需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化

5.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62180

⸱

2021年2月4日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

本文内容

摘要

本文介绍了一种表达和纯化肌球蛋白5a的实验流程，并讨论了如何利用群体和单分子水平的体外荧光显微镜检测方法对其进行表征，以及如何修改这些方法以适用于非肌肉肌球蛋白2b的表征。

摘要

肌球蛋白能够结合并相互作用于丝状肌动蛋白（F-actin），在系统发育树中的多种生物体内均存在。其结构和酶学特性经过适应性演化，以执行细胞内的特定功能。肌球蛋白5a可在F-actin上进行持续性行走，从而在细胞内运输黑色素体和囊泡。相反，非肌肉肌球蛋白2b以包含约30个分子的双极性细丝形式发挥作用。它将具有相反极性的F-actin向细丝中心移动，在该位置，肌球蛋白分子以非同步方式结合肌动蛋白，产生动力冲程，随后解离并重复循环过程。非肌肉肌球蛋白2b及其其他非肌肉肌球蛋白2亚型在细胞黏附、胞质分裂以及张力维持等过程中发挥重要作用。 肌球蛋白的机械化学特性可通过使用纯化蛋白进行体外运动分析来研究。在滑动肌动蛋白细丝实验中，肌球蛋白被固定在显微镜盖玻片表面，从而驱动荧光标记的F-actin发生移位，其运动轨迹可被追踪。而在单分子/集合运动实验中，F-actin被固定在盖玻片上，观察荧光标记的肌球蛋白分子在F-actin上的运动行为。本文概述了利用亲和层析技术从Sf9 细胞中纯化重组肌球蛋白5a的方法。随后，我们介绍了两种基于荧光显微镜的检测方法：滑动肌动蛋白细丝实验和倒置运动实验。通过这些实验，可利用图像分析软件提取诸如肌动蛋白移位速度、单分子运行长度及运动速度等参数。这些技术也可用于研究非肌肉肌球蛋白2亚型单根细丝的运动特性，本文以非肌肉肌球蛋白2b为例进行讨论。该工作流程提供了一套可用于研究非肌肉肌球蛋白单分子及集合动力学的实验方案和定量分析工具。

引言

肌球蛋白是一类利用三磷酸腺苷（ATP）水解产生的能量在肌动蛋白丝上施加作用力的马达蛋白1。肌球蛋白包含头部、颈部和尾部结构域。头部结构域含有肌动蛋白结合区以及ATP结合与水解位点。颈部结构域由IQ基序组成，可结合轻链、钙调蛋白或钙调蛋白样蛋白2,3。尾部区域具有多种功能，因肌球蛋白类别而异，包括但不限于两条重链的二聚化、货物分子的结合，以及通过与头部结构域的自抑制相互作用来调控肌球蛋白活性1。

肌球蛋白的运动特性在不同类别之间差异显著。这些特性包括占空比（肌球蛋白机械循环中与肌动蛋白结合的时间比例）和过程性（马达在脱离前沿其轨道连续行进多步的能力）4。目前已根据序列分析确定了超过40类肌球蛋白5,6,7,8。由于第2类肌球蛋白是最早被研究的一类，因此被归类为“常规”肌球蛋白；其余所有类别的肌球蛋白则相应地被归类为“非常规”肌球蛋白。

肌球蛋白5a（M5a）属于肌球蛋白5类，是一种具有持续运动能力的马达蛋白，意味着它可在解离前沿肌动蛋白行进多个步长。其占空比较高，表明在其机械循环过程中大部分时间均与肌动蛋白结合9,10,11,12,13,14。与其他肌球蛋白类似，其重链包含一个位于N端的马达结构域，该结构域具有肌动蛋白结合位点和ATP水解位点，其后为作为杠杆臂的颈部区域，含有六个IQ模体，可结合轻链（ELC）和钙调蛋白（CaM）15。尾部区域包含α-螺旋卷曲螺旋结构，使分子形成二聚体，随后为球状尾部结构域，用于结合货物。其动力学特性反映了其在黑素细胞中黑素体运输以及浦肯野神经元中内质网运输中的作用16,17。M5a被认为是典型的货物运输马达蛋白18。

2型肌球蛋白，即传统肌球蛋白，包括驱动骨骼肌、心肌和平滑肌收缩的肌球蛋白，以及非肌型肌球蛋白2（NM2）的同工型NM2a、2b和2c19非肌球蛋白2（NM2）同工型存在于所有细胞的细胞质中，在胞质分裂、细胞黏附、组织形态发生和细胞迁移中具有共同作用。19,20,21,22本文在非肌型肌球蛋白2b（NM2b）的背景下讨论传统的肌球蛋白实验方法。23与M5a相比，NM2b的占空比较低，且酶促反应速度较慢，其V最大 0.2 秒-1 23 与 M5a 的 V 相比最大 的 ≈18 秒-1 24值得注意的是，含有两个头部的截短型NM2b构建体在肌动蛋白上不能进行持续的运动；相反，每次与肌动蛋白结合后均产生一次动力冲程，随后分子即从肌动蛋白上解离25.

