该方法可用于利用带有荧光标记的肌节蛋白的多能干细胞衍生心肌细胞，检测肌节缩短。
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方法文章
利用荧光标记的肌节蛋白检测多能干细胞来源心肌细胞的肌节缩短
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多能干细胞来源的心肌细胞（PSC-CMs）可由胚胎干细胞和诱导性多能干细胞（ES/iPS细胞）分化获得。这些细胞为心脏疾病建模提供了极具前景的细胞来源。在心肌病研究中，肌节缩短是评估成年心肌细胞疾病表型的标准生理学检测指标之一。然而，现有的方法并不适用于评估PSC-CMs的收缩功能，因为这些细胞的肌节发育尚不成熟，在相差显微镜下无法观察到。为解决这一问题并实现对PSC-CMs的肌节缩短分析，本研究采用了荧光标记的肌节蛋白结合活细胞成像技术。肌节两端为细小的Z线，中心为M线。Z线蛋白——α-辅肌动蛋白（ACTN2）、连接蛋白（TCAP）和肌动蛋白相关LIM蛋白（PDLIM3）——以及一种M线蛋白——肌球蛋白结合蛋白-2（Myom2）——均被标记上荧光蛋白。这些标记蛋白可通过基因敲入方式在内源等位基因位点表达，也可通过腺相关病毒（AAVs）进行外源表达。本文介绍了将小鼠和人类多能干细胞分化为心肌细胞、制备腺相关病毒（AAVs）、实施并分析活细胞成像的实验方法。此外，还描述了制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）印模的方法，用于实现PSC-CMs的图案化培养，从而促进带有荧光标记蛋白的肌节缩短分析。为评估肌节缩短情况，在电刺激（0.5–1 Hz）条件下，以高帧率（每秒50–100帧）记录跳动细胞的时间序列图像。为分析细胞收缩过程中肌节长度的变化，将所记录的时间序列图像导入SarcOptiM插件（ImageJ/Fiji平台）进行分析。本策略为研究PSC-CMs中的心脏疾病表型提供了一个简便的实验平台。
引言
心血管疾病是全球范围内导致死亡的首要原因1 心肌病是心脏相关死亡的第三大原因2心肌病是一类影响心肌的疾病总称。近年来，诱导性多能干细胞（iPS细胞）的发展以及将iPS细胞定向分化为心肌细胞（PSC-CMs）的技术进步，为利用患者基因组研究心肌细胞开辟了新途径 体外 心肌病模型。这些细胞可用于理解心脏疾病的病理生理学，阐明其分子机制，并测试不同的治疗候选药物。3因此，人们对此产生了极大的兴趣，已生成了患者来源的诱导多能干细胞（例如，肥厚型心肌病 [HCM]）4,5致心律失常性右室心肌病 [ARVC]6扩张型心肌病 [DCM]7以及线粒体相关性心肌病8,9由于心肌病的特征之一是肌节功能障碍和结构破坏，因此需要一种能够均匀测量肌节功能的有效工具。
肌节缩短是评估来自动物模型和人类的成年心肌细胞中肌节功能及收缩力最常用的技术。进行肌节缩短实验需要具有清晰可见的、在相差显微镜下可观察到的良好发育肌节结....
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方案
1. 小鼠多能干细胞的分化
- 小鼠胚胎干细胞的维持
- 维持培养基：将50 mL胎牛血清（FBS）、5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL非必需氨基酸（NEAA）、5 mL 100 mM丙酮酸钠和909 μL 55 mM 2-巯基乙醇加入450 mL格拉斯哥最低必需培养基（GMEM）中混合。分别以1000 U/mL、1 μM和3 μM的终浓度补充白血病抑制因子（LIF）、CHIR-99021和PD0325901。通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
- FBS培养基：将55 mL FBS、5.5 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5.5 mL丙酮酸钠和5.5 mL NEAA加入500 mL高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中混合。通过0.22 μm滤器过滤灭菌。
- 如前所述18，在明胶包被的6 cm培养皿中，使用维持培养基培养SMM18小鼠胚胎干细胞系，其中TagRFP已敲入Myom2位点。每2-3天传代一次。
- 无血清分化（SFD）培养基的制备
- 基础SFD：将250 mL Ham's F-12、750 mL伊丝科改良杜尔贝科培养基（IMDM）、10 mL不含维生素A的B27添加剂、5 mL N2添加剂、10 mL L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、5 mL含10%牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液（PBS）以及10 mL青霉素....
