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基于电穿孔的Odonata目昆虫RNA干扰方法

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DOI：

10.3791/61952

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2021年2月6日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, The University of Tokyo, 2Bioproduction Research Institute, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST), 3Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

本文内容

摘要

我们提供了一种详细的电穿孔介导的RNA干扰实验方案，适用于蜻蜓目（Odonata）昆虫，包括使用蓝尾丝蟌（Ischnura senegalensis：Coenagironidae：Zygoptera）和斑翅蜻（Pseudothemis zonata：Libellulidae：Anisoptera）作为研究对象。

摘要

蜻蜓和豆娘（蜻蛉目 Odonata）是具有变态发育的最古老昆虫类群之一，其发育过程中会从水生幼虫转变为陆生/飞行成虫，经历栖息环境、形态和行为的显著变化，且不经过蛹期。蜻蛉目成虫具有发达的色觉系统，在不同性别、发育阶段和物种之间表现出丰富的体色和斑纹多样性。尽管已有大量关于蜻蛉目的生态学和行为学研究，但由于难以在该类群中开展基因功能分析，分子遗传学研究仍较为匮乏。例如，与鳞翅目类似，RNA干扰（RNAi）在蜻蛉目中的效果较差。为解决这一问题，我们成功建立了一种结合体内电穿孔技术的RNAi方法。本文提供了一个详细的实验方案，包括电穿孔介导RNAi操作的视频演示，具体步骤如下：幼虫准备、物种鉴定、dsRNA/siRNA溶液及注射针的制备、幼虫低温麻醉、dsRNA/siRNA注射、体内电穿孔以及个体化饲养直至成虫羽化。该电穿孔介导的RNAi方法适用于豆娘（束翅亚目 Zygoptera）和蜻蜓（差翅亚目 Anisoptera）。在本方案中，以蓝尾豆娘Ischnura senegalensis（细蟌科 Coenagrionidae）作为豆娘物种的示例，以斑翅蜻蜓Pseudothemis zonata（蜻科 Libellulidae）作为蜻蜓物种的示例进行介绍。作为典型应用实例，我们展示了靶向黑色素合成基因multicopper oxidase 2的RNAi实验结果。该RNAi技术将有助于深入理解参与蜻蛉目变态发育、形态发生、体色斑纹形成及其他生物学特征的相关基因功能。此外，该方案也可能广泛适用于其他因RNAi效率低下和渗透性差而导致基因沉默困难的非模式生物。

引言

蜻蜓和豆娘（蜻蜓目 Odonata）是经历"变态"1,2的最原始昆虫类群之一。通过变态，它们从水生幼虫转变为陆生/空中成虫，其栖息环境、形态结构和行为方式均发生显著变化3。蜻蜓目成虫具有高度发达的色觉系统，在不同性别、发育阶段和物种之间表现出丰富的体色和斑纹多样性3,4,5。尽管已开展大量关于蜻蜓目的生态学和行为学研究6,7，但由于难以在蜻蜓目中应用基因功能分析技术，其分子遗传学研究进展较为滞后。

传统的RNA干扰（RNAi）方法通过注射双链RNA（dsRNA）来抑制目标基因的功能8，但在蜻蜓目昆虫中被证明无效9，鳞翅目昆虫中也有类似报道10。另一方面，先前的研究表明，电穿孔介导的RNAi在鳞翅目物种中有效，尤其是在表皮组织中11,12,13。我们最近发现，电穿孔介导的RNAi在小型蜻蜓Nannophya pygmaea（Libellulidae: Anisoptera）中具有良好的效果9，但N. pygmaea属于相对稀有的物种，因此不适合用于分子遗传学研究。

大多数蜻蜓目物种被分为两个亚目之一：束翅亚目（豆娘，Zygoptera）或差翅亚目（蜻蜓，Anisoptera）3。本研究以蓝尾豆娘Ischnura senegalensis（Coenagrionidae科；图1A）作为束翅亚目的代表物种，以斑翅蜻蜓Pseudothemis zonata（Libellulidae科；图1B）作为差翅亚目的代表物种。这两种物种是日本自然池塘和城市池塘中最常见的蜻蜓目物种之一，包括筑波市内的池塘；我们可在野外采集到大量这两种物种的幼虫。近期，我们建立了一种针对I. senegalensis个体幼虫的实验室人工饲养体系，从而能够对蜻蜓目幼虫的发育过程和形态发生进行连续且详细的观察14。