NM2b 包含两条肌球蛋白重链，每条重链具有一个球状头部结构域、一个杠杆臂（含一条 ELC 和一条调节轻链（RLC））以及一个长约 1,100 个氨基酸的 α-螺旋卷曲螺旋杆状/尾部结构域，该结构域使这两条重链形成二聚体。NM2b 的酶活性和结构状态受 RLC 磷酸化的调控23。在 ATP 存在及生理离子强度（约 150 mM 盐）条件下，未磷酸化的 NM2b 会形成一种紧凑构象，其中两个头部参与不对称相互作用，且尾部在两个位置回折覆盖在头部上方23。在此状态下，肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用较弱，且酶活性极低。当 RLC 被钙调蛋白依赖性肌球蛋白轻链激酶（MLCK）或 Rho 相关蛋白激酶磷酸化后，分子伸展，并通过尾部区域与其他肌球蛋白结合，形成包含约 30 个肌球蛋白分子的双极性丝状结构23。上述 RLC 的磷酸化还会使 NM2b 的肌动蛋白激活 ATP 酶活性提高约四倍26,27,28。这种双极性丝状排列在每一端均含有多个肌球蛋白马达，适用于收缩和张力维持功能，可相对移动具有相反极性的肌动蛋白丝23,29。因此，NM2b 在与肌动蛋白相互作用时表现为一组协同工作的马达。丝状结构内大量马达的存在使得 NM2b 丝能够在肌动蛋白丝上进行持续性运动，从而可以在体外 对丝状体的持续性进行表征29。

尽管在理解肌球蛋白在细胞中的作用方面已取得进展，但仍需在蛋白质水平上深入了解其各自特性。为了在简单的蛋白质-蛋白质相互作用层面（而非细胞内环境）研究肌动蛋白-肌球蛋白的相互作用，我们可以表达并纯化重组肌球蛋白，用于体外研究。此类研究的结果可为力学生物学家提供特定肌球蛋白的生物物理特性信息，而这些特性最终驱动着复杂的细胞过程12,13,14,25,29。通常，这一目标可通过在全长或截短的肌球蛋白构建体上添加亲和标签，并利用亲和层析进行纯化来实现29,30,31。此外，还可对构建体进行改造，使其包含可遗传编码的荧光蛋白，或添加可用于与合成荧光染料标记的标签。通过引入此类荧光标记，可开展单分子成像研究，以观察肌球蛋白的力学行为与动力学特征。

纯化后，可通过多种方法对肌球蛋白进行表征。可通过比色法测定其ATP酶活性，从而了解该马达蛋白在不同条件下的整体能量消耗及其对肌动蛋白的亲和力32。为了进一步研究其运动过程中的机械化学特性，还需开展更深入的实验。本文详细描述了两种基于体外荧光显微镜的技术，可用于表征纯化肌球蛋白的运动特性。

第一种方法是滑动肌动蛋白丝（gliding actin filament）检测法，可用于定量研究肌球蛋白马达的群体特性，也可用于定性评估一批纯化蛋白的质量33。尽管本文讨论了使用全内反射荧光（TIRF）显微镜进行该检测，但这些实验也可使用配备数码相机的宽场荧光显微镜有效完成，这类设备在许多实验室中都很常见34。在该检测中，将饱和量的肌球蛋白马达固定在盖玻片表面。这可通过硝酸纤维素、抗体、膜、SiO2修饰的表面（如三甲基氯硅烷）等方法实现29,33,35,36,37,38。将荧光标记的肌动蛋白丝通过盖玻片腔室，使其结合到固定在表面的肌球蛋白上。加入ATP（在研究非肌球蛋白2（NM2）时还需加入激酶）后，对腔室进行成像，以观察表面固定的肌球蛋白驱动肌动蛋白丝的转运过程。可使用追踪软件分析每根滑动肌动蛋白丝的速度和长度。分析软件还可提供移动和静止肌动蛋白丝数量的测量值，这有助于评估特定肌球蛋白制备样品的质量。通过将肌动蛋白表面锚定至其他蛋白，还可有意调节停滞丝的比例，并测量以确定肌球蛋白的负荷依赖性39。由于每根肌动蛋白丝可由大量可用的马达驱动，该检测具有高度可重复性，最终测得的速度对起始肌球蛋白浓度变化或溶液中存在其他因素等扰动具有较强的鲁棒性。这意味着该方法可轻松修改，用于研究不同条件下肌球蛋白的活性，例如磷酸化状态、温度、离子强度、溶液黏度的变化，以及表面锚定所诱导负荷的影响。尽管诸如不能水解ATP的强结合肌球蛋白“失活头”（"dead heads"）等因素可能导致肌动蛋白丝停滞，但已有多种方法可缓解此类问题，从而实现准确测量。肌球蛋白的动力学特性在不同类别间差异显著，根据所用肌球蛋白的具体类型，本检测中肌动蛋白丝滑动速度可从低于20 nm/s（肌球蛋白9）40,41到高达60,000 nm/s（Characean 肌球蛋白11）42不等。

第二种实验方法反转了肌动蛋白丝滑动实验的几何构型12。在此方法中，肌动蛋白丝被固定在盖玻片表面，从而可以观察M5a单分子或NM2b单个双极性丝的运动。该实验可用于定量分析单个肌球蛋白分子或肌丝在肌动蛋白上的运行长度和运动速度。首先，使用一种既能阻断非特异性结合又能同时实现表面功能化的化学化合物（如生物素-聚乙二醇，biotin-PEG）对盖玻片进行包被。随后加入修饰后的亲和素衍生物以活化表面，并使生物素化的肌动蛋白通过反应腔室，从而在腔室底部形成一层稳定结合的F-actin。最后，将活化并带有荧光标记的肌球蛋白（通常为1–100 nM）引入腔室，通过成像观察肌球蛋白在静止的肌动蛋白丝上的运动情况。

这些方法代表了快速且可重复的技术，可用于研究非肌性肌球蛋白和肌性肌球蛋白的动力学行为。本报告概述了分别代表非常规肌球蛋白和常规肌球蛋白的 M5a 和 NM2b 的纯化与表征流程。随后讨论了为成功捕获两种检测体系中运动过程而可实施的若干肌球蛋白特异性优化措施。

表达与分子生物学
目的肌球蛋白的 cDNA 必须克隆至经过修饰的 pFastBac1 载体上，该载体编码 C 末端 FLAG 标签（DYKDDDDK），用于表达 M5a-HMM；或编码 N 末端 FLAG 标签，用于表达 NM2b 的全长分子23,43,44,45,46。NM2b 的 C 末端 FLAG 标签会导致蛋白在 FLAG 亲和柱上的结合能力减弱。相比之下，N 末端带 FLAG 标签的蛋白通常能较好地结合 FLAG 亲和柱23。N 末端标记的蛋白可保留其酶活性、机械活性以及依赖磷酸化的调控功能23。

