本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。
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本文内容
摘要
摘要
估算黑质中多巴胺能神经元的数量是临床前帕金森病研究中的关键方法。目前，无偏倚体视学计数是定量分析这些细胞的标准方法，但该过程仍然费力且耗时，可能并不适用于所有研究项目。本文介绍了一种图像分析平台的使用方法，该平台可准确估算预定义感兴趣区域中标记细胞的数量。我们详细描述了在大鼠脑组织中应用该分析方法的逐步操作流程，并证明该方法能够识别由于黑质中突变型α-突触核蛋白表达所导致的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量显著减少。我们通过与无偏倚体视学获得的结果进行比较，验证了该方法的可靠性。综上所述，该方法提供了一种高效且准确的检测多巴胺能神经元数量变化的流程，因此适用于对干预措施在细胞存活方面影响的高效评估。
引言
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的神经退行性运动障碍，其特征是存在含α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）的蛋白质聚集体，并伴有黑质致密部 (substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺能神经元的选择性丢失1。多巴胺能神经元数量的定量分析是帕金森病研究中的关键环节，因其可评估黑质纹状体系统的完整性，从而为评估潜在疾病修饰疗法的有效性提供重要的终点指标。目前，细胞数量定量的标准方法是无偏倚体视学计数法，该方法利用组织的二维（2D）切片来估算三维（3D）结构中的体积特征2,3,4。现代基于设计的体视学方法采用全面的随机取样程序，并应用特定的计数协议（称为探针），以避免潜在的人工假象和系统性误差，从而可靠地检测出仅略大于个体间变异的差异5。尽管体视学为体内组织学研究提供了强有力的分析工具，但其耗时较长，要求标本制备均匀一致，并需在多个步骤中进行验证，这些因素可能影响当前临床前转化研究日益要求的效率。
数字科学领域的最新技术进步使得无需体视显微镜即可采用新型应用对病理学进行更高效的评估，同时....
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方案
所有实验程序均经大学健康网络动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南和规定进行。
1. 立体定位注射
- 将成年雌性Sprague-Dawley大鼠（250–280 g）两两同笼饲养于铺有木屑垫料的笼子中，并自由获取食物和水。将动物群体维持在12小时光照/12小时黑暗的常规循环环境中（光照开启时间为06:30），并保持恒定的温度和湿度。
- 按照先前所述方法8,10，将AAV单侧立体定位注射至脑右侧黑质致密部（SNpc）（左侧或右侧可根据各实验室偏好选择）。注射2 μL的AAV1/2，最终滴度为3.4 × 1012 基因组颗粒/mL。
2. 脑组织切片与免疫组织化学（IHC）
- 将大鼠置于麻醉室中，使用5%异氟烷麻醉3分钟。经适当机构审查后，也可采用其他批准的方法完成此步骤。
- 当大鼠达到外科手术所需的深度麻醉状态时，将其转移至固定于解剖台上的鼻罩。用胶带固定大鼠前肢，并采用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。动物必须无反应后方可继续操作。
- 在胸骨下方做一侧向切口，沿整个肋骨 cage 切开膈肌，以暴露胸膜腔。用止血钳提起并夹住胸骨，将其置于头部上方。 <....
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结果
通过将上述方法应用于腺相关病毒（AAV）注射后6周采集的大脑组织，我们证明了在大鼠脑黑质致密部（SNpc）立体定向注射表达突变型A53T α-突触核蛋白的腺相关病毒（AAV-A53T）会导致多巴胺能神经元密度显著降低，而对照组注射空载腺相关病毒（AAV-EV）则无此效应。图 5A，B). 每毫米中TH阳性神经元的平均数量2 在注射了AAV-EV的大鼠SNpc中为276.2 ± 34.7，在注射了AAV-A53T的大鼠SNpc中为41.2 ± 17P = 0.0003）。每毫米多巴胺能神经元数量的定量分析2 在SNpc中的结果与先前已发表的报告相似10, 11每个动物分析4个连续切片。既往研究表明，仅3个切片即可检测到显著差异，但根据研究者所采用的模型和干预措施，切片数量可进一步增加至12个，以涵盖整个黑质致密部（SNpc）。
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讨论
在帕金森病（PD）的临床前模型中，对多巴胺能系统完整性的可靠评估对于确定潜在疾病修饰治疗药物的有效性至关重要。因此，控制并尽量减少可能降低组织病理学数据可靠性和可重复性的混杂因素具有重要意义。细致的定量结果能够提供的信息比单纯的定性或半定量描述更为丰富。同时，我们也必须认识到，时间和资源的限制可能使得进行无偏倚的体视学计数以量化病理改变或细胞丢失变得困难。然而，随着近年来的技术进步，许多这些标准已可通过计算机化和自动化的成像平台得以实现6。
本方案描述了在啮齿类动物脑组织中确定多巴胺能神经元/mm2体视学估算值的一系列关键步骤。需要注意的是，我们采用立体定位注射将AAV病毒递送至黑质致密部（SNpc），因此准确地递送这些病毒对于评估任何处理效应至关重要。本研究所使用的坐标为前囟后方-5.2 mm（前后方向）、右侧-2 mm（内侧-外侧方向）以及颅骨下方-7.5 mm（背腹方向），适用于体重约275 g的成年雌性大鼠。利用上述坐标准确注射病毒，可确保AAV病毒成功递送至黑质致密部（SNpc）。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者谨向大学健康网络先进光学显微镜设施（AOMF）的所有工作人员致以诚挚感谢，感谢他们为本实验方案的开发所付出的时间与提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-突触核蛋白抗体 | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 二抗 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 二抗 | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| 碱性磷酸酶标记的抗兔 IgG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| 生物素标记的抗小鼠 IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| DAKO 荧光封片剂 | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB 过氧化物酶底物 | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 共聚焦显微镜 | Zeiss | ||
| NeuN 抗体 | Millipore | MAB377 | |
| 正常山羊血清 | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT 包埋剂 | Tissue-Tek | ||
| 多聚甲醛 | BioShop | PAR070.1 | |
| 滑动式切片机 | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| 蔗糖 | BioShop | SUC700 | |
| TH 抗体 | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount 封片剂 | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue 碱性磷酸酶底物 | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black 软件 | Zeiss | ||
| Zen Blue 软件 | Zeiss |
参考文献
- Kalia, L. V., Lang, A. E. Parkinson's disease. Lancet. 386 (9996), 896-912 (2015).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in thesubdivisions of the rat hippocampus using the optical fra....
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