本报告中，我们提供了一种改进的电穿孔介导的RNA干扰方法及相应的视频实验方案，适用于I. senegalensis和P. zonata。在日本，I. senegalensis与遗传关系相近的Ischnura asiatica常在同一地区共存15，且在幼虫阶段难以区分16。我们还描述了如何通过限制性片段长度多态性（RFLP）来区分这两种Ischnura物种。

为了评估电穿孔介导的RNA干扰效果，我们选择multicopper oxidase 2基因（MCO2；也称为laccase2）作为代表性靶基因，原因是该基因表达被敲低后会表现出体壁颜色变浅的可见表型9。MCO2已知在多种昆虫物种表皮黑化过程中起关键作用17,18。

方案

注意：各实验方案的整体流程如图1所示。

1. 蜻蜓或豆娘幼虫的制备。

  1. 使用手网在野外采集幼虫。
    注意：I. senegalensis 幼虫通常附着在漂浮于水面的水生植物上，而 P. zonata 幼虫则常栖息于水底的落叶层中。在筑波市，I. senegalensis 的末龄幼虫主要出现在3月至6月，而 P. zonata 的末龄幼虫则出现在5月至6月。I. senegalensis 幼虫可在实验室中从卵孵化获得14，但野外采集的幼虫羽化为成虫的成功率明显更高。
  2. 通过PCR扩增产物的限制性片段长度多态性（RFLP）进行物种鉴定。
    注意：仅当幼虫形态难以鉴定物种时（如 I. senegalensis），才需要进行此步骤。
    1. 用镊子夹住一只幼虫的一片尾鳃，幼虫便会自行脱落其尾鳃（发生自切现象）。
      注意：束翅亚目豆娘的幼虫通常具有三片尾鳃（图1A）。当受到捕食者攻击时，它们可通过脱落自身尾鳃来逃脱。若无法获取尾鳃，可解剖部分腿部组织。
    2. 将一片尾鳃放入100 µL PBS溶液 [0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.115% Na2HPO4, 和 0.02% KH2PO4 (w/v)] 中，并使用移液器配合研磨杵手动匀浆。
    3. 以5,000 × g离心10秒，取上清液0.5 µL，使用DNA聚合酶和引物对核DNA的内转录间隔区1（ITS1）区域进行PCR扩增。
      注意：请按照试剂制造商的说明书进行PCR反应。ITS-F0（5'- GGA AAG ATG GCC AAA CTT GA -3'）与5.8S-AS1（5'- GCC GGC CCT CAG CCA G -3'）引物组合可扩增几乎所有蜻蜓目物种的ITS1区域19。
    4. 将1 µL PCR扩增产物、0.3 µL 10× M缓冲液、0.1 µL DraI限制性内切酶和1.6 µL水混合，在37 °C孵育1小时。
      注意：应根据物种组合选择最合适的限制性内切酶。若无适合用于物种鉴定的限制性内切酶，则需通过DNA测序确认。
    5. 取2 µL产物加入上样染料，上样至2%琼脂糖凝胶，进行电泳。
      注意：使用1%或1.5%琼脂糖凝胶时，物种鉴定较为困难。
    6. 观察电泳图谱以鉴定物种（图2）。
      注意：RFLP图谱具有物种和种群特异性。在筑波种群中，I. asiatica 的主要条带为400–500 bp，而 I. senegalensis 的主要条带约为200 bp，并另有一条小于100 bp的附加条带（图2中的箭头所示）。ITS1区域在基因组中呈多拷贝存在，且在 Ischnura 属物种中，同一个体内的ITS1区域常存在微卫星多态性，从而影响RFLP图谱的呈现。
  3. 在实验室中饲养所采集的幼虫，直至用于RNA干扰实验。
    1. 将每只幼虫单独放入12孔板的各个孔中，每孔加入约3 mL水。
      注意：I. senegalensis 幼虫必须单独饲养，因其常发生相互捕食；而 P. zonata 幼虫可群体饲养，因其极少发生同类相食。
    2. 每日投喂 I. senegalensis 幼虫卤虫（Artemia），每周至少两次投喂 P. zonata 幼虫血虫和/或颤蚓（Tubifex），直至其生长至适合进行RNA干扰的发育阶段。
      注意：频繁投喂对提高成虫羽化成功率至关重要。
    3. 一旦水体因粪便或残饵变脏，立即更换水。
      注意：频繁换水同样对提高成虫羽化成功率非常重要。
    4. 判断适合进行RNA干扰的发育阶段。
      注意：I. senegalensis 的末龄幼虫可分为五个发育阶段14,20。为确保成虫羽化后RNA干扰表型清晰可见，应选择末龄幼虫的第一阶段（A阶段，翅尚未开始扩展）或第二阶段（B阶段）进行实验（见讨论部分）。本研究中，P. zonata 使用的是翅扩展前的末龄幼虫（相当于 I. senegalensis 的A阶段）。