本研究中使用了一种截短的小鼠 M5a 重酶解肌球蛋白（HMM）样构建体，其在 FLAG 标签与肌球蛋白重链 C 末端之间插入了 GFP。需要注意的是，与 NM2b 不同，M5a-HMM 可在 N 末端或 C 末端成功添加 FLAG 标签，并且两种构建体均具有活性。M5a 重链在第 1090 位氨基酸处被截断，GFP 与 M5a 的卷曲螺旋区域之间包含一个由三个氨基酸（GCG）组成的连接肽47。GFP 与 FLAG 标签之间未添加额外的连接肽。M5a-HMM 与钙调蛋白共同表达。全长的人源 NM2b 构建体则与 ELC 和 RLC 共同表达。RLC 的 N 末端通过一个由五个氨基酸（SGLRS）组成的连接肽与 GFP 融合。HaloTag 直接连接在 FLAG 标签上，HaloTag 与肌球蛋白重链 N 末端之间由两个氨基酸（AS）组成的连接肽相连。

两种肌球蛋白样品均从一升感染杆状病毒的Sf9细胞培养物中纯化获得，细胞密度约为 2 × 106 个细胞/mL。每种亚基所用杆状病毒的体积取决于制造商说明书中确定的病毒感染复数。对于 M5a，细胞同时感染两种不同的杆状病毒——一种表达钙调蛋白，另一种表达 M5a 重链。对于 NM2b，则同时感染三种不同的病毒——分别表达轻链 ELC、轻链 RLC 和 NM2b 重链。对于研究多种肌球蛋白（或其他多亚基复合蛋白）的实验室，该方法效率较高，因为它允许多种重链与轻链的组合，且常用轻链（如钙调蛋白）可与多种不同的肌球蛋白重链共转染。所有细胞操作均在生物安全柜中进行，并采用适当的无菌技术，以避免污染。

为了表达M5a和NM2b，通过离心收集感染后2-3天的Sf9细胞以获取重组肌球蛋白，并在-80 °C下保存。通过在4 °C下以2,800 × g离心共感染的Sf9细胞30分钟获得细胞沉淀。蛋白质纯化过程如下所述。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 蛋白质纯化