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结果
利用基因敲入的PSC-CMs报告细胞系测量肌节缩短。 使用标记了肌节的PSC-CMs来测量肌节缩短。这些细胞系在内源性位点表达Myom2-RFP和ACTN2-mCherry。TagRFP被插入到Myom2基因中，该基因编码定位于M线的M蛋白；而mCherry则被敲入到ACTN2基因中，该基因编码定位于Z线的α-辅肌动蛋白18,25。通过获取并分析延时图像来确定肌节缩短，结果如图1、图2以及视频1-3所示。
为了克服PSC-CMs中肌节排列紊乱的问题，使用特定的PDMS印章将PSC-CMs以条带模式进行培养。与非图案区域培养的细胞相比，这种图案化培养促进了细胞形态的伸长.......
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讨论
PSC-CMs 具有巨大的潜力，可作为 体外平台用于模拟心脏疾病并测试药物的作用。然而，必须首先建立一种准确且统一的方法来评估 PSC-CMs 的功能。目前大多数功能检测方法均可应用于 PSC-CMs，例如电生理学、钙瞬变和代谢分析26，其中最早的一项基于患者来源的 PSC-CM 研究即针对长QT综合征27。然而，收缩力作为心肌细胞最重要的功能之一，仍难以准确评估。对于成年心肌细胞，通常广泛采用肌节缩短检测方法。相比之下，由于 PSC-CMs 的肌节发育不成熟且结构紊乱，标准的肌节缩短检测方法并不适用于这类细胞。因此，我们提出了一种替代方法，即利用荧光标记的肌节蛋白来检测 PSC-CMs 中的肌节缩短。如研究所示，可将定位于M线（MYOM2）或Z线（ACTN2、TCAP 和 PDLIM3）的蛋白与荧光蛋白融合，用于该方法。我们还证明，荧光标记蛋白可通过内源性位点或腺相关病毒（AAV）进行表达。相较于内源性位点，AAV 在表达荧光标记蛋白方面更具灵活性，因其可应用于任何类型的患者来源的 PSC-CMs。相反，通过内源.......
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披露
H.U. 已就本手稿提交了专利申请。
致谢
我们谨向日本医科大学再生医学系的所有实验室成员致以诚挚感谢，感谢他们提供的有益讨论和技术支持。本研究得到了日本医疗研究开发机构（AMED；JP18bm0704012 和 JP20bm0804018）、日本学术振兴会（JSPS；JP19KK0219）以及日本循环器学会（基础研究资助）向 H.U. 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1-巯基甘油 | Sigma-Aldrich | M6145-25 | |
| 2-巯基乙醇（55 mM） | 赛默飞世尔科技 | 21985-023 | |
| 2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱（MPC）聚合物， | NOF Corp. | LIPIDURE-CM5206 | |
| 2-丙醇 | 富士胶片和光 | 166-04836 | |
| 带聚合物盖玻片的35 mm成像培养皿（µ- 培养皿（35 mm，高） | ibidi | 81156 | |
| AAVproR 无辅助系统（AAV6） （载体；pHelper、pRC6、pAAV-CMV-载体） | Takara | 6651 | |
| ACTN2-mCherry（AR12，AR21）hiPSCs | N.A. | 我们在610B1 hiPSC细胞系中，将IRES-嘌呤霉素抗性盒插入TNNT2基因座的3'非翻译区，并在ACTN2终止密码子附近插入mCherry，具体方法参照 elsewhere（Anzai, Methods Mol Biol, in press）所述 | |
| B-27 补充剂（50倍浓缩，无血清） | 赛默飞世尔科技 | 17504-044 | |
| B-27 补充剂（不含胰岛素） | 赛默飞世尔科技 | A18956-01 | |
| B27添加剂（50倍浓度），不含维生素A | 赛默飞世尔科技 | 12587-010 | |
| Benzonase（25 U/µL) | 默克密理博 | 70746 | |
| 盐酸博莱霉素 S | 富士胶片和光 | 029-18701 | |
| BMP-4，人，重组 | R&D Systems, Inc. | 314-BP-010 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A4503-100g | |
| C59，Wnt 拮抗剂（WntC59） | abcam | ab142216 | |
| CAD 绘图软件， | Robert McNeel and Associates, WA, 美国 | Rhinoceros 6.0 | |
| 超滤离心单元（100 k MWCO），Vivaspin-20 | 赛多利斯 | VS2042 | |
| CHIR99021 | Cayman | 13122 | |
| 铬蚀刻剂 | 日本化学产业株式会社，日本 | N14B | |
| 涂覆AZP1350的铬掩模 | 日本 Clean Surface Technology 公司 | CBL2506Bu-AZP | |
| Dr. GenTLE 沉淀载体（20 mg/mL 甘油，3 M 醋酸钠（pH 5.2）） | Takara | 9094 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）- 高糖 | Sigma-Aldrich | D6429-500 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 培养基（DMEM）— 高糖，不含丙酮酸钠 | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| 乙醇（99.5） | 富士胶片和光 | 057-00456 | |
| 胎牛血清 | Moregate | 59301104 | |