2. RNA干扰用dsRNA/siRNA溶液及注射针的制备。

注意：请选择小干扰RNA（siRNA）（步骤2.1）或双链RNA（dsRNA）（步骤2.2）作为RNA干扰的解决方案。

  1. siRNA 溶液的制备
    1. 使用 siDirect 程序 2.0 版（http://sidirect2.rnai.jp/）21 设计 siRNA，遵循此前在鳞翅目昆虫中报道的指导原则22。
    2. 获取商业合成的 siRNA。
      注：本研究中靶向 MCO2 基因的 I. senegalensis siRNA 序列如下：正义链为 5'- GCA CUU UCC GUU AUC AAU AUA -3'，反义链为 5'- UAU UGA UAA CGG AAA GUG CUC -3'。作为阴性对照，靶向增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因的 siRNA 序列如下：正义链为 5'- GCA UCA AGG UGA ACU UCA AGA -3'，反义链为 5'- UUG AAG UUC ACC UUG AUG CCG -3'11。
    3. 用注射缓冲液 [100 mM CH3COOK, 2 mM Mg(CH3COO)2, 30 mM HEPES-KOH, pH 7.4] 将 siRNA 稀释至 100 µM22。
    4. 保存于 -80 °C，待用。
  2. dsRNA 溶液的制备
    1. 使用 primer3 程序 4.1.0 版（http://bioinfo.ut.ee/primer3/）23 选择一段 300–400 bp 的 dsRNA 区域，并设计引物对。 
    2. 获取商业合成的引物对。
      ​注：为生成 dsRNA 合成模板，本研究使用的引物对如下：针对 I. senegalensis 的 MCO2 基因（IsMCO2，登录号 LC589180），正向引物为 5'- GCC TGT CAG CTT TGT CTT CC -3'，反向引物为 5'- GGT GTC TGG CGG ACA ACT AT -3'；针对 P. zonata 的 MCO2 基因（PzMCO2，登录号 LC589179），正向引物为 5'- CCG CAC AGC TCA CTA TTC AA -3'，反向引物为 5'- GGA GGA TTC CTT CAT CGA CA -3'。作为阴性对照，靶向克隆载体上 β-内酰胺酶（bla）基因的引物对为：正向引物 5'- CTA TGT GGC GCG GTA TTA T -3'，反向引物 5'- CAG AAG TGG TCC TGC AAC T -3'。
    3. 使用市售 RNA 提取试剂盒从蜻蜓目幼虫中提取 RNA，并根据制造商说明书使用逆转录酶进行 cDNA 合成。
      注：用于 RNA 测序分析构建的 cDNA 文库也可使用。
    4. 使用合成的 cDNA 和设计的引物对扩增目标序列，并根据制造商说明书使用商业连接酶将其克隆至克隆载体中。
    5. 将质粒转化至 E. coli 感受态细胞中，过夜培养后挑取单菌落。
    6. 使用载体上的引物对插入片段区域进行 PCR 扩增。
    7. 通过 Sanger 测序确认克隆序列。
    8. 使用含有 T7 聚合酶启动子序列的载体引物对插入片段进行 PCR 扩增24, 25。
      注：本研究中使用的引物如下：T7-F（5' - TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC TAG TCA TAT GGA T - 3'）和 T7-R（5'- TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA GAC CCG GGG ATC CGA T - 3'）25。
    9. 根据制造商说明书使用 PCR 纯化试剂盒纯化 PCR 产物，用 50 µL 去离子水洗脱 DNA，并使用离心浓缩仪将洗脱的 DNA 溶液浓缩至约 10 µL。
    10. 根据制造商说明书通过体外转录合成 dsRNA。总共使用 1000 ng 模板 DNA，并用 100 µL 洗脱缓冲液洗脱合成的 dsRNA。
    11. 使用分光光度计测定 dsRNA 浓度，并通过 1.5% 琼脂糖凝胶电泳确认 dsRNA 质量。
      注：若 dsRNA 合成成功，电泳图中可见单一清晰条带。
    12. 用洗脱缓冲液将 dsRNA 稀释至 1000 ng/µL，保存于 -20 °C，待用。
  3. 注射针的制备
    1. 使用玻璃毛细管拉针仪拉制玻璃毛细管。
    2. 将拉制好的毛细管尖端置于双面胶带上，用镊子折断其尖端。
    3. 将毛细管安装至显微注射仪上。
      注：佩戴腈手套操作毛细管会更加方便。
    4. 将 siRNA/dsRNA 溶液装入制备好的毛细管中。
      注：由于野外采集的幼虫生活在泥中，注射后的毛细管尖端可能被污物堵塞，因此请勿重复使用毛细管。

