本文介绍了一种表达和纯化肌球蛋白5a的实验流程，并讨论了如何利用群体和单分子水平的体外荧光显微镜检测方法对其进行表征，以及如何修改这些方法以适用于非肌肉肌球蛋白2b的表征。
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本文内容
摘要
摘要
肌球蛋白能够结合并相互作用于丝状肌动蛋白（F-actin），在系统发育树中的多种生物体内均存在。其结构和酶学特性经过适应性演化，以执行细胞内的特定功能。肌球蛋白5a可在F-actin上进行持续性行走，从而在细胞内运输黑色素体和囊泡。相反，非肌肉肌球蛋白2b以包含约30个分子的双极性细丝形式发挥作用。它将具有相反极性的F-actin向细丝中心移动，在该位置，肌球蛋白分子以非同步方式结合肌动蛋白，产生动力冲程，随后解离并重复循环过程。非肌肉肌球蛋白2b及其其他非肌肉肌球蛋白2亚型在细胞黏附、胞质分裂以及张力维持等过程中发挥重要作用。 肌球蛋白的机械化学特性可通过使用纯化蛋白进行体外运动分析来研究。在滑动肌动蛋白细丝实验中，肌球蛋白被固定在显微镜盖玻片表面，从而驱动荧光标记的F-actin发生移位，其运动轨迹可被追踪。而在单分子/集合运动实验中，F-actin被固定在盖玻片上，观察荧光标记的肌球蛋白分子在F-actin上的运动行为。本文概述了利用亲和层析技术从Sf9 细胞中纯化重组肌球蛋白5a的方法。随后，我们介绍了两种基于荧光显微镜的检测方法：滑动肌动蛋白细丝实验和倒置运动实验。通过这些实验，可利用图像分析软件提取诸如肌动蛋白移位速度、单分子运行长度及运动速度等参数。这些技术也可用于研究非肌肉肌球蛋白2亚型单根细丝的运动特性，本文以非肌肉肌球蛋白2b为例进行讨论。该工作流程提供了一套可用于研究非肌肉肌球蛋白单分子及集合动力学的实验方案和定量分析工具。
引言
肌球蛋白是一类利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量在肌动蛋白丝上施加作用力的马达蛋白1。肌球蛋白包含头部、颈部和尾部结构域。头部结构域含有肌动蛋白结合区以及ATP结合与水解位点。颈部结构域由IQ基序组成，可结合轻链、钙调蛋白或钙调蛋白样蛋白2,3。尾部区域具有多种功能，因肌球蛋白类别而异，包括但不限于两条重链的二聚化、货物分子的结合，以及通过与头部结构域的自抑制相互作用来调控肌球蛋白活性1。
肌球蛋白的运动特性在不同类别之间差异显著。这些特性包括占空比（肌球蛋白机械循环中与肌动蛋白结合的时间比例）和过程性（马达在脱离前沿其轨道连续行进多步的能力）4。目前已根据序列分析确定了超过40类肌球蛋白5,6,7,8。由于第2类肌球蛋白是最早被研究的一类，因此被归类为“常规”肌球蛋白；其余所有类别的肌球蛋白则相应地被归类为“非常规”肌球蛋白。
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方案
1. 蛋白质纯化
- 细胞裂解与蛋白提取
- 根据表1配制1.5倍浓度的提取缓冲液。过滤后于4 °C保存。
- 将细胞沉淀置于冰上开始解冻。在沉淀解冻的同时，向100 mL提取缓冲液中加入1.2 mM二硫苏糖醇（DTT）、5 µg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、0.5 µM苯甲基磺酰氟（PMSF）以及两片蛋白酶抑制剂片剂。保持在冰上。
- 待沉淀完全解冻后，每10 mL细胞培养物加入1 mL补充后的提取缓冲液。例如，若细胞沉淀来自500 mL细胞培养物，则向沉淀中加入50 mL补充后的提取缓冲液。
- 在保持冰浴条件下对细胞沉淀进行超声处理。每次处理条件如下：开启5秒，关闭5秒，持续5分钟，功率为4-5。
- 将所有匀浆后的裂解液收集至烧杯中，并加入ATP（0.1 M储存液；pH 7.0），使ATP终浓度为1 mM。在冷室中搅拌15分钟。ATP可使活性肌球蛋白从肌动蛋白上解离，从而在后续离心步骤中实现分离。因此，必须立即进行下一步操作，以尽量减少ATP耗尽及肌球蛋白重新结合肌动蛋白的可能性。
- 在4 °C条件下以48,000 x g 离心裂解液1小时。在此期间，开始洗涤1-5 mL的50% Anti-FLAG亲和树脂悬液（适用于由1 L细胞制备的沉淀），使用100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），具体操作按照制造商说明书进行。例如，....