| FGF-10，人源，重组 | R&D Systems, Inc. | 345-FG-025 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子，人，重组 | 富士胶片和光 | 060-04543 | |
| 猪皮明胶粉末 | Sigma-Aldrich | G1890-100g | |
| 格拉斯哥最低必需培养基（GMEM） | Sigma-Aldrich | G5154-500 | |
| 玻璃底培养皿 | MatTek | P24G-1.5-13-F/H | |
| Ham’s F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11765-062 | |
| Iscove改良型Dulbecco培养基（IMDM） | 赛默飞世尔科技 | 12440-061 | |
| L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（GlutaMAX 补充剂，200 mM） | 赛默飞世尔科技 | 35050-061 | |
| L(+)-抗坏血酸钠盐 | 富士胶片和光 | 196-01252 | |
| 层粘连蛋白-511 E8 片段（LN511-E8，iMatrix-511） | Nippi | 892012 | |
| 掩模对准器 | 日本Union Optical Co., Ltd. | PEM-800 | |
| 无掩模光刻工具 | NanoSystem Solutions, Inc.，日本 | D-Light DL-1000 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100倍浓缩） | Thermo Fisher Scientific | 11140-050 | |
| Millex-HV 注射器滤器单元，0.45 µ微米，PVDF（0.45-µm 滤光片 | 默克密理博 | SLHVR33RS | |
| Myom2-RFP（SMM18） | N.A. | 在我们之前的研究论文中开发（Chanthra, Sci Rep, 2020） | |
| N-2 Supplement（100倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 17502-048 | |
| ORCA-Flash4.0 V3 数字CMOS相机 | 滨松 | C13440-20CU | |
| PD0325901 | Stemgent | 04-0006-10 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140-122 | |
| 培养皿 | Sansei Medical Co. Ltd | 01-004 | |
| 苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1） | Nippon Gene | 311-90151 | |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体 | 美国密歇根州陶氏康宁公司 | SILPOT 184 | |
| 聚乙烯亚胺 MAX（分子量 40,000） | Polyscience | 24765-1 | |
| 正性光刻胶显影液 | 东京应化工业株式会社，日本 | NMD-3 | |
| PowerUp SYBR Green Master Mix | 赛默飞世尔科技 | A25742 | |
| 蛋白酶K | Takara | 9034 | |
| 嘌呤霉素二盐酸盐 | 富士胶片和光 | 166-23153 | |
| 重组人/小鼠/大鼠 Activin A 蛋白 | R&D Systems, Inc. | 338-AC-050 | |
| 重组类胰蛋白酶（rTrypsin；TrypLE express） | Thermo Fisher Scientific | 12604-039 | |
| RPMI1640 培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11875-119 | |
| 硅片 | 日本松崎制作所有限公司 | N.A. | |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Thermo Fisher Scientific | 11360-070 | |
| 旋转涂布机 | Mikasa Co., Ltd.，日本 | MS-A100 | |
| 旋转共聚焦显微镜 | Oxford Instruments | Andor Dragonfly 旋转盘系统 | |
| StemSure LIF，小鼠，重组，溶液（10^6U） | 富士胶片和光 | 195-16053 | |
| SU-8 3010 | Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国 | SU-8 3010 | |
| SU-8 显影液 | Kayaku Advanced Materials, Inc.，马萨诸塞州，美国 | SU-8 显影液 | |
| Tris-EDTA | Nippon Gene | 314-90021 | |
| 血管内皮生长因子-A165（VEGF），人，重组 | 富士胶片和光 | 226-01781 |
参考文献
- Mensah, G. A., Roth, G. A., Fuster, V. The Global Burden of Cardiovascular Diseases and Risk Factors. Journal of the American College of Cardiology. 74 (20), 2529-2532 (2019).
- Wexler, R. K., Elton, T., Pleister, A., Feldman, D. Cardiomyopathy: an overview. American Family ....
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重印与许可
