及 Matrigel 与胶原蛋白 I 的混合物效果良好，但也可使用其他水凝胶。
2. 向每个流动池的入口处加入50 µL含2% DNase的水凝胶溶液。从出口处吸除多余液体，使水凝胶溶液流入流动池内。对于黏稠的水凝胶前体溶液，可轻微倾斜载玻片以促进水凝胶流入流动池。
3. 将载玻片在 37 °C 下孵育 30–45 分钟（根据水凝胶凝胶动力学确定），以使水凝胶固化，并裂解细胞与表面之间的基于 DNA 的黏附。
4. 从载玻片上取下每个流动池，并置于水凝胶前体溶液上方。
   1. 向2孔板或6孔板的孔中加入50 µL水凝胶前体。
   2. 在每个流动池的两侧各加入10 µL PBS。
   3. 使用剃须刀片或尖头镊子将 PBS 沿流路池全长均匀分布，然后轻轻抬起流路池的两侧，使 PBS 迅速流至水凝胶下方。
      注意：这将 "漂浮" 在载玻片上均匀铺展水凝胶，实现无变形或撕裂的转移。
   4. 使用剃须刀片轻轻将流动池移至玻片边缘。
   5. 将载玻片倒置。用刀片轻轻推动流动池，使其脱离载玻片并落在刀片上方。
   6. 用弯头镊子从刀片上取下流动池。将流动池翻转，使细胞面朝下，然后置于水凝胶前体溶液液滴上方。
   7. 对每个流式池重复步骤 7.4.1 - 7.4.6。
5. 孵育至少30分钟，使含有图案化细胞的水凝胶与底层水凝胶结合，从而实现图案化细胞的完全包埋。
6. 移除PDMS流动池。
   1. 加入足够的培养基以浸没PDMS流动池。
      ​注意：培养基的流入会削弱水凝胶与PDMS流动池之间的粘附力。
   2. 使用弯头镊子，沿流室的长轴方向放置，轻轻推动流室，直至其脱落并漂浮于培养基中。用镊子拾取流室并弃置。
      ​注意：为了获得最佳效果，应撑开弯头镊子，并对PDMS流动池的壁施加轻柔压力。施力方向应沿流动池的长轴方向。

8. 确认细胞CMO标记成功（可选，用于故障排查）

1. 订购一段经荧光标记（FAM 或 AF647）的寡核苷酸，该寡核苷酸需与实验中所用接头链（Adapter Strand）的表面粘附序列互补。
2. 按照步骤 5 所述方法，用 CMO DNA 标记细胞，并洗去多余的 DNA。将细胞重悬于 200 µL 冰冷的 PBS 中。
3. 用 PBS 配制浓度为 4 µM 的荧光标记互补寡核苷酸溶液。向细胞悬液中加入 200 µL 该溶液，在冰上孵育 5 分钟。
4. 加入 1 mL 冰冷的 PBS，混匀。离心收集细胞沉淀，弃去上清液。重复此洗涤步骤两次，以去除未发生杂交的 DNA。
5. 进行分析性流式细胞术，以定量检测细胞表面 DNA 的存在情况。
   1. 使用流式细胞仪分析未用 DNA 标记的对照细胞，并根据该细胞群设置门控。
   2. 分析经荧光标记互补寡核苷酸处理的 CMO 标记细胞。
   3. 计算平均荧光强度。

结果

本方案能够以高精度在二维和三维中对细胞进行图案化，且无需使用定制试剂或昂贵的洁净室设备。图1展示了该方案的总体流程。首先，通过光刻技术制备DNA功能化的载玻片；接着，用CMO标记细胞；然后将细胞溶液流经载玻片，细胞仅会附着在载玻片上具有DNA功能化的区域；洗去未结合的细胞后，即可获得目标细胞图案。这些细胞可在载玻片上继续培养，或嵌入含有DNase的水凝胶中并从载玻片上转移下来，用于三维细胞培养。

