需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短

4K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62129

⸱

2021年3月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Regenerative Medicine, Center for Molecular Medicine, Jichi Medical University, 2Department of Pediatrics, Jichi Medical University, 3Institute of Global Innovation Research, Tokyo University of Agriculture and Technology, 4Department of Precision Mechanics, Faculty of Science and Engineering, Chuo University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。

摘要

多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs）可由胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ES/iPS细胞）分化获得。这些细胞为心脏疾病建模提供了极具前景的细胞来源。在心肌病研究中，肌节缩短是评估成年心肌细胞疾病表型的标准生理学检测指标之一。然而，现有的方法并不适用于评估PSC-CMs的收缩功能，因为这些细胞的肌节发育尚不成熟，在相差显微镜下无法观察到。为解决这一问题并实现对PSC-CMs的肌节缩短分析，本研究采用了荧光标记的肌节蛋白结合活细胞成像技术。肌节两端为细小的Z线，中心为M线。Z线蛋白——α-辅肌动蛋白（ACTN2）、连接蛋白（TCAP）和肌动蛋白相关LIM蛋白（PDLIM3）——以及一种M线蛋白——肌球蛋白结合蛋白-2（Myom2）——均被标记上荧光蛋白。这些标记蛋白可通过基因敲入方式在内源等位基因位点表达，也可通过腺相关病毒（AAVs）进行外源表达。本文介绍了将小鼠和人类多能干细胞分化为心肌细胞、制备腺相关病毒（AAVs）、实施并分析活细胞成像的实验方法。此外，还描述了制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模的方法，用于实现PSC-CMs的图案化培养，从而促进带有荧光标记蛋白的肌节缩短分析。为评估肌节缩短情况，在电刺激（0.5–1 Hz）条件下，以高帧率（每秒50–100帧）记录跳动细胞的时间序列图像。为分析细胞收缩过程中肌节长度的变化，将所记录的时间序列图像导入SarcOptiM插件（ImageJ/Fiji平台）进行分析。本策略为研究PSC-CMs中的心脏疾病表型提供了一个简便的实验平台。

引言

心血管疾病是全球范围内导致死亡的首要原因1 心肌病是心脏相关死亡的第三大原因2心肌病是一类影响心肌的疾病总称。近年来，诱导性多能干细胞（iPS细胞）的发展以及将iPS细胞定向分化为心肌细胞（PSC-CMs）的技术进步，为利用患者基因组研究心肌细胞开辟了新途径 体外 心肌病模型。这些细胞可用于理解心脏疾病的病理生理学，阐明其分子机制，并测试不同的治疗候选药物。3因此，人们对此产生了极大的兴趣，已生成了患者来源的诱导多能干细胞（例如，肥厚型心肌病 [HCM]）4,5致心律失常性右室心肌病 [ARVC]6扩张型心肌病 [DCM]7以及线粒体相关性心肌病8,9由于心肌病的特征之一是肌节功能障碍和结构破坏，因此需要一种能够均匀测量肌节功能的有效工具。

肌节缩短是评估来自动物模型和人类的成年心肌细胞中肌节功能及收缩力最常用的技术。进行肌节缩短实验需要具有清晰可见的、在相差显微镜下可观察到的良好发育肌节结构。然而，培养的PSC-CMs 体外 表现出发育不全且结构紊乱的肌节，因此无法用于准确测量肌节缩短10这种难以准确评估PSC-CMs收缩力的问题，限制了其作为心脏功能评估平台的应用。 体外为间接评估PSC-CMs的收缩力，已采用原子力显微镜、微柱阵列、牵引力显微镜以及阻抗测量技术来检测这些细胞运动对其周围环境产生的影响11,12,13更复杂且侵入性更小的活细胞运动视频显微记录技术（例如 SONY 的 SI8000）可用于间接评估细胞收缩性，但该方法无法直接测量肌节运动或力生成动力学14.

为了直接测量PSC-CMs中的肌节运动，一些新方法正在出现，例如对肌节蛋白进行荧光标记。例如，Lifeact可用于标记丝状肌动蛋白（F-actin）以测量肌节运动15,16。另一种选择是使用经基因修饰的iPS细胞，通过荧光蛋白标记肌节蛋白（如α-肌动蛋白结合蛋白[ACTN2]和肌小节蛋白-2[MYOM2]）17,18,19。

本文中，我们描述了如何利用Myom2-TagRFP（小鼠胚胎干细胞[ES细胞]）和ACTN2-mCherry（人诱导多能干细胞）进行时间延时成像，以测量肌节缩短。我们还展示了图案化培养有助于肌节的排列。此外，我们介绍了一种使用腺相关病毒（AAV）标记肌节的替代方法，该方法可广泛应用于患者来源的诱导多能干细胞。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 小鼠多能干细胞的分化