  1. 细胞裂解与蛋白提取
    1. 根据表1配制1.5倍浓度的提取缓冲液。过滤后于4 °C保存。
    2. 将细胞沉淀置于冰上开始解冻。在沉淀解冻的同时，向100 mL提取缓冲液中加入1.2 mM二硫苏糖醇（DTT）、5 µg/mL亮抑蛋白酶肽（leupeptin）、0.5 µM苯甲基磺酰氟（PMSF）以及两片蛋白酶抑制剂片剂。保持在冰上。
    3. 待沉淀完全解冻后，每10 mL细胞培养物加入1 mL补充后的提取缓冲液。例如，若细胞沉淀来自500 mL细胞培养物，则向沉淀中加入50 mL补充后的提取缓冲液。
    4. 在保持冰浴条件下对细胞沉淀进行超声处理。每次处理条件如下：开启5秒，关闭5秒，持续5分钟，功率为4-5。
    5. 将所有匀浆后的裂解液收集至烧杯中，并加入ATP（0.1 M储存液；pH 7.0），使ATP终浓度为1 mM。在冷室中搅拌15分钟。ATP可使活性肌球蛋白从肌动蛋白上解离，从而在后续离心步骤中实现分离。因此，必须立即进行下一步操作，以尽量减少ATP耗尽及肌球蛋白重新结合肌动蛋白的可能性。
    6. 在4 °C条件下以48,000 x g 离心裂解液1小时。在此期间，开始洗涤1-5 mL的50% Anti-FLAG亲和树脂悬液（适用于由1 L细胞制备的沉淀），使用100 mL磷酸盐缓冲盐水（PBS），具体操作按照制造商说明书进行。例如，对于5 mL树脂，应洗涤10 mL的50%悬液。在最后一次洗涤步骤中，用适量PBS重悬树脂，使其形成50%悬液。
    7. 裂解液离心完成后，将上清液与洗涤后的树脂悬液混合，在冷室中轻轻摇动孵育1-4小时。在此期间，配制表1中所述的缓冲液并保持在冰上。
  2. FLAG亲和纯化准备
    1. 将步骤1.7中的溶液在4 °C条件下以500 x g离心5分钟。树脂将沉降至管底。在不扰动树脂的前提下，移除上清液。
    2. 用表1中所述的Buffer A重悬树脂至50 mL，在4 °C条件下以500 x g离心5分钟。在不扰动树脂的前提下，移除上清液。
    3. 用表1中所述的Buffer B重悬树脂至50 mL，在4 °C条件下以500 x g离心5分钟。重复此步骤一次，然后用20 mL Buffer B重悬树脂。随后，通过手动轻轻倒置试管约10次，充分混匀树脂与缓冲液。
  3. 蛋白洗脱与浓缩
    1. 按照表1配制30 mL洗脱缓冲液，并置于冰上预冷。
    2. 在冷室中安装洗脱柱。将树脂悬液轻轻倒入柱中。当树脂在柱底沉降时，用1-2柱体积的Buffer B洗涤柱子，确保树脂不干燥。
    3. 使1 mL洗脱缓冲液流过树脂，收集流出液至1.5 mL离心管中。重复该过程，共收集12份1 mL的洗脱组分。
    4. 此时，对各组分进行粗略的Bradford检测，以定性判断哪些组分浓度最高48。在96孔板的一行中，每孔加入60 µL 1x Bradford试剂。随着组分的收集，每孔加入20 µL对应组分并混匀。颜色越深的蓝色表示该组分浓度越高。
    5. 在50 mL离心管中，通过轻轻将剩余的洗脱缓冲液吹打过柱，收集柱流穿中可能仍结合在树脂上的残余肌球蛋白。此流出液将在下一步进行浓缩。确保随后按照制造商说明书对树脂进行再生并妥善保存。
    6. 合并浓度最高的三个组分，并将50 mL管中的剩余流出液以及其余1 mL组分使用100,000 MWCO浓缩管进一步浓缩。将合并样品加载至浓缩管中，在4 °C条件下以750 x g离心15分钟，重复操作直至所有洗脱蛋白浓缩至最终体积约0.5-1 mL。
      ​注：该孔径可有效截留分子量远高于截留分子量的肌球蛋白分子。在此浓缩过程中，轻链仍紧密结合于马达结构域，这一点已通过最终产物的SDS-PAGE凝胶电泳验证。
  4. 透析与速冻
    1. 按照表1配制2 L透析缓冲液。将样品装入透析袋或透析装置中，在冷室中透析过夜。注意，NM2b与M5a所用透析缓冲液的组成不同。
      ​注：对于NM2b，此透析步骤的目的是在低离子强度缓冲液中形成肌球蛋白丝状结构。这些丝状结构可通过沉降实现进一步纯化，并有助于样品浓缩。因此，次日可在透析装置中观察到明显的白色沉淀。这些丝状结构将在步骤5.1中通过离心收集并解聚。对于M5a-HMM，在过夜透析后，蛋白纯度已足以用于后续实验。如有需要，可进一步进行凝胶过滤或离子交换层析等纯化步骤。M5a透析后的回收操作请参见步骤5.2。
  5. 透析后肌球蛋白的回收
    1. 对于NM2b，小心地将整个样品从透析袋或装置中取出，在4 °C条件下以49,000 x g离心15分钟，以收集肌球蛋白丝状结构。弃去上清液，并按照表1 所述逐步加入储存缓冲液，直至沉淀完全溶解。轻柔地反复吹打有助于沉淀溶解。通常每管不超过500 µL即可。确认沉淀在高离子强度储存缓冲液中完全溶解后，可根据需要再进行一次离心（15分钟，49,000 x g），以去除不必要聚集体，此时肌球蛋白已去聚合，将保留在上清液中。
    2. 对于M5a-HMM，小心地从透析装置中收集全部样品，若存在不必要聚集体，则在4 °C条件下以49,000 x g离心15分钟，收集上清液。
  6. 浓度测定与速冻
    1. 为测定产物浓度，使用分光光度计在260、280、290和320 nm波长下测量吸光度。使用公式1计算浓度（mg/mL）（cmg/mL），其中A280表示280 nm处的吸光值，A320表示320 nm处的吸光值。所得mg/mL浓度可通过公式2转换为肌球蛋白分子的µM浓度，其中M为完整蛋白的分子量（包括重链、轻链、荧光基团及所有标签）。
      cmg/mL = (A280 - A320) / ε   (1)
      μM 分子数 = 1000cmg/mL/M   (2)
      注：若需稀释，必须使用高离子强度缓冲液。消光系数（ε）可通过将蛋白氨基酸序列导入ExPASy等程序进行计算。本研究中M5a-HMM的典型产量约为0.5-1 mL，浓度为1-5 mg/mL；全长NM2b的典型产量约为0.5-1 mL，浓度为0.5-2 mg/mL。本文所用M5a-HMM的消光系数为0.671，NM2b的消光系数为0.611。
    2. 将纯化的肌球蛋白以以下两种方式之一储存。将10-20 µL样品分装至薄壁管（如聚合酶链式反应管）中，迅速将管子浸入液氮中进行速冻。或者，直接将20-25 µL肌球蛋白滴入液氮中，将形成的蛋白冻珠储存于无菌低温冻存管中。无论采用哪种方式，所得样品管均可在-80 °C或液氮中长期保存以备后续使用。
      ​注：由于下述两种运动性实验均仅需极少量蛋白，因此如上所述分装储存具有经济性。