使用 CMO 对细胞进行标记，可使其附着于 DNA 图案化载玻片上（图 2）。首先，将胆固醇修饰的通用锚定链与适配链进行预杂交。随后，将通用锚定链 + 适配链溶液与细胞悬液按 1:1 混合。通用锚定链 + 适配链复合物上的胆固醇插入细胞膜中。加入可与通用锚定链杂交的胆固醇修饰通用共锚定链，可通过增加复合物的总体疏水性，提高 CMO 复合物在细胞膜中的稳定性²⁶。在洗去细胞悬液中过量的 DNA 后，将细胞流经载玻片表面。适配链与表面 DNA 链之间的杂交作用使细胞附着于载玻片上的 DNA 图案区域。

通过光刻技术限制胺基修饰的DNA寡核苷酸在醛基修饰的玻璃载玻片特定区域上的附着，从而形成细胞的排列模式²⁹（图3A）。首先将正性光刻胶旋涂在醛基功能化的载玻片上，然后在其表面放置透明光掩模，并用紫外光照射载玻片。显影后，被紫外光照射的区域不再被光刻胶覆盖，因而暴露出醛基。随后将20 µM的胺基修饰DNA寡核苷酸溶液滴加到载玻片上，并使其扩散覆盖图案化区域。经过烘烤和还原胺化反应，胺基修饰的DNA与载玻片之间形成共价键。值得注意的是，该过程可重复进行，以实现多种寡核苷酸的图案化，且先前图案化的寡核苷酸功能不受影响（图3B）。然而，应避免图案重叠，否则会导致两种寡核苷酸共存于同一区域，浓度降低（补充图3）。通过使用模块化结构域（靠近3'端的20个碱基）不同的适配链，可依次对多个细胞群体进行图案化。

尽管该光刻图案化方案最初由Scheideler等人在洁净室环境中开发，但我们已证明，使用一种廉价的“自制”光刻装置即可获得类似结果，该装置可轻松置于化学通风橱内。该装置包括一个由直流电机、数字控制器和CD光盘盒制成的400美元匀胶机，以及一个由分立元件组装并安装在改造过的锐器盒中的紫外灯（补充图1）。这种自制光刻装置的主要优势在于成本极低（所有设备总价<1000美元），同时仍能制造出单细胞尺度的微结构。然而，使用廉价设备也存在局限性——例如，在没有掩模对准仪的情况下，精确对准基准标记以实现多种DNA寡核苷酸的图案化会更具挑战性。我们推荐该低成本光刻装置适用于那些无法便捷使用洁净室、或希望在不进行大额投入的情况下尝试该方法的实验室。

为了确定DNA编程细胞黏附的最佳条件，我们系统地改变了细胞表面DNA链的浓度，并测量了细胞在DNA修饰玻璃表面黏附的效率。在标记溶液中，通用锚定链+适配链（Universal Anchor + Adapter Strand）和通用共锚定链（Universal Co-Anchor）的浓度被设定为跨越多个数量级的变化范围。图 4A，B），得到10⁴ - 10⁶ 每个细胞中的DNA复合物（补充图4）。细胞黏附呈剂量依赖性，当细胞标记的CMO浓度为0.05 µM或更低时，细胞在DNA图案上的黏附最少；而在2.5 µM及以上浓度时则黏附占据率较高。因此，在大多数实验中，我们使用2 µM的通用锚定链+适配链溶液和2 µM的通用共锚定链溶液。若玻璃表面所用DNA的量减少，预计细胞黏附也会随之降低²⁹ 或者当接头链与表面链之间的错配增加时。有关接头链序列设计的更多信息见于 补充文件 2使用不含CpG重复序列的接头链进行CMO标记不会在表达小鼠TLR9的HEK细胞中激活TLR9 (补充图5).