  1. 小鼠胚胎干细胞的维持
    1. 维持培养基：将50 mL胎牛血清（FBS）、5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL非必需氨基酸（NEAA）、5 mL 100 mM丙酮酸钠和909 μL 55 mM 2-巯基乙醇加入450 mL格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中混合。分别以1000 U/mL、1 μM和3 μM的终浓度补充白血病抑制因子（LIF）、CHIR-99021和PD0325901。通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
    2. FBS培养基：将55 mL FBS、5.5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5.5 mL丙酮酸钠和5.5 mL NEAA加入500 mL高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中混合。通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
    3. 如前所述18，在明胶包被的6 cm培养皿中，使用维持培养基培养SMM18小鼠胚胎干细胞系，其中TagRFP已敲入Myom2位点。每2-3天传代一次。
  2. 无血清分化（SFD）培养基的制备
    1. 基础SFD：将250 mL Ham's F-12、750 mL伊丝科改良杜尔贝科培养基（IMDM）、10 mL不含维生素A的B27添加剂、5 mL N2添加剂、10 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL含10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）以及10 mL青霉素-链霉素（10,000 U/mL）混合。通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
    2. 将抗坏血酸以5 mg/mL浓度溶于蒸馏水中，并通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
    3. 将13 µL 1-硫代甘油稀释至1 mL IMDM中。此后将此稀释液称为MTG。
    4. 在使用当天，向1 mL基础SFD中加入10 µL抗坏血酸（5 mg/mL）和3 µL MTG。此后将此混合物称为完全SFD。
  3. 第0天，拟胚体（EB）形成以启动分化
    1. 使用重组类胰蛋白酶（rTrypsin）收获SMM18小鼠胚胎干细胞并计数细胞。
    2. 将5 × 105个细胞在4 °C下以300 × g离心3分钟，重悬于10 mL完全SFD中，接种至10 cm培养皿中。在37 °C、5% CO2条件下培养50小时。
  4. 分化第2天
    1. 向完全SFD中添加激活素A（Activin A）、人血管内皮生长因子（hVEGF）和骨形态发生蛋白4（BMP4），使其终浓度分别为5 ng/mL、5 ng/mL和1.9 ng/mL。
      ​注意：BMP4的最适浓度可能因批次不同而异。在使用新批次前，应先进行小规模预实验测试多个浓度，以确定心脏分化的最佳浓度。
    2. 将拟胚体从培养皿转移至15 mL离心管中，在4 °C下以50–100 × g离心3分钟。
    3. 同时，将步骤1.4.1中配制的培养基加入原培养皿中，以防止残留拟胚体干燥。
    4. 吸除15 mL管中的上清液，用培养皿中的培养基重悬拟胚体，再将悬液转移回培养皿中。随后在37 °C、5% CO2条件下继续培养46小时。
  5. 分化第4天
    1. 用5–10 mL 0.1%明胶对10 cm组织培养处理皿进行明胶包被，至少孵育5分钟。接种细胞前吸除明胶溶液。
    2. 配制培养基：将碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、FGF10和hVEGF加入完全SFD中，使其终浓度分别为5 ng/mL、25 ng/mL和5 ng/mL。为10 cm培养皿准备10 mL培养基。
    3. 将细胞从培养皿转移至15 mL离心管中。向培养皿中加入5 mL PBS，反复冲洗数次，并将洗液转移至15 mL离心管以收集残留细胞。在4 °C下以50–100 × g离心3分钟。
    4. 吸除上清液，加入1 mL rTrypsin，在37 °C孵育3分钟。
    5. 短暂涡旋以解离拟胚体，加入9 mL含10% FBS的培养基，再次涡旋，然后计数细胞。
    6. 将1.5 × 107个细胞在4 °C下以300 × g离心3分钟，用步骤1.4.2中配制的培养基重悬后接种至明胶包被的培养皿中。在37 °C、5% CO2条件下培养2天。
      NOTE：至第7或第8天，可观察到大量跳动的PSC-CMs。
  6. 分化第7天和第9天进行药物筛选：在分化第7天和第9天，更换含嘌呤霉素（终浓度2 μg/mL）的培养基，以清除非心肌细胞。
    ​注意：SMM18的亲本细胞系为syNP4小鼠胚胎干细胞，其携带由NCX1启动子驱动的嘌呤霉素抗性基因20。
  7. 第10天，重铺细胞用于后续实验
    1. 用0.1%明胶包被玻璃底培养板或含聚合物盖玻片的35 mm成像皿。为促进成熟，可在室温下用层粘连蛋白-511 E8片段（LN511-E8）以1 μg/cm2浓度包被30–60分钟18。若需将PSC-CMs培养成特定图案，请参考步骤4和5制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印章。
    2. 收获SMM18 PSC-CMs时，用PBS洗涤培养皿两次，加入1 mL rTrypsin，在37 °C孵育3分钟。
    3. 用9 mL含10% FBS的培养基收集细胞，重悬并计数。将50,000–100,000个细胞接种至24孔板的一个孔中，或将250,000–500,000个细胞接种至35 mm成像皿中。
    4. 离心足够数量的细胞（300 × g，3分钟），并用补充了FBS（终浓度10%）的完全SFD重悬细胞。
    5. 过夜孵育后，更换为含嘌呤霉素的完全SFD培养基。
    6. 从第14天起，每周更换2–3次完全SFD培养基，直至第21–28天，此时Myom2-RFP表达显著增强。如需使用AAV介导的荧光标记肌节蛋白转导，请参考步骤3。