2. 肌动蛋白丝滑动实验

  1. 盖玻片准备
    1. 用乙酸戊酯配制1%的硝酸纤维素溶液。
    2. 获取一个组织培养皿（150 × 25 mm），并将一张圆形滤纸（直径 125 mm）放入培养皿底部。
    3. 将八片1.5号厚度的22 mm方形盖玻片放入支架中，先用约2–5 mL的200度乙醇清洗，再用2–5 mL去离子水（dH₂O）冲洗2O) 重复此洗涤步骤，最后用水洗涤。然后，使用过滤的压缩空气或氮气将盖玻片完全吹干。2-线。
    4. 取一片盖玻片，缓慢用移液器加入10 µ在盖玻片的一侧边缘加入1%硝酸纤维素溶液L。然后，用一支光滑侧壁的200 μL枪头侧面，连续而平稳地将溶液涂抹至整个盖玻片表面。 µL型移液器吸头。将盖玻片放置于培养皿中，硝酸纤维素面朝上。对剩余的盖玻片重复此操作，并在配制其余试剂时使其自然干燥，涂覆后24小时内使用。
  2. 样品室制备
    1. 用光学镜片纸擦拭显微镜载玻片，以清除较大的碎屑。剪下两段双面胶带，每段长约2 cm。
    2. 将一条胶带沿载玻片长边的中央放置，确保胶带边缘与载玻片边缘对齐。在第一条胶带下方约 2 mm 处平行且对齐放置第二条胶带。这样可形成一个容积约为 10 的流动腔室 µ升溶液（参见 图1).
    3. 取一片第1部分中硝酸纤维素包被的盖玻片，小心地将盖玻片贴附于胶带上，确保硝酸纤维素涂层一侧与胶带直接接触（见 图1使用移液枪头轻轻按压载玻片与胶带的接口处，以确保盖玻片已牢固粘附于载玻片上。用刀片将悬垂在载玻片边缘的多余胶带剪去。
  3. 肌动蛋白制备
    1. 制备20 µM F-actin 通过在聚合缓冲液（50 mM KCl，2 mM MgCl₂）中聚合球状肌动蛋白（G-actin）制备2，1 mM DTT，25 mM MOPS（pH 7.0）），4 ℃ °C 过夜。
    2. 将F-actin稀释至5 µM 在运动缓冲液（20 mM MOPS，5 mM MgCl₂）中2，0.1 mM EGTA，1 mM DTT（pH 7.4）。用至少1.2倍摩尔过量的罗丹明-鬼笔环肽标记，用铝箔包裹，于冰上放置至少2小时。此溶液可置于冰上保存1-2个月，期间使用。
  4. 进行肌球蛋白5a的滑动肌动蛋白丝检测
    ​注意：本节提供了肌球蛋白5a（HMM）滑动实验的详细步骤。
    1. 准备文中所述的 myosin 5a 溶液 表 2 并将其置于冰上保存。
    2. 流经 10 µ通过流动室加入50-100 nM的myosin 5a溶液1 L，孵育1分钟。
    3. 流过 10 µ1 mg/mL BSA 的 50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）中的 L"低盐" 缓冲液）。重复此洗涤步骤两次，第三次洗涤后等待1分钟。用滤纸或纸巾的一角轻轻接触流动室出口，通过毛细作用将溶液从通道中吸出。
    4. 用10洗涤 µ50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）洗涤两次，每次重复洗涤三次。
    5. 流经 10 µL 的黑色肌动蛋白溶液（5 µM F-actin，1 µM 钙调蛋白和 1 mM ATP 的 50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）中，以消除 "无效头部"，如文中所述 讨论 部分。
      1. 使用1 mL注射器和27 G针头吸取溶液，在将溶液引入样品室之前对肌动蛋白丝进行剪切。重复此步骤两次，第三次操作后等待1分钟。大约20次移液操作即可。
      2. 进行以下操作以 "无效头部" 离心后，在1 mM ATP和1 mM MgCl₂存在下，向肌球蛋白中加入化学计量比的F-actin2 在盐浓度为 500 mM 的条件下，然后在 480,000 x g 4℃下孵育15分钟 °C. 失活的肌球蛋白将位于沉淀中。
    6. 流过 50 µ50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT 和 1 mM ATP）的 L 量，用于清除腔室中的游离肌动蛋白丝。
    7. 用10洗涤 µ50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）洗涤三次，以彻底清除腔室中的 ATP。
    8. 流过 10 µ含有1 mM DTT的50 mM MB缓冲液中20 nM罗丹明标记肌动蛋白（Rh-Actin）溶液1 L，孵育1分钟，使肌动蛋白丝与附着在盖玻片表面的肌球蛋白5a发生 Rigor 结合。
    9. 用10洗涤 µ用 50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）洗涤三次，以去除未结合到表面的 Rh-Actin 丝。每次洗涤均重复此步骤，共进行三次。
    10. 流过 30 µL 的终缓冲液。
    11. 使用561 nm激发波长在荧光显微镜下采集图像以观察Rh-Actin。在1.4 mW激光功率下，合适的曝光时间为200 ms，总采集时长为0.5–1 min。