我们提供了多个示例，证明修订后的方案可实现可重复且高效的DNA程序化细胞黏附。例如，用CMO标记的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）能够高效地黏附于DNA图案表面。CMO标记的HUVECs与LMO标记的HUVECs表现出相当的黏附能力（图5A). 使用CMO-DPAC图案化的细胞保持了其活力和功能。用CMO标记的细胞经钙黄绿素AM和碘化乙啶均二聚体染色以评估细胞活力（补充图6）。与未标记的对照细胞相比，细胞活力的差异较小（94% vs 97%）。通过CMO-DPAC图案化并转移至Matrigel中的单个MDCK细胞在培养5天后能够正常增殖并正确极化。图5B）。DPAC 还提供了一种将细胞模式扩展至三维的方法（图 5C）。例如，通过交替使用带有互补细胞膜标记物（CMO）的细胞层，可形成多层多细胞聚集体（图5C这些实验表明，该方案具有可重复性，不会对细胞活力或功能产生负面影响，并能在三维细胞外基质中于单一成像平面内成功培养出细胞图案。

通过提供正交的DNA序列以引导细胞黏附，DPAC实现了在同一表面上对多种细胞类型进行图案化。为了实现DPAC的这一功能，必须将光刻生成的DNA图案相互对齐。沉积在载玻片上的金属对准标记可用于多个光掩模的对准，从而实现多种细胞类型的同时图案化。用不同特异性染料标记的MCF10A细胞被连接上正交的CMO，并进行图案化，以构建出加州大学伯克利分校（UC Berkeley）和加州大学旧金山分校（UCSF）的标志图像（图6）。该实验表明，多种不同的细胞群体可以高精度地共同图案化，且无交叉污染。

使用 CMO-DPAC 成功实现细胞图案化需要高质量的光刻技术、细胞表面足够浓度的寡核苷酸、图案上较高的细胞密度以及充分的洗涤。上述任一步骤失败均会影响最终结果。补充图2展示了正确与错误光刻的示例图像（补充图2A）、为获得完全占据图案所需的理想细胞密度（补充图2B）、在 DPAC 后续步骤中因移液过于剧烈导致图案化细胞丢失（补充图2C）以及细胞发生非预期聚集的情况（补充图2D）。表1列出了常见失败环节及相应的建议解决方案。建议使用荧光互补寡核苷酸作为故障排查工具，通过流式细胞术确认载玻片上是否存在图案化 DNA 以及细胞表面是否存在 CMO（见实验方案第8步）。