2. 人类多能干细胞的分化

  1. 分化培养基的制备
    1. RPMI+B27-Ins：将500 mL RPMI 1640培养基、10 mL不含胰岛素的B27补充剂（B27 minus insulin）和5.25 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺混合。
    2. RPMI+B27+Ins：将500 mL RPMI培养基、10 mL B27补充剂（B27 supplement）和5.25 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺混合。
  2. 人iPS细胞的维持
    1. 按照先前发表的方法并稍作修改，在LN511-E8包被的培养板上使用AK02N培养基每周传代人iPS细胞两次21。
    2. 用rTrypsin处理3分钟收获细胞，并收集至含10%胎牛血清（FBS）的培养基中。计数细胞后，在4 °C条件下以300 × g离心3分钟。将75,000–125,000个细胞接种至6孔板的一个孔中，加入2 mL AK02N培养基，并添加LN511-E8（终浓度0.5 μg/mL，即0.1 µg/cm2）和Y27632（终浓度10 μM）。
    3. 在37 °C、5% CO2条件下培养，次日更换为2 mL不含任何添加剂的AK02N培养基。每两到三天更换一次培养基，每三到四天传代一次。
  3. 第-4天：分化前重铺细胞
    1. 用PBS稀释LN511-E8至0.5 μg/cm2，包被6孔板。然后在37 °C、5% CO2条件下孵育至少30分钟，或在室温下孵育1小时。接种细胞前吸除包被液。
    2. 用rTrypsin收获人iPS细胞，并按照步骤2.2.2进行细胞计数。
    3. 将1.25 × 105个细胞（每孔）在4 °C条件下以300 × g离心3分钟，重悬于2 mL AK02N培养基中，每孔培养基中添加LN511-E8（终浓度0.5 μg/mL或0.1 μg/cm2）和Y27632（终浓度10 μM）。
    4. 吸除包被液，将重悬的细胞接种至包被好的培养板中，在37 °C、5% CO2条件下孵育。
  4. 第-3天和第-1天：更换为2 mL AK02N培养基。
  5. 第0天：每孔更换为2 mL含CHIR99021（终浓度6 μM）的RPMI+B27-Ins培养基，启动分化。
  6. 第2天：每孔更换为2 mL含WntC59（终浓度2 μM）的RPMI+B27-Ins培养基。
  7. 第4天：每孔更换为2 mL RPMI+B27-Ins培养基。
  8. 第7天和第9天：每孔更换为2 mL含嘌呤霉素（终浓度10 μg/mL）的RPMI+B27+Ins培养基，以选择性培养PSC-CMs。
    ​注：本研究所用的ACTN2-mCherry细胞系，在TNNT2基因座的3′非翻译区（UTR）插入了内部核糖体进入位点（IRES）和嘌呤霉素抗性基因，并用mCherry替换了ACTN2的终止密码子。若需在无基因敲入的情况下纯化心肌细胞，请参见步骤3和4。
  9. 第10天：为后续实验重铺细胞
    1. 用0.1%明胶稀释LN511-E8至0.5–1 μg/cm2，包被带有聚合物盖玻片的35 mm成像培养皿。室温孵育2–4小时以保证长期存活率。若需将PSC-CMs培养成特定图案，请参见步骤4和5以制备PDMS印章。
    2. 收获人PSC-CMs时，用PBS洗涤培养皿两次，每孔加入1 mL rTrypsin，在37 °C孵育3分钟。
    3. 用4 mL含10% FBS的培养基收集细胞，重悬并计数。每35 mm成像培养皿接种250,000–500,000个细胞。
    4. 取足够数量的细胞在4 °C条件下以300 × g离心3分钟，用含嘌呤霉素（10 μg/mL）的RPMI+B27+Ins培养基重悬，接种至包被好的35 mm成像培养皿中。
    5. 过夜孵育。次日早晨，更换为含嘌呤霉素（10 μg/mL）的RPMI+B27+Ins培养基。
    6. 从第14天起，每周更换2–3次RPMI+B27+Ins培养基，持续至第21–28天用于成像。如需通过AAV介导转导荧光标记的肌节蛋白，请参见步骤3。

