本文介绍一种用于自动半定量测定大鼠黑质致密部多巴胺能神经元数量的方法。
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摘要
摘要
估算黑质中多巴胺能神经元的数量是临床前帕金森病研究中的关键方法。目前，无偏倚体视学计数是定量分析这些细胞的标准方法，但该过程仍然费力且耗时，可能并不适用于所有研究项目。本文介绍了一种图像分析平台的使用方法，该平台可准确估算预定义感兴趣区域中标记细胞的数量。我们详细描述了在大鼠脑组织中应用该分析方法的逐步操作流程，并证明该方法能够识别由于黑质中突变型α-突触核蛋白表达所导致的酪氨酸羟化酶阳性神经元数量显著减少。我们通过与无偏倚体视学获得的结果进行比较，验证了该方法的可靠性。综上所述，该方法提供了一种高效且准确的检测多巴胺能神经元数量变化的流程，因此适用于对干预措施在细胞存活方面影响的高效评估。
引言
帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种常见的神经退行性运动障碍，其特征是存在含α-突触核蛋白（α-synuclein, α-syn）的蛋白质聚集体，并伴有黑质致密部 (substantia nigra pars compacta, SNpc)多巴胺能神经元的选择性丢失1。多巴胺能神经元数量的定量分析是帕金森病研究中的关键环节，因其可评估黑质纹状体系统的完整性，从而为评估潜在疾病修饰疗法的有效性提供重要的终点指标。目前，细胞数量定量的标准方法是无偏倚体视学计数法，该方法利用组织的二维（2D）切片来估算三维（3D）结构中的体积特征2,3,4。现代基于设计的体视学方法采用全面的随机取样程序，并应用特定的计数协议（称为探针），以避免潜在的人工假象和系统性误差，从而可靠地检测出仅略大于个体间变异的差异5。尽管体视学为体内组织学研究提供了强有力的分析工具，但其耗时较长，要求标本制备均匀一致，并需在多个步骤中进行验证，这些因素可能影响当前临床前转化研究日益要求的效率。
数字科学领域的最新技术进步使得无需体视显微镜即可采用新型应用对病理学进行更高效的评估，同时可作为无偏倚体视学方法的有效替代方案。这些方法能够提高分析速度，减少人为误差，并增强体视学技术的可重复性6,7。HALO 就是一种用于数字病理学中定量组织分析的图像分析平台。该平台包含多种不同模块，利用模式识别算法，可在全组织切片范围内以单个细胞为基础报告形态学及多重表达数据。其中，细胞核/细胞质荧光（cytonuclear FL）模块可检测细胞核或细胞质中荧光标记物的免疫荧光阳性信号，从而报告每种标记物阳性细胞的数量以及每个细胞的染色强度评分。该模块还可用于获取单个细胞的大小和强度测量值，但此功能在多巴胺能神经元的定量分析中并非必需。
本研究旨在通过一种先前已验证的基于病毒载体的α-突触核蛋白（α-syn）大鼠黑质神经变性模型来验证该方法8,9,10。在该模型中，通过立体定位注射腺相关病毒杂合血清型1/2（AAV1/2），在黑质致密部（SNpc）表达人类突变型A53T α-syn，可在6周内引起显著的神经变性。在某些研究中，对侧未注射的SNpc可作为注射侧的内部对照。更常见的是，使用注射AAV空载体（AAV-EV）的对照组动物作为阴性对照。本文提供了一步一步的操作指南，介绍如何利用自动化图像分析软件估算注射后6周SNpc中残留的多巴胺能神经元密度（图1）。
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方案
所有实验程序均经大学健康网络动物护理委员会批准，并遵循加拿大动物护理委员会制定的指南和规定进行。
1. 立体定位注射
- 将成年雌性Sprague-Dawley大鼠（250–280 g）两两同笼饲养于铺有木屑垫料的笼子中，并自由获取食物和水。将动物群体维持在12小时光照/12小时黑暗的常规循环环境中（光照开启时间为06:30），并保持恒定的温度和湿度。