图 1：CMO-DPAC 实验流程概览。首先，通过在醛基功能化的玻璃载片上涂覆正性光刻胶，覆盖所需图案的透明掩膜，并暴露于紫外光下，制备出DNA图案化载片。经紫外光照射的光刻胶用显影液洗去，暴露出醛基载片的特定区域，从而允许胺基功能化的DNA与表面结合。随后，将细胞用CMOs标记并流过该表面。细胞膜上的DNA与表面的DNA发生杂交，从而实现细胞黏附。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：细胞通过CMO以逐步过程进行标记。 首先，将胆固醇修饰的通用锚定链与适配链预先杂交。接着，将通用锚定链+适配链溶液与细胞悬液混合。通用锚定链+适配链复合物上的胆固醇插入细胞膜中。孵育后，向细胞悬液中加入胆固醇修饰的通用共锚定链，该链与通用锚定链杂交并插入细胞膜。第二个胆固醇分子的加入增加了DNA复合物的整体疏水性，从而使其在膜内更加稳定²⁶。洗去多余的DNA后，将细胞浓缩并加入到图案化表面顶部的PDMS流动池中。适配链的3'端与载玻片上的表面DNA链杂交，导致细胞特异性地黏附于修饰有互补DNA的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：使用光刻技术制备DNA图案化载玻片，以最终控制细胞的位置。（A）光刻过程概述。将带有醛基功能化的载玻片通过旋涂法覆盖一层正性光刻胶。紫外光透过透明光掩膜照射到载玻片上，光掩膜在需要细胞黏附的区域是透明的。显影后，先前暴露于紫外光的区域暴露出醛基。随后将20 µM的氨基功能化DNA寡核苷酸溶液滴加到载玻片上，并覆盖图案化区域。将载玻片烘烤以促进氨基与醛基之间形成席夫碱（C=N），这是一种可逆的共价键²⁹。接着在PBS中用0.25%硼氢化钠进行还原胺化，将席夫碱还原为仲胺，从而在DNA与载玻片之间形成不可逆的共价键。剩余的光刻胶可通过丙酮冲洗去除。（B）该过程可重复进行，以构建多组分DNA图案，从而开展涉及多种细胞群体的实验。（i）在完成第一种寡核苷酸的图案化后，再次在载玻片上涂覆光刻胶，并按前述步骤进行操作。使用对准标记对光掩膜进行精确对齐，对于多条DNA链的图案化至关重要。（ii）每种待图案化的细胞类型在其适配链（Adapter Strand）的20碱基模块化区域上有所不同。通过使用正交互补的寡核苷酸组，可在无交叉黏附的情况下实现多种细胞类型的图案化。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：CMO标记细胞对DNA图案的黏附性随标记过程中CMO浓度的增加而增强。 在本实验中，通用锚定链+适配链（预先杂交）与通用共锚定链以相等浓度使用。浓度指细胞悬浮液中进行细胞CMO标记时CMO的浓度。（A）CMO标记的MCF10A细胞占据15 µm直径DNA点位的百分比随细胞标记过程中CMO浓度变化的定量分析。数据表示为三次实验的平均值±标准差。（B）不同CMO浓度下DNA图案（品红色）与黏附的MCF10A细胞（青色）的代表性图像。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：CMO-DPAC 可用于构建二维细胞图案，随后可将这些图案包埋于三维水凝胶中进行培养，或逐层叠加形成多层结构。（A）CMO标记的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与LMO标记的HUVECs在黏附于线性DNA图案上的直接比较。两种细胞标记方法均实现了接近100%的DNA图案占据率。（B）表达H2B-RFP的单个Madin-Darby犬肾细胞（MDCKs）被图案化至直径15 µm、间距200 µm的点上，随后包埋于Matrigel中。培养120小时后，所形成的上皮样囊肿经固定并用E-钙黏蛋白、肌动蛋白和IV型胶原进行染色。白色框内的球状体被放大显示。比例尺 = 50 µm。（C）通过使用互补的适配链对不同细胞群体进行标记，并依次进行图案化，可使每一轮新增的细胞黏附至前一层细胞之上，从而构建多层细胞结构。（i）依次图案化细胞群体以构建多层结构的示意图。（ii）利用该方法构建了MCF10A细胞（通过染料可视化）的三层细胞聚集体。比例尺 = 50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6：可对多种细胞类型进行图案化，且无交叉污染或黏附力丧失。 多种胺基修饰的DNA寡核苷酸被依次图案化到醛基载玻片上，并通过金属定位标记实现对齐。三群MCF10A细胞（青色、品红色、黄色）用带有互补CMO标记的独特染料染色后，被图案化到载玻片上，最终形成加州大学伯克利分校和加州大学旧金山分校标志的图像。比例尺为1 mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：台式光刻装置的示例图像。（A）置于匀胶机上的载玻片，已覆盖正性光刻胶，匀胶前状态。（B）透明光掩模的照片。（C）曝光过程中，光掩模夹在涂有光刻胶的载玻片与玻璃圆盘之间。（D）紫外灯外壳由一个改造过的锐器盒制成。（E）载玻片浸入显影液中。（F）显影后的载玻片。（G）将氨基修饰的DNA溶液涂布于载玻片的图案化区域。（H）将PDMS流体池放置在载玻片的图案化区域上方。 请点击此处下载该文件。

补充图2：本实验方案常见失败情况的若干示例。（A）（i）紫外曝光前烘烤不足或曝光后显影过度，可能导致图案边缘不平整，且尺寸不规则。（ii）一个光刻图案化效果良好的载玻片示例，其特征边缘清晰、特征尺寸均一，且图案中无明显裂纹。比例尺 = 50 µm。（B）细胞密度对图案化效率至关重要。在显微镜下观察图案表面的细胞时，细胞之间应几乎无间隙，如左侧示例图像所示。比例尺 = 50 µm。（C）图案化后的细胞可能对因移液操作过于剧烈而产生的流体剪切力敏感，这可能导致细胞损伤或脱落。多层细胞聚集体尤其脆弱，因为底部单个细胞需支撑上方多个细胞组成的结构。（i）成功嵌入Matrigel中的细胞聚集体阵列。（ii）因移取黏稠Matrigel时操作过于剧烈，导致细胞聚集体阵列脱落。（D）细胞可能发生团聚现象，尤其是上皮细胞。这些团块通常为同型聚集，但如果细胞黏附性较强，也可能出现异型聚集（即细胞黏附到已图案化的其他类型细胞上）。图像显示将三种不同群体的MCF10A细胞图案化至由三种不同单细胞尺寸DNA点（15 µm）组成的阵列上。大多数DNA点上有2–4个细胞附着。团聚问题可通过EDTA处理或在图案化前过滤去除团块来解决。比例尺 = 100 µm。 请点击此处下载该文件。