3. 使用腺相关病毒对肌节进行荧光标记

  1. 腺相关病毒（AAV）生产前的准备
    1. 在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于10 cm组织培养皿中培养HEK293T细胞，每周传代三次。
    2. 配制1 mg/mL的聚乙烯亚胺（PEI）溶液：将50 mg聚乙烯亚胺MAX 40000与40 mL超纯水混合，用1 N NaOH调节pH至7.0，再用超纯水定容至50 mL，经0.22 μm滤器过滤。
    3. 构建一个携带肌节标记基因（例如TCAP或PDLIM3与绿色荧光蛋白[GFP]融合）的穿梭载体，该基因由心肌细胞特异性启动子（如心肌肌钙蛋白T [cTNT]）驱动22。
      ​注：本实验中使用了带有V163A、S202T、L221V突变的单体增强型GFP23。
  2. 第0天，HEK细胞传代
    1. 当细胞达到汇合状态时，将2.0 × 107个HEK293T细胞接种至15 cm组织培养皿中，加入20 mL含10% FBS的DMEM培养基。
  3. 第1天，转染
    1. 将13.5 μg穿梭载体、26 μg pHelper（编码腺病毒E2A、E4和VA基因的载体）、16.5 μg pRC6（编码AAV2 Rep和AAV6 Cap基因的载体）与1 mL不含丙酮酸钠的DMEM（DMEM-Pyr）混合。
    2. 将224 μL PEI（1 mg/mL，按步骤3.1.2配制）与776 μL DMEM-Pyr混合。
    3. 将质粒混合液与PEI混合液在室温下孵育30分钟。
    4. 将质粒/PEI混合液加入步骤3.2中准备好的HEK293T细胞中。
  4. 第2天，更换培养基
    1. 转染24小时后，更换为DMEM-Pyr培养基，继续培养细胞至第7天收获AAV。AAV将释放到培养基中。
  5. 第7天，采用最小纯化法收集、浓缩AAV并置换缓冲液24
    1. 将离心超滤装置（100k分子量截留值[MWCO]）与5 mL含1% BSA的PBS在室温下孵育15分钟，随后以500 × g离心2分钟，吸除滤过液和残留液体。
    2. 将产生AAV的15 cm培养皿中的培养基转移至新的50 mL锥形管中，以500 × g离心5分钟。将上清液经0.45 μm注射器滤器过滤以去除细胞碎片，然后加入超滤装置中。
    3. 以2000 × g离心90分钟，或直至将培养上清浓缩至0.5–1 mL。
    4. 吸除滤液，向超滤装置中加入15 mL PBS。
    5. 重复离心，直至浓缩液体积达到0.5–1 mL。
    6. 重复步骤3.5.4和3.5.5。
    7. 将浓缩后的AAV转移至新的1.5 mL离心管中，于4 °C或-20 °C保存。
      ​注：AAV可在P1级设施中使用，但需遵守当地法规。AAV也可通过常规方法生产。
  6. AAV滴度的计算
    1. 将5 μL AAV、195 μL DMEM-Pyr和10 U苯甲酸酶混合，在37 °C孵育1小时。
    2. 加入200 μL蛋白酶K缓冲液（0.02 M Tris HCl和1% SDS）和5 μL蛋白酶K（20 mg/mL），在37 °C孵育1小时。
    3. 小心配制400 μL 25:24:1的苯酚/氯仿/异戊醇溶液，涡旋1分钟，以20,000 × g离心1分钟。
    4. 将200 μL水相转移至新的1.5 mL离心管中，可获得约一半原始AAV基因组。
    5. 在20 μL 3 M CH3COONa（pH 5.2）中加入1 μL糖原（20 mg/mL），涡旋；再向100 μL 100%乙醇中加入250 μL 2-丙醇，再次涡旋。
    6. 在-80 °C孵育15分钟，然后在4 °C以20,000 × g离心30分钟。
    7. 吸除上清液，向管中加入70%乙醇，再于4 °C以20,000 × g离心5分钟。
    8. 吸除上清液，空气干燥至沉淀透明。
    9. 加入200 μL Tris-乙二胺四乙酸（TE；pH 8.0）溶解AAV基因组，然后用TE稀释100倍。
    10. 用TE将pAAV-CMV-Vector标准品配制成6.5 ng/μL，以获得109 拷贝/μL的病毒基因组（vg/μL），然后用TE进行10倍系列稀释，浓度范围为104至108。
    11. 将1 μL样本DNA（或标准品）、0.4 μL引物（5 μM）、3.6 μL蒸馏水和5 μL SYBR Green主混合液混合。引物位于ITR区域，序列为5′-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3′和5′-CGGCCTCAGTGAGCGA-3′。
    12. 进行实时PCR，程序如下：95 °C预变性60秒，40个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火与延伸30秒），随后进行熔解曲线分析。
    13. 根据标准曲线和Ct值，实时PCR仪可提供每1 μL样本中病毒基因组的拷贝数。使用以下公式计算原始AAV滴度：实时PCR提供的拷贝数（vg/μL）× 8 × 103 × 2，其中8 × 103为AAV基因组提取过程中的稀释倍数，2为AAV（单链）与质粒（双链）之间的换算系数。
  7. 向PSC-CMs转导AAV
    1. 在额外的孔或培养皿中计数PSC-CMs。
    2. 将AAV稀释至1 × 104至1 × 106 vg/细胞，用PBS定容至50 μL。以感染复数（MOI）为1 × 104至1 × 106 vg/细胞的剂量将AAV加入PSC-CMs中，并在相应的小鼠或人源PSC-CMs分化培养基中继续培养3天，随后更换为不含AAV的培养基。
    3. 转导后7天或更长时间，使用PSC-CMs进行活细胞成像。