- 按照先前所述方法8,10，将AAV单侧立体定位注射至脑右侧黑质致密部（SNpc）（左侧或右侧可根据各实验室偏好选择）。注射2 μL的AAV1/2，最终滴度为3.4 × 1012 基因组颗粒/mL。
2. 脑组织切片与免疫组织化学（IHC）
- 将大鼠置于麻醉室中，使用5%异氟烷麻醉3分钟。经适当机构审查后，也可采用其他批准的方法完成此步骤。
- 当大鼠达到外科手术所需的深度麻醉状态时，将其转移至固定于解剖台上的鼻罩。用胶带固定大鼠前肢，并采用脚趾夹捏反应法判断麻醉深度。动物必须无反应后方可继续操作。
- 在胸骨下方做一侧向切口，沿整个肋骨 cage 切开膈肌，以暴露胸膜腔。用止血钳提起并夹住胸骨，将其置于头部上方。
- 用镊子夹住心脏，并将连接灌注泵的蝶形针插入左心室后端。经心脏灌注150 mL肝素化生理盐水，直至眼睛和皮肤变清亮。为便于某些抗体的免疫染色或更薄的脑切片，可选择用4%多聚甲醛（PFA）替代生理盐水进行灌注。
- 灌注完成后，使用断头器断头，并将脑组织取出，置于脑切片模具中，腹面朝上。
- 使用新的剃须刀片，在视交叉前方2 mm处的冠状面上进行切割。切割时左右滑动刀片，以避免脑组织在切片过程中发生扭曲。
- 将脑组织的后部浸入预先标记的含有约20 mL 4% PFA的离心管中，在室温下进行48小时的后固定。脑组织的前部可在-42 °C预冷的2-甲基丁烷中速冻，随后于-80 °C保存。
- 48小时后，将固定的脑组织转移至含有30%蔗糖磷酸盐缓冲液（PBS）的标记离心管中，4 °C保存直至脑组织沉底（48–72小时）。
- 准备切片机：在样本台槽内放置干冰，随后加入100%乙醇。待样本台冷却后，将最佳切割温度（OCT）包埋剂挤在样本台上，形成直径2 cm、厚0.5 cm的圆形。待其部分冻结后，小心将脑组织置于OCT包埋剂上，确保纹状体切面与样本台保持平行。
- 向样本台添加更多干冰以帮助脑组织冻结。当脑组织变为乳白色时，清除样本台上的干冰。
- 用25G针头在脑组织右侧穿孔，以区分左右半球。注意避免针头穿过感兴趣的解剖结构。
- 从bregma -3.8开始至bregma -6.8结束，在冠状面上连续切取40 μm厚的切片。
- 将六套系列切片分别储存于标记的试管中，每管加入抗冻溶液（40% PBS、30% 2-乙氧基乙醇、30%甘油）。每套应包含12个脑切片。
- 选取其中一套切片用于免疫组织化学染色，并用0.2% PBS-T溶液清洗3次，每次10分钟，以去除抗冻溶液。
- 在室温下，用封闭液（10%正常山羊血清（NGS）、2%牛血清白蛋白（BSA）溶于0.2% PBS-T）轻柔振荡封闭1小时。随后加入兔抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体（1:500）和小鼠抗α-syn抗体（1:500），溶于含2% NGS的0.2% PBS-T中，在室温下避光孵育过夜。
- 用0.2% PBS-T溶液清洗3次，每次5分钟，去除一抗；随后加入山羊抗兔Alexa Fluor 488二抗（1:500）和山羊抗小鼠Alexa Fluor 555二抗，溶于含2% NGS的0.2% PBS-T中，室温孵育1小时。确保切片避光并轻柔振荡。
- 用0.2% PBS-T溶液清洗3次，每次5分钟，去除二抗。使用细毛刷将整套切片转移至载玻片上，并避光防尘。用荧光封片剂封片，并以透明指甲油密封。
3. 共聚焦显微镜与图像采集
- 使用与共聚焦显微镜联用的软件以 10 倍放大倍数采集免疫组化（IHC）图像。将针孔打开至 1.5 AU，以捕获约 1.5 μm 的宽焦平面，并将焦点设置在脑部注射侧。
- 在 Acquisition 选项卡中，勾选 Tile Scan 成像选项，并将尺寸设置为 10 × 4。
- 在 Acquisition Mode 面板下，将 Zoom 设置为 1.1。这有助于避免拼接图像之间出现明显的接缝痕迹。
- 将 Frame Size 设置为 1024 × 1024 像素，Averaging 设置为 2，以确保获得高质量的图像。
- 在 Channels 面板中，将 track 1 设置为 Alexa488，track 2 设置为 Alexa555。