3. siRNA/dsRNA 注射

注意：豆娘（步骤 3.1）和蜻蜓（步骤 3.2）的操作步骤略有不同。

  1. 向均翅亚目（豆娘）幼虫（例如 I. senegalensis）注射。
    1. 将幼虫覆盖湿滤纸后置于碎冰上麻醉50–70秒（图3A-C）。
      注：冰上低温麻醉时间取决于幼虫状态；若幼虫在70秒后开始活动，可追加70秒冰上麻醉。对于活动较少的幼虫（例如 P. zonata），此步骤非必需。
    2. 用两枚细针固定前胸两侧，将幼虫固定于支撑物（例如一块聚苯乙烯泡沫）上（图3D）。
      注：根据注射部位调整细针的位置和数量。
    3. 用手和镊子拉伸第7与第8腹节之间的节间膜，用于腹部RNA干扰；或拉伸前胸与合胸（中胸与后胸融合部分）之间的节间膜，用于胸部RNA干扰。
    4. 用手保持节间膜处于拉伸状态。
    5. 将制备好的毛细管尖端插入拉伸的节间膜中（图3D，3F）。
    6. 注射1 µL的siRNA/dsRNA溶液。
  2. 向差翅亚目（蜻蜓）幼虫（例如 P. zonata）注射。
    1. 用纸巾轻轻擦干幼虫体表的水分。
    2. 如有需要，用两枚细针固定前胸两侧，将幼虫固定于支撑物（例如一块聚苯乙烯泡沫）上（图3H）。
      注：根据注射部位调整细针的位置和数量。对于P. zonata，此步骤中使用细针固定并非必需。
    3. 用手拉伸第4与第5腹节之间的节间膜。
    4. 用细针在第4与第5腹节之间的节间膜上刺出一个小孔。
      注：此步骤对多数差翅亚目（蜻蜓）物种是必要的，因为其节间膜较硬，无法直接插入玻璃毛细管。
    5. 将制备好的毛细管尖端插入预先刺好的小孔中（图3I）。
      注：如图3H所示，幼虫背部的一部分对应成虫的腹侧，因此按图3H-J所示处理时，表型将出现在腹侧。
    6. 注射1 µL的siRNA/dsRNA溶液。