4. [可选] 基于 AAV 的 PSC-CMs 纯化

  1. 腺相关病毒（AAV）的制备
    1. 按照步骤3所述方法制备AAV，使用在cTNT启动子调控下表达杀稻瘟菌素抗性基因的穿梭载体。
  2. 对分化中的iPS细胞进行转导
    1. 按照步骤2所述方案将人iPS细胞分化4天，并在额外的一个孔中计数细胞数量。
    2. 第4天换液后，在RPMI+B27-Ins培养基中以1 × 105 vg/细胞的感染复数（MOI）加入AAV至正在分化的PSC中。
    3. 第7天，更换为RPMI+B27+Ins培养基，并添加2.5–10 μg/mL杀稻瘟菌素。
    4. 第10天，PSC-CM已准备好进行传代培养。

5. PDMS印章的制备

  1. 使用计算机辅助设计（CAD）绘图软件设计器件图案，包括宽度为200 μm的条带以及条带之间10–25 μm的沟槽。
  2. 利用无掩模光刻工具的紫外光，将器件图案绘制到涂有AZP1350的铬掩模上。
  3. 使用正性光刻胶显影液（例如铬蚀刻剂）对掩模上的图案进行显影，并用去离子水冲洗。
  4. 将硅片置于热板上，在120 °C下脱水15分钟。
  5. 待硅片冷却至室温后，使用旋涂仪以1500 rpm的转速旋涂负性光刻胶SU-8 3010，持续30秒，形成10–20 μm高度的涂层。
  6. 根据制造商的说明，在热板上分两步对硅片进行前烘（软烘）。
  7. 待硅片冷却至室温后，将其装载到掩模对准仪上。
  8. 使用掩模对准仪将掩模与硅片对准，并用紫外光照射硅片进行曝光。
  9. 根据制造商的说明，在热板上分两步对硅片进行曝光后烘烤。
  10. 将硅片依次在SU-8显影液和2-丙醇中进行显影，然后用氮气流吹干。
  11. 将硅片转移至合适尺寸的培养皿中。
  12. 按10:1（质量比）混合PDMS弹性体与其固化剂，并将混合物倒入培养皿中。
  13. 将PDMS置于真空干燥器中脱气，直至所有气泡消失，然后在80 °C热板上固化2小时。
  14. 使用镊子将固化的PDMS从母模上剥离，然后裁剪出带有图案的部分作为PDMS印章。
    ​注意：形状可以为正方形，但八边形在边缘处的图案转移效果更佳。

6. 多能干细胞来源心肌细胞的图案化培养

  1. 使用修补胶带去除PDMS印章表面的灰尘。
  2. 将印章浸入70%乙醇中进行灭菌，然后使用气吹罐将印章表面的乙醇吹干。
  3. 在PDMS印章表面滴加5–10 μL的0.5 wt% 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱（MPC）聚合物/乙醇溶液。
    注意：MPC聚合物分布不均可能导致图案中断。
  4. 孵育10–30分钟，直至MPC聚合物完全干燥。
  5. 将印章与玻璃底培养板或带有聚合物盖玻片的35 mm成像皿的盖玻片接触，并在印章上放置一个重物（例如AAA电池），保持10分钟。
  6. 移除重物和印章，然后在显微镜下确认图案已成功转移。
    注意： stamped plates/dishes可在室温下保存最长1周。
  7. 用PBS洗涤stamped孔/皿两次。
  8. 用PBS将LN511-E8稀释至2–4 μg/mL，并以0.5–1 μg/cm2的量包被培养皿。对于人多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs），应使用0.1%明胶溶液代替PBS稀释LN511-E8。然后孵育至少1小时（最佳为超过4小时）。
  9. 按照前文所述方法接种细胞。