      注意：确保采集速率与运动丝状物的速度相匹配。在使用追踪程序采集数据前，一个重要考虑因素是图像采集的帧率。若帧间发生亚像素移动，会导致速度被高估，而要获得准确的速度值，需要每帧间发生数百纳米的位移。理想的采集速率应使肌动蛋白滑动在相邻帧间的位移至少达到一个像素的距离。以本实验所用的全内反射荧光显微镜（TIRF）为例，该像素距离对应为130 nm；因此，若预期某种肌球蛋白的移动速度为1 µm/s 的运动速度必须以每秒 5 帧（0.2 秒间隔）进行成像，才能实现 200 nm 的位移，而预期移动速度为 10 nm/s 的肌球蛋白则需要每 0.05 帧/秒（20 秒间隔）。因此，如果需要，此时可对数据进行下采样（参见 讨论 如需更多细节）。
  5. 进行非肌球蛋白2b的肌动蛋白丝滑动实验
    ​注意：本节提供了全长非肌球蛋白2b滑动实验的详细步骤。非肌球蛋白2b的肌动蛋白丝滑动实验方案在某些步骤上与肌球蛋白5a的方案不同。请确保在每一步骤中使用正确的缓冲液。例如，NM2b实验需要在高盐缓冲液中将肌球蛋白连接到盖玻片上，而M5a则可在高盐或低盐缓冲液中连接至盖玻片。此外，M5a肌动蛋白丝滑动实验使用较低浓度的肌球蛋白，以减少成像过程中肌动蛋白丝断裂的频率。
    1. 按照所述方法制备NM2b的溶液 表 2 并将其置于冰上。
    2. 10 的流 µ非肌肉肌球蛋白2b的L（0.2 µM) 加入 500 mM 运动缓冲液（MB）中"高盐" 缓冲液）和1 mM 二硫苏糖醇（DTT），流经流动池后静置1分钟。
      注意：高盐缓冲液可解离肌球蛋白丝，从而使单个肌球蛋白分子能够结合至表面，因为非肌球蛋白2b可在离子浓度较低时聚合形成丝状结构 <150 mM
    3. 流过 10 µ1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）的 L 体积溶于含 1 mM DTT 的 500 mM MB 中（"高盐" 缓冲液）如所述 表 2重复此洗涤步骤两次，第三次洗涤后等待1分钟。用滤纸或纸巾的一角从通道中吸去溶液。
    4. 用10洗涤 µ500 mM MB 溶液中加入 1 mM DTT，具体方法如所述 表2重复此洗涤步骤两次。
    5. 10 的流 µL 的黑色肌动蛋白溶液，具体方法如所述 表 2 以消除 "无效头部，" 如后文进一步所述 讨论 部分。黑色肌动蛋白溶液含有 5 µM 未标记的 F-actin，1–10 nM MLCK，1 mM ATP，0.2 mM CaCl₂2, 1 µM CaM 和 1 mM DTT 溶于 50 mM NaCl 运动缓冲液中，以在反应腔表面磷酸化非肌型肌球蛋白 2b。
      1. 使用1 mL注射器和27 G针头吸取溶液，在将溶液引入样品室之前剪切肌动蛋白丝。重复此步骤两次，第三次操作后等待1分钟。大约20次移液操作即可达到充分剪切效果。
    6. 流过 50 µ50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT 和 1 mM ATP）中孵育，以去除腔室中游离的肌动蛋白丝。
    7. 用10洗涤 µ50 mM MB 缓冲液（含 1 mM DTT）洗涤三次，以彻底去除腔室中的 ATP。
    8. 流过 10 µ加入含有1 mM DTT的20 nM Rh-肌动蛋白溶液1 L，置于50 mM MB缓冲液中，静置1分钟，使肌动蛋白丝与附着在盖玻片表面的非肌球蛋白2b发生 Rigor 结合。
    9. 用10洗涤 µ加入1 L含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液，以洗去未结合到表面的Rh-肌动蛋白丝。重复此洗涤步骤两次。
    10. 流过 30 µL 的终缓冲液。对于非肌球蛋白2b的滑动肌动蛋白丝测定，终缓冲液还需包含钙调蛋白和 CaCl₂。2，并加入肌球蛋白轻链激酶，以在视频成像期间实现非肌球蛋白2b的完全磷酸化。如果肌动蛋白丝与表面结合较弱或未充分结合，可在终缓冲液中添加0.7%甲基纤维素。相关内容将在下文中进一步讨论。 讨论 部分。
    11. 使用561 nm激发波长在荧光显微镜下采集图像。激光功率为1.4 mW时，适宜的曝光时间为200 ms，总采集时长为0.5 -3 分钟
      注意：确保采集速率与运动丝状物的速度相匹配。在使用追踪程序采集数据前，需重点考虑图像采集的帧率。若帧间发生亚像素移动，会导致速度被高估，而要获得准确的速度值，需要每帧间移动距离达到数百纳米。理想的采集速率应确保肌动蛋白滑动在相邻帧间的位移至少为一个像素。以本实验所用的全内反射荧光（TIRF）显微镜为例，该阈值对应为130 nm；因此，若预期肌球蛋白的移动速度为1 µm/s 的分子需要以每秒 5 帧（0.2 秒间隔）的速率成像，才能捕捉到其 200 nm 的移动；而预期移动速度为 10 nm/s 的肌球蛋白则需要每 0.05 帧/秒（20 秒间隔）进行成像。因此，如有必要，可在该阶段对数据进行降采样（参见 讨论 如需更多细节。