补充图3：重叠的光刻图案导致两种寡核苷酸以较低浓度共存。 两种正交的氨基修饰寡核苷酸被依次进行光刻，首先是一条垂直线（链1），随后是一条与之重叠的水平线（链2）。通过与荧光标记的互补寡核苷酸杂交来可视化寡核苷酸的分布。(A) 链1的荧光图像。(B) 沿跨越重叠区域的100 µm垂直线对链1荧光强度分布的定量分析。(C) 链2的荧光图像。(D) 沿跨越重叠区域的100 µm水平线对链2荧光强度分布的定量分析。比例尺 = 50 µm。 请点击此处下载该文件。

补充图4：细胞表面DNA复合物数量随CMO标记浓度变化的定量分析。 HUVECs细胞用不同浓度的CMO溶液进行标记，洗涤后与荧光标记的互补链孵育。使用MESF（可溶性荧光染料等效分子数）微球试剂盒进行定量流式细胞术分析，以评估细胞表面DNA复合物的数量随标记过程中CMO浓度的变化情况。 请点击此处下载该文件。

补充图5：CMO标记不会激活TLR9反应。 本实验旨在检测CMO标记是否会触发TLR9的DNA识别机制，以及Adapter Strand序列中的CpG是否会影响该反应。将表达小鼠TLR9的HEK细胞分别与以下物质在37°C下孵育过夜：0.2 µM的ODN 1826（含CpG的TLR9激动剂）、含有与ODN 1826相同序列的CMO通用锚定链 + 通用共锚定链 + Adapter Strand（CMO-CpG），或含有相似序列但将CpG替换为GpC的CMO通用锚定链 + 通用共锚定链 + Adapter Strand（CMO-GpC）。TLR9的激活将导致SEAP（分泌型胚胎碱性磷酸酶）的产生。通过比色法（吸光度）定量检测SEAP的分泌量。实验组处理结果与仅用PBS处理的静息细胞进行比较。结果显示，CMO-GpC孵育未引起TLR9激活；CMO-CpG组的信号略高于静息细胞，但显著低于ODN-1826组。 请点击此处下载该文件。

补充图6：CMO标记过程后细胞的活力。 为评估该方案对细胞活力的影响，将HUVECs分为四组：一组在冰上放置1小时，一组用PBS模拟标记但经历所有离心和洗涤步骤，一组用CMO进行标记，另一组用CMO标记后通过40 µm滤器过滤以去除细胞团块。随后用钙黄绿素AM和碘化丙啶均二聚体对细胞染色，以评估活细胞和死细胞的数量。所有处理组的细胞活力均显著低于冰上对照组（经Tukey多重比较检验的一-way ANOVA分析），但CMO标记组（无论是否过滤）的中位细胞活力约为94%。数据来自三次独立实验。* = p < 0.05。**** = p < 0.0001 请点击此处下载该文件。