7. 荧光显微镜下肌节的延时成像

  1. 打开显微镜、相关计算机以及所有必需的外设，并完成连接。
  2. 进行延时成像时，使用最高放大倍数（100倍油镜）采集延时图像。
  3. 选择活细胞成像条件。为获得具有代表性的良好数据，应尽量调整至最高帧率（建议最低曝光时间为20毫秒，或每秒50帧）。保持快门开启，并应用必要的像素合并（4×4）以及采集区域裁剪，以在延时成像过程中实现最短的图像采集间隔。
    注意：具体设置可能因显微镜配置不同而有所差异。所用相机需具备高灵敏度，并能快速将数据传输至连接的计算机。为此，我们采用了配备Camera-link的ORCA flash相机。我们已测试了转盘共聚焦显微镜，并实现了每秒400帧的图像采集。
    1. [可选] 若细胞搏动频率较低，可通过电场刺激激发细胞。
  4. 开始延时记录
    1. 确保在延时图像记录过程中，成像视野始终保持在焦平面上。
    2. 将延时图像保存至合适的文件夹中。

8. 使用 ImageJ/Fiji 插件 SarcOptiM 分析延时成像

  1. 将一系列延时图像加载到 ImageJ 中。对于 Olympus VSI 格式，需通过 OlympusViewer 插件打开文件。
  2. 调整图像的亮度和对比度，以清晰观察肌节结构（图像 | 调整 | 亮度/对比度）。
  3. 点击 更多工具 菜单（>>），然后选择 SarcOptiM，以打开 SarcOptiM 程序。
  4. 按住 Ctrl + Shift + P，然后在工具栏上点击 1 μm 按钮，并根据对话框中的提示完成程序校准。
  5. 在肌节区域绘制一条线，用于测量肌节缩短。
  6. 在工具栏上点击 SingleCell (AVI)，开始肌节缩短分析。代表性数据见图 1 和 图 2。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

利用基因敲入的PSC-CMs报告细胞系测量肌节缩短。 使用标记了肌节的PSC-CMs来测量肌节缩短。这些细胞系在内源性位点表达Myom2-RFP和ACTN2-mCherry。TagRFP被插入到Myom2基因中，该基因编码定位于M线的M蛋白；而mCherry则被敲入到ACTN2基因中，该基因编码定位于Z线的α-辅肌动蛋白18,25。通过获取并分析延时图像来确定肌节缩短，结果如图1、图2以及视频1-3所示。

为了克服PSC-CMs中肌节排列紊乱的问题，使用特定的PDMS印章将PSC-CMs以条带模式进行培养。与非图案区域培养的细胞相比，这种图案化培养促进了细胞形态的伸长...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

PSC-CMs 具有巨大的潜力，可作为 体外平台用于模拟心脏疾病并测试药物的作用。然而，必须首先建立一种准确且统一的方法来评估 PSC-CMs 的功能。目前大多数功能检测方法均可应用于 PSC-CMs，例如电生理学、钙瞬变和代谢分析26，其中最早的一项基于患者来源的 PSC-CM 研究即针对长QT综合征27。然而，收缩力作为心肌细胞最重要的功能之一，仍难以准确评估。对于成年心肌细胞，通常广泛采用肌节缩短检测方法。相比之下，由于 PSC-CMs 的肌节发育不成熟且结构紊乱，标准的肌节缩短检测方法并不适用于这类细胞。因此，我们提出了一种替代方法，即利用荧光标记的肌节蛋白来检测 PSC-CMs 中的肌节缩短。如研究所示，可将定位于M线（MYOM2）或Z线（ACTN2、TCAP 和 PDLIM3）的蛋白与荧光蛋白融合，用于该方法。我们还证明，荧光标记蛋白可通过内源性位点或腺相关病毒（AAV）进行表达。相较于内源性位点，AAV 在表达荧光标记蛋白方面更具灵活性，因其可应用于任何类型的患者来源的 PSC-CMs。相反，通过内源...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