3. 单分子TIRF检测

  1. 盖玻片制备
    1. 将甲氧基-聚乙二醇-硅烷（mPEG）和生物素-聚乙二醇-硅烷（bPEG）的储备粉末分别分装为每份10 mg（置于1.5 mL离心管中）。密封后于无湿环境中-20 °C保存，并在6个月内使用。
    2. 将八片1.5H号（高精度厚度）22 mm见方的盖玻片放入支架中，先用2–5 mL 200度乙醇清洗，再用2–5 mL去离子水清洗。重复此清洗步骤一次，最后以水结束。然后使用气流或N2彻底吹干盖玻片，并用氩气等离子体清洗3分钟。
    3. 将清洗后的盖玻片置于组织培养皿（100 × 20 mm）内的滤纸（90 mm）上，并在执行以下步骤时将其置于70 °C烘箱中孵育。
      ​注意：等离子清洗可用其他化学清洗方法替代49。
    4. 使用dH2O配制80%乙醇溶液，并用HCl调节pH至2.0。取1 mL该溶液加入10 mg mPEG样品中，另取1 mL加入10 mg bPEG样品中。涡旋振荡以溶解，溶解时间不应超过30秒。
    5. 取100 µL bPEG溶液，加入900 µL 80%乙醇（pH 2.0），得到浓度为1 mg/mL的bPEG溶液。然后按以下方式配制两种PEG的混合溶液，并充分混匀：
      1. 200 µL 10 mg/mL mPEG（终浓度：2 mg/mL）。
      2. 10 µL 1 mg/mL bPEG（终浓度：10 µg/mL）。
      3. 790 µL 80%乙醇（pH 2.0）溶液。
    6. 从烘箱中取出盖玻片。小心地将100 µL PEG溶液滴加至每片盖玻片中心，确保仅上表面湿润。然后将盖玻片放回烘箱，孵育20至30分钟。
    7. 当盖玻片表面开始呈现多孔状，且表面出现明显的小圆圈时，将其从烘箱中取出。
    8. 用100%乙醇清洗每片盖玻片，用气流吹干后放回烘箱。仅需孵育至第2步中形成流通池所需的时间即可。
  2. 流通池制备
    1. 清洁用于制作流通池的显微镜载玻片。裁剪两段双面胶带，每段长约2 cm。
    2. 将其中一段沿载玻片长边中央放置，确保胶带边缘与载玻片边缘对齐。将第二段胶带平行地置于第一段下方约2 mm处，使两者对齐。
    3. 从烘箱中取出一片已功能化的盖玻片（由3.1步骤制得）。小心地将盖玻片粘附于胶带上，使涂有PEG的一侧朝下并与胶带直接接触，如图1所示。使用移液器吸头轻轻按压载玻片与胶带的接触界面，确保盖玻片牢固粘附。
    4. 用剃刀片切除载玻片边缘多余的胶带。这些流通池可立即使用，或成对放入50 mL离心管中，于-80 °C冰箱中保存以备后续使用。重要的是必须立即储存，否则表面会降解。
  3. 进行肌球蛋白5a的全内反射荧光显微镜（TIRF）实验
    1. 配制表3中所述的肌球蛋白5a倒置运动性实验所需溶液，并置于冰上保存。
    2. 用10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液清洗流通池。
    3. 加入10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液中的1 mg/mL BSA溶液。重复该清洗步骤两次，第三次清洗后等待1分钟。使用纸巾或滤纸的角落通过毛细作用将溶液引过通道。
    4. 用10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    5. 加入10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液中的NeutrAvidin溶液，并等待1分钟。
    6. 用10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    7. 加入10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液中的生物素化罗丹明标记肌动蛋白（bRh-Actin）溶液，并等待1分钟。此步骤应使用大孔径移液器吸头，避免反复吹打，以尽量减少荧光肌动蛋白丝的剪切，确保长肌动蛋白丝（20–30 µm或更长）能够附着于表面。一种有效替代方法是剪去标准移液器吸头的锥形部分（开口约≈1–1.5 mm）。
    8. 用10 µL含1 mM DTT的50 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    9. 加入30 µL终末缓冲液（Final Buffer），其中添加10 nM肌球蛋白5a，然后立即装载至TIRF显微镜上，在找到TIRF成像模式的最佳焦平面后开始记录。在1.4 mW激光功率下，针对肌动蛋白和GFP标记的肌球蛋白，曝光时间设置为100–200 ms较为合适。用于速度分析的合适采集时间为3分钟。
  4. 进行非肌球蛋白2b的全内反射荧光显微镜（TIRF）实验
    ​注意：本节提供使用聚合并磷酸化的非肌球蛋白2b进行TIRF实验的详细说明。其中包括在离心管中磷酸化和聚合非肌球蛋白2b的详细实验方案（4.1–4.3节）。
    1. 为磷酸化纯化的NM2b，配制10倍激酶混合液，条件如下：2 mM CaCl2、1 µM CaM、1–10 nM MLCK和0.1 mM ATP。可用含10 mM DTT的500 mM MB缓冲液定容。按体积比1:10将10倍激酶混合液加入肌球蛋白中，并在室温下孵育20–30分钟。通常此步骤中肌球蛋白浓度为1 µM。
    2. 为将磷酸化的肌球蛋白聚合为丝状结构，需将NM2b的盐浓度降低至150 mM NaCl。为此，通过将4倍MB缓冲液用dH2O稀释四倍，配制不含盐的1倍运动缓冲液（1x MB）。由于NM2b在500 mM盐缓冲液中冷冻保存，因此可用此1x MB缓冲液降低盐浓度。
    3. 每3 µL NM2b储备液中加入7 µL 1x MB缓冲液，将盐浓度降至150 mM NaCl，并在冰上孵育20–30分钟以形成NM2b丝状结构。
      ​注意：只要确保NM2b完成磷酸化且最终盐浓度为150 mM，4.1–4.3节的操作顺序并不关键。约30分钟至1小时的孵育时间足以完成充分的磷酸化和聚合。
    4. 配制表3中所述的非肌球蛋白2b倒置运动性实验所需溶液，并置于冰上保存。
    5. 用10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液清洗流通池。
    6. 加入10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液中的1 mg/mL BSA溶液。重复该清洗步骤两次，第三次清洗后等待1分钟。使用纸巾或滤纸的角落通过毛细作用将溶液引过通道。
    7. 用10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    8. 加入10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液中的NeutrAvidin溶液，并等待1分钟。
    9. 用10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    10. 加入10 µL bRh-Actin溶液，并等待1分钟。此步骤应使用大孔径移液器吸头，避免反复吹打，以尽量减少荧光肌动蛋白丝的剪切，确保长肌动蛋白丝（20–30 µm或更长）能够附着于表面。一种有效替代方法是剪去标准移液器吸头的锥形部分。
    11. 用10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    12. 加入10 µL非肌球蛋白2b溶液（约30 nM），并等待1分钟。
    13. 用10 µL含1 mM DTT的150 mM MB缓冲液清洗。重复该清洗步骤两次。
    14. 加入30 µL终末缓冲液，然后立即装载至TIRF显微镜上，在找到TIRF成像模式的最佳焦平面后开始记录。在1.4 mW激光功率下，针对肌动蛋白和GFP标记的肌球蛋白，曝光时间设置为100–200 ms较为合适。用于速度分析的合适采集时间为3分钟。