结果	可能原因	建议解决方案
光刻——特征结构出现裂纹	软烘不均匀或不充分	将软烘时间延长至最多3分钟；确认热板实际温度，并根据需要提高温度
光刻——特征结构边缘不清晰或内部残留光刻胶	显影不足	延长载玻片在显影液中的时间；加入轻柔震荡
光刻——载玻片上特征结构不一致	紫外光可能未对准或聚焦不良	调整紫外光装置，确保获得强度均匀的准直光
细胞无法高效黏附到图案化位点	表面DNA量不足	通过将载玻片与荧光标记的互补寡核苷酸杂交并在显微镜下成像，确认表面是否存在DNA
	细胞CMO标记不充分	向细胞悬液中加入荧光标记的互补寡核苷酸，并通过流式细胞术确认荧光信号
	覆盖图案的细胞数量不足	通过冲洗PDMS流动池收集细胞，离心后重悬于较小体积中以浓缩细胞
	细胞悬液中残留过多CMO，与载玻片上的DNA发生杂交	增加一次洗涤步骤。每次洗涤时务必尽可能去除上清液
	由于时间和温度导致CMO被细胞过度内吞	标记细胞后应尽快操作；将细胞和载玻片置于冰上，并使用预冷试剂
细胞成团	胰蛋白酶消化过程中细胞未充分分散	在细胞洗涤过程中使用含0.04% EDTA的PBS；在最后一次洗涤前，将细胞悬液通过35 µm滤膜过滤
细胞发生非特异性黏附	若仅发生在某一特定区域——可能是载玻片有划痕、PDMS流动池未对准，或DNA溢出至图案区域外	避免产生划痕，小心对齐PDMS流动池与图案区域
	若细胞在各处均发生黏附——封闭或洗涤不充分	在细胞图案化后增加洗涤次数；洗涤时更用力吹打；在开始细胞图案化前使用1% BSA更长时间封闭；进行载玻片硅烷化处理（可选步骤3），或通过测量水滴接触角确认硅烷化是否成功
流动池内形成气泡	移液操作失误，或等离子体氧化过程中形成的亲水表面不均匀	若气泡较小，可在流动池入口加入PBS，使其被冲洗出去；若气泡较大，可对PDMS流动池施加轻柔压力，推动气泡向入口或出口移动
细胞最初黏附于图案，但在洗涤、其他细胞类型图案化或加入水凝胶前体时被洗脱	移液过于剧烈产生的剪切力可能导致细胞从表面脱落	在后续洗涤、多轮细胞图案化或加入水凝胶前体时，移液动作应更加轻柔。由于水凝胶前体黏度较高，更容易导致图案脱落，因此需格外小心。多层结构通常重心偏高，更易被移除
三维转移过程中组织发生形变	水凝胶黏附在载玻片上	通过接触角测量确认载玻片的疏水性
		使用刀片将PDMS两侧完全抬起，使PBS能够流入组织下方并浮起组织
		纯胶原蛋白水凝胶可能出现此情况——可考虑调整水凝胶的蛋白浓度或组分
	细胞未随水凝胶转移而残留在载玻片上	提高Turbo DNA酶浓度或延长孵育时间
	水凝胶固化不充分	延长孵育时间，和/或优化该水凝胶的凝胶化机制（例如，对于胶原蛋白，确保pH值正确）
	移除PDMS时水凝胶撕裂	实验开始前使用等离子体氧化使PDMS流动池变为亲水性，以便加入培养基后易于分离。使用镊子时动作要非常轻柔，以分离PDMS

表1：本实验方案可能出现问题的故障排除指南。 特别是细胞在图案上贴附不良可能由多种原因引起，本指南有助于识别并解决此类问题。

补充文件 1。请点击此处下载该文件。

补充文件 2。 请点击此处下载该文件。

补充文件 3。请点击此处下载该文件。

补充文件 4。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种用于体外细胞培养实验的二维和三维高分辨率细胞图案化详细方案。与此前发表的该方法版本不同，本文所述方案更注重实用性：无需使用高度专业化的设备，所有试剂均可从供应商处直接购买，无需自行定制合成。与其他细胞微图案化方法不同，该方法操作快速且不依赖细胞类型：无需细胞特异性地黏附于细胞外基质蛋白¹⁵。通过CMO-DPAC图案化的细胞可包埋于Matrigel或胶原蛋白等细胞外基质中，形成三维培养体系，其空间分辨率远高于目前基于挤出打印的方法所能达到的水平²²。CMO-DPAC可在每张载玻片上生成数百至数千个微观结构，从而实现高通量的重复实验。