4. 体内电穿孔

  1. 如有需要，可添加更多大头针将幼虫固定在固定支架上（例如一块泡沫塑料）。
  2. 注射siRNA/dsRNA溶液后，使用镊子在幼虫体表施加两滴超声耦合剂。
  3. 将电极置于超声耦合剂上，正极放在注射了siRNA/dsRNA溶液的一侧，负极放在相对的另一侧（图3E，3G，3J）。
    注意：避免电极直接接触幼虫表皮，以防电穿孔产生灼伤效应。
  4. 使用电穿孔仪产生10次电穿孔脉冲（每次280毫秒）。
    注意：根据物种、发育阶段和组织类型调整电穿孔电压。本研究中，I. senegalensis 使用25 V，P. zonata 使用45 V。
  5. 用纸巾擦去体表残留的耦合剂。
  6. 将处理后的幼虫置于湿润的纸巾上静置约一天以恢复，次日转移至饲养容器中继续培养。

5. 位点特异性表型分析

  1. 将 I. senegalensis 单独饲养在直径为 5 cm 的培养皿中，培养皿内加入约 10 mL 水和一片滤纸；将 P. zonata 饲养在塑料笼中，并配有一次性无纺布网（羽化笼14）。
  2. 对于 I. senegalensis，在幼虫停止进食后，将其单独转移至配有一次性无纺布网的塑料笼中。
    注意：切勿将两个或更多幼虫放入同一个笼中，否则它们在羽化为成虫后会立即相互捕食。
  3. 成虫羽化后，观察并拍摄电穿孔时正极放置区域附近的表型。
    注意：表型仅以斑块形式出现。由于色素沉积尚未完全，羽化后表型通常难以立即识别。
  4. 为检测 RNAi 效率（例如通过定量 RT-PCR），若表型可见，可解剖有表型的区域，并与无表型区域进行比较。
    注意：RNAi 表型的程度，即表皮脱色的大小和位置，在不同个体间常表现出较大差异（见 图 4）。
  5. 将羽化后的成虫保存于 100% EtOH 中，以备后续分析。
    注意：蜻蜓目物种的体色在死亡后会迅速褪色，因此应在其死亡前用乙醇保存。乙醇有时会导致昆虫褪色，此种情况下应在昆虫死亡前将其冷冻保存。

结果

我们采用上述方案进行电穿孔介导的RNAi靶向 MCO2 基因和阴性对照基因（EGFP 用于siRNA和 bla 用于dsRNA）（i）在腹部 I. senegalensis (图4），（ii）在胸腔内 I. senegalensis (图5，以及（iii）在腹部 P. zonata (图6）。RNAi 实验的结果总结如下 表1由于带负电荷的siRNA/dsRNA仅进入带正电荷的细胞，因此RNAi表型出现在电穿孔时正极电极放置区域的周围。

在两者中 I. senegalensis 和 P. zonata，黑色素色素沉着（即黑色、棕色和红褐色）的抑制现象出现在正极放置区域周围，呈斑块状分布（白色箭头和虚线所示） 图 4, 图5，和 图6）当 MCO2 RNAi 与电穿孔结合进行表1），如先前报道所述 N. pygmaea9相比之下，在注射对照基因时，电穿孔位点周围未观察到任何表型效应。EGFP siRNA 或 bla dsRNA) (图 4, 图5，和 图6, 表1）。此外，注射 MCO2 基因在无电穿孔条件下对成体色素沉着无影响（图4, 表1），表明电穿孔对于蜻蜓目（Odonata）中的RNA干扰（RNAi）是必需的。需要注意的是，RNAi并不影响蓝色、绿色和黄色的体色表现。 MCO2 参与表皮中黑色素合成的基因，这很可能反映出体色是由表皮细胞中存在的色素颗粒所决定，这些颗粒可通过透明的角质层观察到26如图所示 图4，siRNA处理组与dsRNA处理组个体之间未观察到显著的表型差异，但在接受相同RNAi处理的不同个体之间，RNAi表型的大小和位置存在明显变异（例如，比较两个示例 IsMCO2 dsRNA 在 图4).

为了确定最适合进行RNAi处理的发育阶段，我们在末龄幼虫的五个形态学阶段（A-E期）比较了RNAi处理的表型后果 I. senegalensis (图7A）。由黑色素色素沉着引起的抑制作用 MCO2 在A期和B期注射后，所有羽化的成虫中均观察到RNAi现象图7C）。在C期和D期注射时，部分羽化的成虫中确实观察到黑色素色素沉着受到抑制，但其他成虫则因伤口而出现异常体色图7B).