H.U. 已就本手稿提交了专利申请。

致谢

我们谨向日本医科大学再生医学系的所有实验室成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的有益讨论和技术支持。本研究得到了日本医疗研究开发机构（AMED；JP18bm0704012 和 JP20bm0804018）、日本学术振兴会（JSPS；JP19KK0219）以及日本循环器学会（基础研究资助）向 H.U. 提供的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1-巯基甘油Sigma-AldrichM6145-25
2-巯基乙醇（55 mM）赛默飞世尔科技21985-023
2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（MPC）聚合物，NOF Corp.LIPIDURE-CM5206
2-丙醇富士胶片和光166-04836
带聚合物盖玻片的35 mm成像培养皿（µ- 培养皿（35 mm，高）ibidi81156
AAVproR 无辅助系统（AAV6）
（载体；pHelper、pRC6、pAAV-CMV-载体）		Takara6651
ACTN2-mCherry（AR12，AR21）hiPSCsN.A.我们在610B1 hiPSC细胞系中，将IRES-嘌呤霉素抗性盒插入TNNT2基因座的3'非翻译区，并在ACTN2终止密码子附近插入mCherry，具体方法参照 elsewhere（Anzai, Methods Mol Biol, in press）所述
B-27 补充剂（50倍浓缩，无血清）赛默飞世尔科技17504-044
B-27 补充剂（不含胰岛素）赛默飞世尔科技A18956-01
B27添加剂（50倍浓度），不含维生素A赛默飞世尔科技12587-010
Benzonase（25 U/µL)默克密理博70746
盐酸博莱霉素 S富士胶片和光029-18701
BMP-4，人，重组R&D Systems, Inc.314-BP-010
牛血清白蛋白Sigma-AldrichA4503-100g
C59，Wnt 拮抗剂（WntC59）abcamab142216
CAD 绘图软件，Robert McNeel and Associates, WA, 美国Rhinoceros 6.0
超滤离心单元（100 k MWCO），Vivaspin-20赛多利斯VS2042
CHIR99021Cayman13122
铬蚀刻剂日本化学产业株式会社，日本N14B
涂覆AZP1350的铬掩模日本 Clean Surface Technology 公司CBL2506Bu-AZP
Dr. GenTLE 沉淀载体（20 mg/mL 甘油，3 M 醋酸钠（pH 5.2））Takara9094
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）- 高糖Sigma-AldrichD6429-500
杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）— 高糖，不含丙酮酸钠Sigma-AldrichD5796
乙醇（99.5）富士胶片和光057-00456
胎牛血清Moregate59301104
FGF-10，人源，重组R&D Systems, Inc.345-FG-025
碱性成纤维细胞生长因子，人，重组富士胶片和光060-04543
猪皮明胶粉末Sigma-AldrichG1890-100g
格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）Sigma-AldrichG5154-500
玻璃底培养皿MatTekP24G-1.5-13-F/H
Ham’s F-12Thermo Fisher Scientific11765-062
Iscove改良型Dulbecco培养基（IMDM）赛默飞世尔科技12440-061
L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX 补充剂，200 mM）赛默飞世尔科技35050-061
L(+)-抗坏血酸钠盐富士胶片和光196-01252
层粘连蛋白-511 E8 片段（LN511-E8，iMatrix-511）Nippi892012
掩模对准器日本Union Optical Co., Ltd.PEM-800
无掩模光刻工具NanoSystem Solutions, Inc.，日本D-Light DL-1000
MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩）Thermo Fisher Scientific11140-050
Millex-HV 注射器滤器单元，0.45 µ微米，PVDF（0.45-µm 滤光片默克密理博SLHVR33RS
Myom2-RFP（SMM18）N.A.在我们之前的研究论文中开发（Chanthra, Sci Rep, 2020）
N-2 Supplement（100倍浓缩）赛默飞世尔科技17502-048
ORCA-Flash4.0 V3 数字CMOS相机滨松C13440-20CU
PD0325901Stemgent04-0006-10
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140-122
培养皿Sansei Medical Co. Ltd01-004
苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）Nippon Gene311-90151
聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体美国密歇根州陶氏康宁公司SILPOT 184
聚乙烯亚胺 MAX（分子量 40,000）Polyscience24765-1
正性光刻胶显影液东京应化工业株式会社，日本NMD-3
PowerUp SYBR Green Master Mix赛默飞世尔科技A25742
蛋白酶KTakara9034
嘌呤霉素二盐酸盐富士胶片和光166-23153
重组人/小鼠/大鼠 Activin A 蛋白R&D Systems, Inc.338-AC-050
重组类胰蛋白酶（rTrypsin；TrypLE express）Thermo Fisher Scientific12604-039
RPMI1640 培养基Thermo Fisher Scientific11875-119
硅片日本松崎制作所有限公司N.A.
丙酮酸钠（100 mM）Thermo Fisher Scientific11360-070
旋转涂布机Mikasa Co., Ltd.，日本MS-A100
旋转共聚焦显微镜Oxford InstrumentsAndor Dragonfly 旋转盘系统
StemSure LIF，小鼠，重组，溶液（10^6U）富士胶片和光195-16053
SU-8 3010Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国SU-8 3010
SU-8 显影液Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国SU-8 显影液
Tris-EDTANippon Gene314-90021
血管内皮生长因子-A165（VEGF），人，重组富士胶片和光226-01781