该方案成功最关键的参数之一，是添加到图案化载玻片上方流动池中的细胞密度。理想情况下，细胞密度应至少达到2500万个细胞/mL。当此密度的细胞被加载至流动池时，可在图案上方形成近乎紧密排列的单层细胞补充图 2B）。这些高细胞密度可最大程度地提高细胞直接沉降到DNA点样区域上方并黏附的概率。降低细胞密度会降低整体的图案化效率。本方案中的另一个关键步骤是在加入CMO溶液前，将细胞在PBS或无血清培养基中充分重悬。CMO会非常迅速地嵌入细胞膜，若将CMO溶液直接加入细胞沉淀中，会导致细胞标记不均一。在将CMO溶液加入细胞悬液后，必须通过移液充分混匀，以确保细胞被均匀地标记上CMO。孵育结束后，必须通过多次离心和洗涤步骤彻底去除多余的CMO。细胞悬液中残留的游离CMO会与玻片上图案化的氨基修饰DNA结合，从而阻碍悬浮液中CMO修饰细胞的杂交与黏附。时间也是本方案中的一个关键因素。使用CMO时应尽可能快速操作，并将细胞保持在冰上，以最大限度减少CMO的内化并维持细胞活力。流式细胞术实验表明，CMO在细胞表面的存留时间较LMO短，在冰上孵育两小时后，CMO复合物会有25%的损失。³⁶此外，随着细胞操作时间的延长，细胞活力会逐渐降低。为最大限度地保持细胞活力，应快速操作，将细胞置于冰上，使用预冷的试剂，并采用无血清培养基以提供一定的营养成分。

尽管CMO-DPAC可通过高精度的细胞图案化来研究细胞生物学，但它也存在一定的局限性。CMO-DPAC实验可能具有挑战性，特别是当实验复杂性增加，涉及多种细胞类型、多层结构或三维细胞培养时（补充文件1）。如 表1所述，在初次开展本实验方案时，实验失败的情况较为常见。因此，我们建议用户实施质量控制检查（确认载玻片上存在DNA、确认细胞已充分标记DNA（步骤8）、确认过量细胞已被彻底洗去等），以确保实验成功，并识别可能需要进一步优化的步骤。我们希望本文及补充文件中提供的信息有助于完成必要的故障排查。

胆固醇是一种生物活性分子，其内化可能影响细胞代谢、基因表达和膜流动性^37,38。先前一项研究利用单细胞RNA测序比较了CMO标记细胞与LMO标记细胞在基因表达上的影响。与未标记细胞和LMO标记细胞相比，CMO标记的HEK细胞表现出差异化的基因表达³⁶。与未标记对照组相比，使用CMO标记细胞导致8个基因出现差异表达（> 1.5倍），其中包括与胆固醇和鞘脂转运相关的AP2B1基因（GeneCards），以及可调控胆固醇积累的长链非编码RNA MALAT1³⁹。尽管这些转录水平的变化较为轻微，但如果实验涉及细胞代谢、膜动态或其他与胆固醇相关通路的研究，这些变化仍可能引起关注。