豆娘-蜻蜓发育过程；示意图；dsRNA/siRNA注射；物种鉴定。
图1：蜻蜓目昆虫中基于电穿孔的RNA干扰方法。A. Ischnura senegalensis（束翅总科）作为典型的豆娘物种。B. Pseudothemis zonata（差翅总科）作为典型的蜻蜓物种。C. 实验流程总体示意图。蓝色和橙色框分别表示适用于I. senegalensis和P. zonata的实验步骤，紫色框表示两种物种共用的实验步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

DNA提取流程图、PCR扩增、电泳凝胶、RFLP分型、遗传分析。
图2：基于限制性片段长度多态性（RFLP）的Ischnura物种鉴定代表性结果。箭头指示I. senegalensis特异性条带。1、2、4：I. asiatica，3：I. senegalensis，M：100碱基对阶梯型标记物。请点击此处查看该图的放大版本。

伊希纳ura senegalensis 和 P. zonata 的生活史阶段、解剖学研究；显微图像、宏观视图。
图3：通过电穿孔介导的RNAi方法在蜻蜓目中的应用。A-C。 冰冻麻醉 I. senegalensis箭头指示幼虫。 A. 将幼虫置于湿润滤纸上，再放在碎冰上。 B. 幼虫在冰上的放大视图。 C. 冰上用湿纸覆盖的幼虫 D-G. RNAi 方法用于 I. senegalensis. D. 胸腔注射。 E. 胸部电穿孔 F. 腹腔注射。 G. 腹部电穿孔。 H-J. RNAi 方法用于 P. zonata. H. 在腹部制作一个小孔。 一、 腹腔注射。 J. 腹部电穿孔。箭头指示打孔或注射的位置。+、-：正、负极电极。数字表示腹节。 请点击此处以查看此图的放大版本。

I. senegalensis 电穿孔示意图，siRNA 和 dsRNA 基因功能研究。
图 4：I. senegalensis 腹部 RNAi 表型的背侧视图。白色箭头指示黑色素化受抑制的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

显示 IsMCO2 基因作用的中国台湾棘猛水蚤（*I. senegalensis*）RNAi 实验，背侧视图，比例尺 1 mm。
图 5：中国台湾棘猛水蚤（I. senegalensis）胸部 RNAi 表型的侧面和背侧视图。 白色箭头和虚线指示色素沉着受抑制的区域。 请点击此处查看该图的放大版本。

RNAi对P. zonata翅膀的影响；比较分析；示意图；对照组与PzMCO2 RNAi结果对比。
图6：P. zonata腹部RNAi表型的腹面观。白色箭头和虚线标示黑色素沉积受抑制的区域。请点击此处查看该图的放大版本。

I. senegalensis 发育阶段、幼虫色素沉着、羽化时间、柱状图分析。
图7：IsMCO2 RNAi 在 I. senegalensis 最终幼虫龄期中随发育阶段变化的影响。 A. 本研究中复眼在五个形态学阶段（A–E期）的形态变化及成虫羽化所需天数。括号中的数据来自先前报道14。 B. 因伤口导致的异常色素沉着。箭头指示电穿孔位点。 C. 在 I. senegalensis 五个形态学阶段进行RNAi处理对成虫色素沉着的影响。柱上数字表示个体数量。请点击此处查看该图的放大版本。

物种I.senegalensisP.zonata
注射区域腹部胸部腹部
siRNA/dsRNAsiRNAdsRNAdsRNAdsRNA
靶基因IsMCO2EGFPIsMCO2IsMCO2blaIsMCO2blaPzMCO2PzMCO2bla
电穿孔+++-++++-+
注射的幼虫数量22253065312201759
羽化的成虫数量761344011141125
出现色素减少区域的成虫（比例）7
(100%)		0
(0%)		13
(100%)		0
(0%)		0
(0%)		10
(91%)		0
(0%)		11
(100%)		0
(0%)		0
(0%)