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结果
可通过还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来评估肌球蛋白的纯化效果，如图2所示。尽管该图展示的是透析后的最终纯化肌球蛋白，但也可对纯化过程中各个阶段的等分试样进行SDS-PAGE分析，以确定是否有产物残留在上清液中。肌球蛋白5a的重链片段（HMM）在120–130 kDa范围内出现条带，而全长非肌肉肌球蛋白2b则在200–230 kDa范围内出现对应于重链的条带29,44。肌球蛋白5a还在约17 kDa处有一条带，代表钙调蛋白（calmodulin）。非肌肉肌球蛋白2b在约17 kDa处有一条带，代表轻链（ELC）。由于该NM2b样品中含有GFP标记的调节轻链（RLC），因此RLC条带出现在约47 kDa处；然而，若未标记GFP，则未标记的RLC条带将出现在约20 kDa处。
在视频1和图3.......
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讨论
本文展示了一种对肌球蛋白5a和非肌型肌球蛋白2b进行纯化及体外表征的工作流程。该实验体系可用于快速、可重复地定量分析纯化的肌球蛋白构建体的机械化学特性。尽管此处展示的两种肌球蛋白仅为众多可能中的具体示例，但经过适当调整后，这些条件和方法可广泛适用于大多数肌球蛋白及其他多种分子马达蛋白。
此处讨论的实验方案可根据实验室和实验的具体需求进行调整。例如，如表达与分子生物学部分所述，本文所用蛋白是通过两种或多种病毒共感染产生的；然而，使用多表达载体（如 p-FastBac 双表达载体或 BiGBac 表达系统）同样可实现成功的蛋白表达53。
多个因素可能影响重组蛋白的顺利制备。为防止蛋白质降解，必须确保蛋白质纯化的每一步均在适当的温度下进行，所有离心步骤均在 4 °C 下完成，其余操作均在冰上进行。透析后的蛋白质样品在凝胶电泳中可能出现额外条带，这可能提示存在降解或污染。通过尺寸排阻层析或离子交换层析进行后续纯化，可提高样品纯度54。为此，.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
感谢张芳博士在准备本研究所需试剂过程中提供的技术支持。本工作由美国国家心肺血液研究所/国立卫生研究院院内研究计划基金 HL001786 资助 J.R.S.。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1 mL 注射器 | BD | 309628 | |
| 2 M CaCl2 溶液 | VWR | 10128-558 | |
| 2 M MgCl2 溶液 | VWR | 10128-298 | |
| 27号针头 | Becton Dickinson | 309623 | |
| 5 M NaCl 溶液 | KD Medical | RGE-3270 | |
| 乙酸 | ThermoFisher Scientific | 984303 | |
| 乙酸戊酯 | Ladd Research Industries | 10825 | |
| Anti-FLAG M2 亲和凝胶 | Millipore Sigma | A2220 | https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf |
| ATP | Millipore Sigma | A7699 | |
| 生物素标记的G-肌动蛋白 | 细胞骨架公司 | AB07 | |
| 牛血清白蛋白 | Millipore Sigma | 5470 | |
| bPEG-硅烷 | Laysan Bio, Inc | Biotin-PEG-SIL-3400-1g | |
| Bradford 试剂浓缩液 | 伯乐（Bio-Rad） | 5000006 | |
| 钙调蛋白 | PMID: 2985564 | ||
| 过氧化氢酶 | Millipore Sigma | C40 | |
| 细胞系（Sf9）在 SF-900 II SFM 中 | ThermoFisher Scientific | 11496015 | http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf |
| 圆形滤纸 - 滑动实验 | Millipore Sigma | WHA1001125 | |
| 圆形滤纸 - 倒置实验 | Millipore Sigma | WHA1001090 | |
| cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂 | Millipore Sigma | 5056489001 | 这应于4℃保存 °C. 平板可直接使用，或通过将1片溶于2 mL蒸馏水中配制成25倍浓缩液。所得溶液可在4℃保存 °C下保存1-2周，或在-20℃下至少保存12周 °C. |
| 浓缩管（100,000 截留分子量） | EMD Millipore Corporation | UFC910024 | 截留分子量（MWCO）并非必须 "一刀切" 只要截留分子量（MWCO）小于待纯化蛋白的总分子量即可。本文中的非肌球蛋白2b（NM2b）使用截留分子量为100,000的浓缩管进行浓缩，而肌球蛋白5a（M5a）则使用截留分子量为30,000的浓缩管进行浓缩。 |
| 考马斯亮蓝 R-250 染料 | ThermoFisher Scientific | 20278 | |
| 盖玻片架 | Millipore Sigma | Z688568-1EA | |
| 盖玻片：肌动蛋白滑动丝测定 | VWR International | 48366-227 | |
| 盖玻片：倒置运动性测定法 | Azer Scientific | ES0107052 | |
| 透析袋（3500 道尔顿截留分子量） | Fischer Scientific | 08-670-5A | 透析管的直径可以不同，但截留分子量（MWCO）应保持一致。本研究中使用的非肌球蛋白2b（NM2b）在18 mm透析管中进行透析。透析管可保存于4 ℃的20%乙醇溶液中。 °C. |
| DL-二硫苏糖醇 | Millipore Sigma | D0632 | |
| 双面胶带 | Office Depot | 909955 | |
| DYKDDDDK 肽 | GenScript | RP10586 | 这可以溶解在含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN 的缓冲液中3，以及10 mM MOPS（pH 7.2），最终浓度为50 mg/mL。可于-20℃保存 °300 毫摩尔 µL 等分试样。 |
| EGTA | Millipore Sigma | E4378 | |
| 洗脱柱 | 伯乐（Bio-Rad） | 761-1550 | 这些可重复使用。清洗时，先用 2–3 柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗层析柱，然后在 4 °C 下冷藏保存。° 使用前置于冰上。 |
| 乙醇 | Fischer Scientific | A4094 | |
| G-肌动蛋白 | PMID: 4254541 | G-actin 储存液可保存在 200 μM 在液氮中2. | |
| 葡萄糖 | Millipore Sigma | G8270 | |
| 葡萄糖氧化酶 | Millipore Sigma | G2133 | |
| 100 mM 甘氨酸缓冲液，pH 2–2.5，1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-295018 | |
| HaloTag | 普洛麦格 | G100A | |
| HCl | Millipore Sigma | 320331 | |
| KCl | Fischer Scientific | P217-500 | |
| 大孔径移液器吸头 | Fischer Scientific | 02-707-134 | |
| 亮肽素蛋白酶抑制剂 | ThermoFisher Scientific | 78435 | |
| Mark12 未染色标准蛋白分子量标记 | ThermoFisher Scientific | LC5677 | |
| 甲醇 | Millipore Sigma | MX0482 | |
| 甲基纤维素 | Millipore Sigma | M0512 | |
| 显微镜载玻片 | Fischer Scientific | 12-553-10 | |
| MOPS | Fischer Scientific | BP308-100 | |
| mPEG-硅烷 | Laysan Bio, Inc | MPEG-SIL-2000-1g | |
| 肌球蛋白轻链激酶 | PMID: 23148220 | FLAG标签的MLCK可采用与本文所述FLAG标签肌球蛋白相同的方法进行纯化。 | |
| NaN3 | Millipore Sigma | S8032 | |
| NeutrAvidin | 赛默飞世尔科技 | 31050 | |
| 硝酸纤维素 | Ladd Research Industries | 10800 | |