本方案具有灵活性，可根据每个实验的具体需求进行调整。由于CMO是插入脂质膜中而非依赖任何特定受体，因此该方法不依赖于细胞类型（本文已验证了HUVECs、MCF10As、HEKs和MDCKs）。尽管胆固醇与我们先前发表的LMOs所使用的疏水锚不同，但迄今为止我们发现它们的行为相似。因此，我们预期CMOs可在之前使用LMOs验证过的多种细胞类型中均能有效工作，包括但不限于神经干细胞、成纤维细胞、外周血单个核细胞、肿瘤细胞以及原代乳腺上皮细胞^{6,23,27,29,36}。CMO标记不会激活TLR9，表明该方案适用于免疫细胞。CMO在膜上的整合程度取决于细胞总体大小以及细胞糖萼所带负电荷的程度³⁵。因此，我们提供了一个可用于快速优化的膜整合程度检测方案（步骤8）。每种细胞图案的具体特征将不可避免地因实验设计而异（详见补充文件1以获取更多指导）。尽管推荐采用上述用于DNA图案化的光刻图案化方案，但任何能够实现胺基-DNA溶液液滴空间限制的方法均可适用，例如使用高分辨率液滴打印机。图案分辨率和最小特征间距将因所用方法的不同而有所差异。理论上，也可将本方案中的DNA光刻图案化部分与其他已用于DNA标记细胞的方法相结合，例如利用与膜表达锌指蛋白杂交的DNA⁴⁰、使用NHS偶联的DNA⁴¹，或通过细胞表面的叠氮唾液酸残基与膦偶联DNA发生反应⁴²。CMO-DPAC可应用于多种需要精确控制细胞间间距的实验，包括研究成对细胞之间的相互作用、共培养实验中从"发送者"细胞向"接收者"细胞的信号传递，以及邻近细胞外信号对干细胞分化影响的研究^6,29。该方法还可用于构建微组织，以研究三维环境中的细胞迁移、细胞自组织形成组织的过程^23,27，以及细胞与细胞外基质（ECM）之间的动态相互作用²⁷。我们希望本方案能为研究人员在各自实验室中探索基于高分辨率DNA的细胞图案化新技术应用提供一个便捷的平台。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带不可拆卸小室的2孔腔室盖玻片	Thermo Fisher Scientific	155379
乙酸	Sigma-Aldrich	A6283
外螺纹为SM1、内螺纹为SM3的转接头	ThorLabs	SM3A1
醛基功能化载玻片	Schott	Nexterion Slide AL	开封后需在干燥条件下保存。
全塑料注射器，1 mL	Fisher Scientific	14-817-25
胺基修饰的DNA寡核苷酸	IDT	n/a	推荐序列见补充文件1。
非球面聚光镜	ThorLabs	ACL7560
硼硅酸盐圆盘，直径6英寸，厚度1/2英寸	Chemglass	CG-1906-23
细胞培养皿，60×15 mm规格	Corning	353002
胆固醇修饰的寡核苷酸	IDT	n/a	推荐序列见补充文件1。
金刚石刻划笔	Excelta	475B
DNA寡核苷酸	IDT	n/a	推荐序列见补充文件1。
不含钙、镁的DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250
异丙醇	Sigma-Aldrich	278475
生长因子减少型Matrigel基质胶	Corning	354230
二氯甲烷（稳定化/ACS认证）	Fisher Scientific	D37-4
MF-321显影液	Kayaku Advanced Materials	n/a
Microposit S1813正性光刻胶	Kayaku Advanced Materials	n/a
Ø3" 可调镜头管，行程0.81"	ThorLabs	SM3V10
烘箱	Thermo Scientific	51-028-112H
PE-50紧凑型台式等离子清洗系统	Plasma Etch	PE-50
光掩模（定制）	CAD/Art Services	n/a	CAD/Art Services保证的最小特征尺寸为10微米。
剃须刀片	Fisher Scientific	12-640
RCT Basic加热板	IKA	3810001
硅晶圆（100 mm）	University Wafer	590
硼氢化钠，98%，颗粒状	Acros Organics	419471000
旋涂仪套件	Instras	SCK-200	这是一种低成本选择，但任何能够维持3000 rpm转速的旋涂仪均可使用。
SU-8 2075	Microchem	Y111074 0500L1GL
SU-8显影液	Microchem	Y020100 4000L1PE
Sylgard 184硅弹性体套件	Dow	2646340
注射器针头	Sigma-Aldrich	Z192341
T-Cube LED驱动器，最大驱动电流1200 mA	ThorLabs	LEDD1B
十三氟-1,1,2,2-四氢辛基二甲基氯硅烷	Gelest	SIT8170.0
三乙胺	Sigma-Aldrich	90335
Turbo DNase	Thermo Fisher Scientific	AM2238
镊子型号N7	VWR	100488-324	这些镊子的弯曲形状对于精细拾取含有图案化组织的PDMS流体小室至关重要。
紫外LED（365 nm，190 mW（最小值）安装式LED，700 mA）	ThorLabs	M365L2
晶圆镊子	Agar Scientific	T5063
WHEATON Dry-Seal真空干燥器	Millipore Sigma	W365885