- 将载玻片放置于载物台上，选择 TH 染色较强的切片区域。点击 Acquisition 面板中的 Live 按钮。
- 在 Channels 面板中，调节 Laser Strength 和 Gain，使信号最大化并尽量减少背景噪声。使用范围指示器确保信号未过曝（以深红色覆盖区域为提示）。
- 对多张载玻片重复上述步骤，以确保不同载玻片间的染色一致性，因为载玻片之间无法调整激光强度/增益。
- 在 Acquisition 选项卡中，勾选 Positions 复选框。
- 此时即可开始成像。通过目镜选择显示阳性 TH 染色的第一个区域，将焦点设置在感兴趣区域（即 SNpc），然后将载物台移至该区域的中线位置。此操作将保存 x、y 和 z 轴上的位置信息，并进行拼接扫描以捕获整个切片区域的图像。
- 对 SNpc 内的所有切片区域重复上述步骤，以获得完整的 SNpc 图像集。若需对未注射侧进行详细分析，应将焦点设置在未注射侧，并重复步骤 3.10 至 3.11。
4. 图像分析与定量
- 使用适当的软件分离图像文件，并将图像文件导入自动图像分析软件。
- 选择画笔注释工具，在黑质致密部（SNpc）周围绘制注释，以定义感兴趣区域。
注意：在多巴胺能神经元大量丢失的切片中，可临时提高发射/吸收强度，以更清晰地界定SNpc（图2）。 - 转至分析选项卡，从下拉的分析菜单中选择实时调参。此操作将在切片图像上打开一个独立窗口，允许实时修改分析参数（图3）。
- 在分析放大倍数部分，选择合适的图像缩放比例。
- 在细胞检测部分，选择核染料作为TH染色所用的染料（Alexa Fluor 488）。
- 在仔细观察实时调参窗口的同时，调整核对比度阈值、最小核强度、核分割激进程度和核大小设置。
注意：在实时调参窗口中，每个细胞必须被准确地表示为单个独立细胞，这对分析准确性至关重要。这些参数的数值为任意单位，具体取决于所使用的软件，但必须正确调整，以使软件能够准确区分单个细胞之间以及细胞与背景之间的界限（图3）。 - 重复此过程，至少对10个独立样本进行分析，以确保在不同切片中对“细胞”的定义具有一致性。
注意：可在同一分析平台中，通过分析选项卡中的Marker 1或Marker 2部分，识别其他细胞标记物（如α-syn或NeuN）。 - 在采集了足够数量的图像并完成相应的实时调参后，通过设置操作下拉菜单保存分析设置。
- 选择所有待分析的图像，然后点击分析。
- 选择刚刚保存的分析设置，在分析区域窗口中勾选注释图层选项，然后勾选图层1，并点击分析。
注意：对于单个大脑样本，分析通常耗时约5分钟。分析完成后，结果将清晰显示每一个被计为细胞的对象（图4）。 - 分析完成后，导出所有切片的汇总分析数据。可选择导出对象分析数据，以获得包括每个检测到的细胞的细胞大小在内的详细信息。该数据集可用于研究细胞大小在毒素或治疗干预下的变化情况。
- 将每只动物各切片分析所得的总细胞数相加，并记录总分析面积（mm2）。将总细胞数除以总分析面积，计算每只大鼠SNpc中每平方毫米的细胞数量（cells/mm2）。
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结果
通过将上述方法应用于腺相关病毒（AAV）注射后6周采集的大脑组织，我们证明了在大鼠脑黑质致密部（SNpc）立体定向注射表达突变型A53T α-突触核蛋白的腺相关病毒（AAV-A53T）会导致多巴胺能神经元密度显著降低，而对照组注射空载腺相关病毒（AAV-EV）则无此效应。图 5A，B). 每毫米中TH阳性神经元的平均数量2 在注射了AAV-EV的大鼠SNpc中为276.2 ± 34.7，在注射了AAV-A53T的大鼠SNpc中为41.2 ± 17P = 0.0003）。每毫米多巴胺能神经元数量的定量分析2 在SNpc中的结果与先前已发表的报告相似10, 11每个动物分析4个连续切片。既往研究表明，仅3个切片即可检测到显著差异，但根据研究者所采用的模型和干预措施，切片数量可进一步增加至12个，以涵盖整个黑质致密部（SNpc）。