表1. RNAi对I. senegalensis和P. zonata成虫体色的影响。A阶段的结果在 I. senegalensis 中展示。IsMCO2：I. senegalensis 的multicopper oxidase 2基因，EGFP：增强型绿色荧光蛋白基因，bla：来自pGEM-T Easy载体的β-内酰胺酶基因，PzMCO2：P. zonata 的multicopper oxidase 2基因。对照基因的结果代表了作者迄今为止开展实验的总次数。

讨论

RNAi 处理的致死性

我们发现，RNAi 处理的致死率在很大程度上取决于蜻蜓目幼虫的饲养历史和生理状态。从野外采集后不久的幼虫通常较为健康，在电穿孔介导的 RNAi 处理后死亡率较低。相比之下，长期在实验室饲养（例如一个月）的幼虫往往羽化为成虫的成功率较低。在 I. senegalensis 中，虽然可以使用从卵开始在实验室饲养的幼虫替代野外采集的幼虫14，但使用实验室饲养幼虫进行 RNAi 的成功率通常明显低于使用野外采集幼虫的效果（许多个体在变态过程中死亡）。此外，频繁喂食和清洁水体饲养对于提高成虫羽化成功率并降低 RNAi 处理的致死率至关重要。

RNAi 处理的效率

如上所述，RNAi表型的程度（即表皮脱色的大小和位置）在经历相同RNAi处理的个体之间通常表现出显著差异（例如，图4），但不同蜻蜓目物种之间的表型外显率似乎存在显著差异。I. senegalensis中观察到的表型区域比P. zonata（图6）和N. pygmaea9中的更大且更明显（图4-5）。这种差异可能与幼虫体表表皮的厚度有关，因为I. senegalensis的表皮比P. zonata和N. pygmaea的更薄。据我们观察，siRNA与dsRNA的作用效果之间未发现明显差异（图4，表1）。

RNAi 的合适发育阶段

需要注意的是，正确的幼虫分期对于高效进行RNAi实验至关重要。在D期之前（成虫羽化前约3天）对MCO2进行RNAi可导致成虫体色沉积受到抑制，这一结果与此前关于N. pygmaea9的报道一致。在C期和D期注射RNAi所观察到的表型，较A期和B期处理的个体更为不明显，表明C期和D期可能已过晚，难以充分抑制基因表达。RNAi处理的合适时机取决于目标基因的表达时间，而MCO2基因在成虫羽化期间呈现短暂的高表达水平9，这与其他昆虫中的情况相似17,18。在臭虫Plautia stali中，注射RNAi后从第4天开始即可观察到MCO2基因的表达下调27，这与本研究结果一致。

我们之前对 I. senegalensis 的研究显示，在达到B阶段后，大多数末龄幼虫发育至成虫羽化所需天数的变异相对较小，表明B阶段可能对应于启动成虫羽化过程的关键节点，此后变态发育过程将以预设且协调的方式进行14。当在C和D阶段对幼虫进行RNAi处理时，常观察到由伤口引起的形态异常（图7B、7C）。这可能与这些阶段中变态过程的剧烈进展有关，提示应避免在C阶段及之后进行RNAi处理。综上所述，我们建议RNAi实验应选用处于A或B阶段（或翅芽尚未显著伸展之前的阶段）的末龄幼虫。

电穿孔介导的RNAi方法的有效性与优势

传统的RNAi是一种简单而强大的实验方法，但某些昆虫类群（如蝴蝶10、蚜虫28和蜻蜓9）的RNAi效率较低，这使得基因功能分析的研究建立面临重大挑战。在本研究中，我们发现，通过电穿孔介导的RNAi可在适当的发育阶段对蜻蜓实现几乎100%效率的局部基因抑制，至少在表皮组织中效果显著（表1）。近年来，基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术已成功应用于多种昆虫，为非模式生物提供了强大的分子遗传学工具29。然而，本文指出，尽管CRISPR/Cas9技术无疑十分优秀，但在某些方面，电穿孔介导的RNAi方法可能优于CRISPR/Cas9。