参考文献

  1. Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
  2. Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family Physician. 79 (9), 778-784 (2009).
  3. Parrotta, E. I., Lucchino, V., Scaramuzzino, L., Scalise, S., Cuda, G. Modeling Cardiac Disease Mechanisms Using Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes: Progress, Promises and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. , 30(2020).
  4. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  5. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  6. Kim, C., et al. Studying arrhythmogenic right ventricular dysplasia with patient-specific iPSCs. Nature. 494 (7435), 105-110 (2013).
  7. Gramlich, M., et al. Antisense-mediated exon skipping: a therapeutic strategy for titin-based dilated cardiomyopathy. EMBO Molecular Medicine. 7 (5), 562-576 (2015).
  8. Wang, G., et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine. 20 (6), 616-623 (2014).
  9. Li, S., et al. Mitochondrial Dysfunctions Contribute to Hypertrophic Cardiomyopathy in Patient iPSC-Derived Cardiomyocytes with MT-RNR2 Mutation. Stem Cell Reports. 10 (3), 808-821 (2018).
  10. Cho, G. -S., et al. Neonatal Transplantation Confers Maturation of PSC-Derived Cardiomyocytes Conducive to Modeling Cardiomyopathy. Cell Reports. 18 (2), 571-582 (2017).
  11. Yang, X., et al. Tri-iodo-l-thyronine promotes the maturation of human cardiomyocytes-derived from induced pluripotent stem cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 296-304 (2014).
  12. Ribeiro, A. J. S., et al. Multi-Imaging Method to Assay the Contractile Mechanical Output of Micropatterned Human iPSC-Derived Cardiac Myocytes. Circulation Research. 120 (10), 1572-1583 (2017).
  13. Sewanan, L. R., Campbell, S. G. Modelling sarcomeric cardiomyopathies with human cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. The Journal of Physiology. 598 (14), 2909-2922 (2020).
  14. Kopljar, I., et al. Chronic drug-induced effects on contractile motion properties and cardiac biomarkers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. British Journal of Pharmacology. 174 (21), 3766-3779 (2017).
  15. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nature Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  16. Ribeiro, A. J. S., et al. Contractility of single cardiomyocytes differentiated from pluripotent stem cells depends on physiological shape and substrate stiffness. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (41), 12705-12710 (2015).
  17. Roberts, B., et al. Fluorescent Gene Tagging of Transcriptionally Silent Genes in hiPSCs. Stem Cell Reports. 12 (5), 1145-1158 (2019).
  18. Chanthra, N., et al. A Novel Fluorescent Reporter System Identifies Laminin-511/521 as Potent Regulators of Cardiomyocyte Maturation. Scientific Reports. 10 (1), 4249(2020).
  19. Ribeiro, M. C., et al. A cardiomyocyte show of force: A fluorescent alpha-actinin reporter line sheds light on human cardiomyocyte contractility versus substrate stiffness. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 141, 54-64 (2020).
  20. Yamanaka, S., Zahanich, I., Wersto, R. P., Boheler, K. R. Enhanced Proliferation of Monolayer Cultures of Embryonic Stem (ES) Cell-Derived Cardiomyocytes Following Acute Loss of Retinoblastoma. PLoS ONE. 3 (12), 3896(2008).
  21. Miyazaki, T., Isobe, T., Nakatsuji, N., Suemori, H. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7 (1), 41165(2017).
  22. Prasad, K. -M. R., Xu, Y., Yang, Z., Acton, S. T., French, B. A. Robust cardiomyocyte-specific gene expression following systemic injection of AAV: in vivo gene delivery follows a Poisson distribution. Gene Therapy. 18 (1), 43-52 (2011).
  23. Arakawa, H., et al. Protein evolution by hypermutation and selection in the B cell line DT40. Nucleic Acids Research. 36 (1), e1(2007).
  24. Konno, A., Hirai, H. Efficient whole brain transduction by systemic infusion of minimally purified AAV-PHP.eB. Journal of Neuroscience Methods. 346, 108914(2020).
  25. Anzai, T., et al. Generation of Efficient Knock-in Mouse and Human Pluripotent Stem Cells Using CRISPR-Cas9. Methods of Molecular Biology. Yoshida, Y., et al. , (2020).
  26. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A Brief Review of Current Maturation Methods for Human Induced Pluripotent Stem Cells-Derived Cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178(2020).
  27. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  28. Flores, L. R., Keeling, M. C., Zhang, X., Sliogeryte, K., Gavara, N. Lifeact-GFP alters F-actin organization, cellular morphology and biophysical behaviour. Scientific Reports. 9 (1), 3241(2019).
  29. Sparrow, A. J., et al. Measurement of Myofilament-Localized Calcium Dynamics in Adult Cardiomyocytes and the Effect of Hypertrophic Cardiomyopathy Mutations. Circulation Research. 124 (8), 1228-1239 (2019).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

多能干细胞心肌细胞分化活细胞荧光成像图案化细胞培养腺相关病毒转导延时成像心脏疾病建模ImageJ SarcOptiM
利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。