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讨论
在帕金森病（PD）的临床前模型中，对多巴胺能系统完整性的可靠评估对于确定潜在疾病修饰治疗药物的有效性至关重要。因此，控制并尽量减少可能降低组织病理学数据可靠性和可重复性的混杂因素具有重要意义。细致的定量结果能够提供的信息比单纯的定性或半定量描述更为丰富。同时，我们也必须认识到，时间和资源的限制可能使得进行无偏倚的体视学计数以量化病理改变或细胞丢失变得困难。然而，随着近年来的技术进步，许多这些标准已可通过计算机化和自动化的成像平台得以实现6。
本方案描述了在啮齿类动物脑组织中确定多巴胺能神经元/mm2体视学估算值的一系列关键步骤。需要注意的是，我们采用立体定位注射将AAV病毒递送至黑质致密部（SNpc），因此准确地递送这些病毒对于评估任何处理效应至关重要。本研究所使用的坐标为前囟后方-5.2 mm（前后方向）、右侧-2 mm（内侧-外侧方向）以及颅骨下方-7.5 mm（背腹方向），适用于体重约275 g的成年雌性大鼠。利用上述坐标准确注射病毒，可确保AAV病毒成功递送至黑质致密部（SNpc）。
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披露
作者声明无竞争利益。
致谢
作者谨向大学健康网络先进光学显微镜设施（AOMF）的所有工作人员致以诚挚感谢，感谢他们为本实验方案的开发所付出的时间与提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| α-突触核蛋白抗体 | ThermoFisher Scientific | 32-8100 | |
| ABC Elite | Vector Labs | PK-6102 | |
| Alexa Fluor 488 二抗 | ThermoFisher Scientific | A-11008 | |
| Alexa Fluor 555 二抗 | ThermoFisher Scientific | A-28180 | |
| 碱性磷酸酶标记的抗兔 IgG | Jackson Immuno | 111-055-144 | |
| 生物素标记的抗小鼠 IgG | Vector Labs | BA-9200 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A2153 | |
| DAKO 荧光封片剂 | Agilent | S3023 | |
| HALO™ | Indica Labs | ||
| Histo-Clear II | Diamed | HS202 | |
| ImmPACT DAB 过氧化物酶底物 | Vector Labs | SK-4105 | |
| LSM880 共聚焦显微镜 | Zeiss | ||
| NeuN 抗体 | Millipore | MAB377 | |
| 正常山羊血清 | Vector Labs | S-1000-20 | |
| OCT 包埋剂 | Tissue-Tek | ||
| 多聚甲醛 | BioShop | PAR070.1 | |
| 滑动式切片机 | Leica | SM2010 R | |
| Stereo Investigator | MBF Bioscience | ||
| 蔗糖 | BioShop | SUC700 | |
| TH 抗体 | ThermoFisher Scientific | P21962 | |
| VectaMount 封片剂 | Vector Labs | H-5000 | |
| Vector Blue 碱性磷酸酶底物 | Vector Labs | SK-5300 | |
| Zen Black 软件 | Zeiss | ||
| Zen Blue 软件 | Zeiss |
参考文献
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