| NuPAGE 4% 至 12% Bis-Tris 小型蛋白凝胶，15 孔 | ThermoFisher Scientific | NP0323PK2 | |
| NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X) | ThermoFisher Scientific | NP0007 | |
| 磷酸盐缓冲液，pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| PMSF | Millipore Sigma | 78830 | PMSF 可用异丙醇配制成 0.1 M 的储存液，并于 4 ℃ 保存 °C. 加入异丙醇会导致晶体析出，但可通过室温搅拌使其溶解。使用前应立即将PMSF逐滴加入快速搅拌的溶液中，终浓度为0.1 mM。 |
| 刀片 | Office Depot | 397492 | |
| 罗丹明-鬼笔环肽 | ThermoFisher Scientific | R415 | 可将储备液用100%甲醇稀释至终浓度为200 μM. |
| Sf9培养基 | ThermoFisher Scientific | 12658-027 | 这应于4℃保存° C. 其保质期为自生产日期起18个月。 |
| 组织培养皿 - 滑动实验 | 康宁 | 353025 | 每个组织培养皿可容纳约九个盖玻片。 |
| 组织培养皿 - 倒置实验 | 康宁 | 353003 | 每个组织培养皿可容纳约四个盖玻片。 |
| 平滑侧 200 µL 吸头 | 托马斯科学公司 | 1158U38 | |
| 设备 | |||
| 离心 | ThermoFisher Scientific | 75006590 | |
| 显微镜 | 尼康 | 型号：Eclipse Ti，配备 H-TIRF 系统和 100 倍 TIRF 物镜（数值孔径 1.49） | |
| 显微镜相机 | Andor | 型号：iXon DU888 EMCCD 相机（1024 × 1024 传感器格式） | |
| 显微镜环境控制箱 | Tokai HIT | 定制温控盒 | |
| 显微镜激光装置 | 尼康 | LU-n4 四激光单元，配备用于 405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm 的固态激光器 | |
| 中型台式离心机 | ThermoFisher Scientific | 型号：CR3i | |
| Misonix 超声波破碎仪 | Misonix | XL2020 | |
| Optima Max-Xp 台式超速离心机 | Beckman Coulter | 393315 | |
| 等离子清洗机 | Diener electronic GmbH + Co. KG | 系统类型：Zepto | |
| 超声波破碎仪探头（3.2 mm） | Qsonica | 4418 | |
| 标准培养箱 | 结合蛋白 | 模型：56 | |
| Waverly 试管混合器 | Waverly | TR6E | |
| 软件 | |||
| ImageJ FIJI | https://imagej.net/Fiji/Downloads | ||
| FAST（版本 1.01） | http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurements | FAST 可用于基于 Mac OSX 和 Linux 的系统。 | |
| 图像稳定插件 | https://imagej.net/Image_Stabilizer | ||
| ImageJ TrackMate | https://imagej.net/TrackMate | ||
| 成像软件 | NIS Elements（AR 软件包） | ||
| http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html | |||
| 文件：TrackMate-手册.pdf | |||
| https://github.com/turalaksel/FASTrack | |||
| https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md |
参考文献
- Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
- Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
- Rhoads, A. R., Friedberg, ....
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重印与许可