首先，在电穿孔介导的RNAi方法中，通过调控电穿孔时正极的位置，可实验性地精确控制出现RNAi表型的虫体区域。此外，由于基因表达被抑制的区域仅局限于正极放置位置的周围，因此可在同一个体中并排直接比较RNAi表型与对照表型。其次，与CRISPR/Cas9方法相比，后者需将注射后的卵培育至成虫阶段才能观察基因敲除表型，而电穿孔介导的RNAi方法具有明显优势，通常可在更短时间内观察到基因敲低的表型。例如，I. senegalensis从卵发育至成虫需三到四个月，而P. zonata则需一至两年14,30。然而，为了观察成虫表皮中的RNAi表型，对于I. senegalensis和P. zonata而言，从B期末龄幼虫注射dsRNA到成虫羽化，所需时间均不到一个月（图7）。第三，电穿孔介导的RNAi方法需向较大的幼虫注射dsRNA，相比CRISPR/Cas9方法中对微小卵进行显微注射而言，操作更为简便。此外，该方法适用于那些新产卵难以收集的昆虫物种。例如，P. zonata的雌虫在飞行中将卵产于水面漂浮植物上，因此无论在野外还是实验室条件下均难以收集其卵。因此，我们预计本实验方案可广泛适用于传统RNAi方法效率较低的非模式生物。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢森山实对技术问题的建议与支持，广田斌和铃木龙太郎在采集蜻蜓幼虫方面的帮助，以及品那美沙对稿件提出的有益意见。本研究得到了日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号JP18J21561（授予GO）以及JP18H02491、JP18H04893、JP19H03287和JP20H04936（授予RF）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔板ViolamoVTC-P12注射前幼虫的饲养
卤虫卵日本宠物设计4975677012396
校准过的微量移液器（1-5 µL德拉蒙德2-000-001-90
加入研杵 1.5 mL赛默飞世尔科技K749520-0090
数字高清显微镜相机徕卡显微系统MC170HD
一次性无纺布网状材料白元地球DSC-105A
DNA连接试剂盒 Ver.2.1Takara Bio6022
DraITakara Bio1037A
电极（1 mmφ)NEPAGENECUY650P1
电穿孔仪CellProduce治疗基因
镊子KOWA 镊子 产业K-10 No1
玻璃针拉制仪NARISHIGEPN-3
手持搅拌器AS ONE1-229-02
手网HOGAIS33-3B
HEPESFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation346-01373注射缓冲液
昆虫针插头，3号志贺昆虫繁殖所N230用于固定幼虫
KClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation163-03545PBS溶液
KH2PO4FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation169-04245用于 PBS
KOAcFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation160-03175用于注射缓冲液
KOHFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation168-21815注射缓冲液
实验室升降台（150x150）AS ONE1-4642-11用于调节操纵器的位置
超声用LOGIQLEAN凝胶 硬质类型GE Healthcare2369385
操作器Muromachi Kikai Co., Ltd.SJ-1用于调节注射器和毛细管的位置
MEGAscript RNAi 试剂盒赛默飞世尔科技AM1626
Mg(OAc)2FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation130-00095注射缓冲液
Na2HPO4FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation197-02865PBS溶液
NaClFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation191-01665PBS溶液
培养皿（5 cm 直径）岩木1010-060用于饲养注射后的幼虫
气动注射器NARISHIGEIM-12
pT7Blue T-载体Novagen69820
QIAquick PCR 纯化试剂盒QIAGEN28106
RNAiso PlusFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation9109
RNeasy Mini KitQIAGEN74106
带不锈钢无头的志贺氏微型昆虫针志贺昆虫繁殖株N251用于制作一个小孔
体视显微镜徕卡显微系统S8APO
SuperScript IV 逆转录酶赛默飞世尔科技18090010
TaKaRa Ex TaqTakara BioRR001B用于质粒的 PCR 扩增
Tks Gflex DNA 聚合酶Takara BioR060B用于尾部鳃组织的PCR扩增

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电穿孔介导的RNAi蜻蜓目基因沉默活体电穿孔双链RNA注射siRNA递送MCO2基因靶向豆娘幼虫蜻蜓幼虫超声耦合剂电穿孔
基于电穿孔的Odonata目昆虫RNA干扰方法
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