4. 图像分析

  1. 滑动肌动蛋白丝实验的图像分析
    注意：可以使用材料列表中提供的链接软件及其手册进行图像分析。需要注意的是，此处描述的程序要求使用TIFF图像序列（stack）进行分析。滑动肌动蛋白丝实验的分析流程如下50。
    1. 将原始视频序列上传至指定的文件夹结构中，并将视频文件夹的最顶层目录输入程序。
      ​注意：该程序会分析此目录及其子目录中的所有文件，并将最低层级的目录视为重复样本。每组重复样本将生成平均统计值。在本例中，每种肌球蛋白仅使用了一个视频。在表征新型肌球蛋白或研究新的实验条件时，建议每个反应腔室分析三个视野（FOV）的视频，共三个腔室，并对所研究的肌球蛋白重复三次制备过程，以重复该工作流程。
    2. 使用脚本“stack2tifs”，结合用户输入的帧率，将每个TIFF序列转换为包含一系列独立TIFF文件的文件夹，并生成一个包含每帧起始时间的metadata.txt文件。对于非TIFF序列格式的数据，必须首先使用材料表中列出的软件进行格式转换。
      注意：该脚本是软件包的一部分。脚本的详细信息可在此处找到： “https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs”
    3. 使用 -px 参数，即采集时的像素尺寸（单位为nm）。在本例中，像素尺寸为130 nm。使用 -xmax 和 -ymax 参数来调整散点图输出的坐标轴比例，分别对应最长绘制的丝状物长度和最大绘制速度（单位为nm/s）。
      ​注意：这些为估计值，可设置为高于预期的数值，以确保所有数据均包含在图中。分析完成后，原始数据也可导出，用于其他统计或绘图软件进行查看和进一步分析。
    4. 使用 -minv 参数（最小速度截断参数）来定义未移动的丝状物，从而将其排除在分析之外。对于如NM2b这类运动较慢的肌球蛋白，该参数必须设得较低（本例中为5 nm/s），以避免排除真实的滑动运动；而对于如M5a这类快速肌球蛋白，该参数可设得较高（本例中为100 nm/s），以施加更严格的数据筛选，同时保留真实的滑动速度分布。
    5. 使用 -pt cutoff 参数识别平滑运动。在每个采样窗口中，计算一个值，等于100 × 速度标准差 / 平均速度。高于截断值的轨迹具有更大的速度变异性，将被排除在进一步分析之外。在本例中，截断值设为33。高于该值的轨迹因其速度波动较大而被排除。
    6. 使用 -maxd 参数设置帧间允许的最大连接距离。该值为肌动蛋白丝质心在单位时间内移动的距离（单位为nm），可用于排除偶然性运动或丝状物之间的错误连接。在本示例中，该参数保留默认值2,000 nm。
  2. TIRF显微镜实验的图像分析
    注意：使用材料表中特别列出的成像软件分析单分子TIRF实验的流程如下29。
    1. 将录制的显微镜视频点击并拖拽至软件工作区以打开51。然后拆分采集通道。点击图像 > 颜色 > 拆分通道。
      注意：若在采集过程中出现明显的载物台漂移，必须对图像进行稳定化处理以校正成像平面上的仪器漂移。在本例中，由于所用显微镜对Z轴聚焦具有良好的稳定性，因此未对Z轴漂移进行补偿。为在图像分析程序中稳定图像，请安装材料列表中提供的适当稳定化插件。图像稳定化功能假设图像中物体位置固定，并以前若干帧的滚动平均值作为参考。因此，建议首先处理标记肌动蛋白的通道，因其位置固定。
    2. 点击插件，然后找到图像稳定化器；确保选择平移，并保留默认设置。勾选对数变换系数旁边的复选框。此对数步骤允许在下一步中将计算出的位移参数应用于其他通道。等待处理完成。
    3. 接着，打开标记肌球蛋白的通道，并通过点击插件 > 图像稳定化对数应用器来应用稳定化处理。如果由于单通道需要更高帧率成像而无法在同一采集过程中获取肌动蛋白图像，则可通过选择包含静态物体（如生物素化定位标记或非特异性结合于生物素-PEG表面的荧光团）的区域，对该图像序列进行漂移稳定化处理。可从原始序列中裁剪该区域并进行稳定化，然后将所得的位移值应用到原始序列上。
      ​注意：在实际操作中，运动实验中观察到的漂移相对于以数百nm/s移动的肌球蛋白而言通常可忽略不计，但对于最慢的肌球蛋白，这一因素则变得重要。
    4. 然后，打开TrackMate，点击插件；在其下拉菜单中点击追踪，最后点击TrackMate。此时，图像分析需根据荧光团特性和实验条件优化参数。但理想的初始参数如下：
      1. 校准设置：保留所有默认值。
      2. 检测器：LoG检测器。
      3. 估计斑点直径：0.5–1.0 微米。
      4. 阈值：25–200。（可通过选择一个数值后点击预览，查看检测到的斑点是否与视频匹配，并进行适当调整。）
      5. 初始阈值设定：未设置。
      6. 视图：HyperStack显示器。
      7. 斑点过滤器设置：未设置。
      8. 追踪器：简单LAP追踪器。
        ​注意：该参数取决于帧率和肌球蛋白速度，必须足够大以连接连续位置，同时排除不同颗粒之间的错误连接。
      9. 连接最大距离：1.0 微米。
      10. 间隙闭合最大距离：1.0 微米。
      11. 间隙闭合最大帧间隔：1。
      12. 轨迹过滤器设置：轨迹位移（>0.39，仅保留移动超过3像素的斑点），轨迹中斑点数（>3，仅保留包含至少3个斑点的轨迹）。可引入其他过滤器（如最小速度）以排除长时间停滞的斑点。必须通过目视检查轨迹结果，确保去除虚假轨迹（即背景中非沿肌动蛋白丝运动的肌球蛋白信号），同时保留与肌动蛋白相关的轨迹。
    5. 当显示选项界面出现后，点击分析以获取相关输出结果。保存生成的三个表格（轨迹统计表、轨迹链接统计表和轨迹中斑点统计表）。轨迹统计表将包含速度和位移数据，可用于后续分析，以表征新型蛋白或特定实验条件的影响等。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

可通过还原性十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来评估肌球蛋白的纯化效果，如图2所示。尽管该图展示的是透析后的最终纯化肌球蛋白，但也可对纯化过程中各个阶段的等分试样进行SDS-PAGE分析，以确定是否有产物残留在上清液中。肌球蛋白5a的重链片段（HMM）在120–130 kDa范围内出现条带，而全长非肌肉肌球蛋白2b则在200–230 kDa范围内出现对应于重链的条带29,44。肌球蛋白5a还在约17 kDa处有一条带，代表钙调蛋白（calmodulin）。非肌肉肌球蛋白2b在约17 kDa处有一条带，代表轻链（ELC）。由于该NM2b样品中含有GFP标记的调节轻链（RLC），因此RLC条带出现在约47 kDa处；然而，若未标记GFP，则未标记的RLC条带将出现在约20 kDa处。

在视频1和图3...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文展示了一种对肌球蛋白5a和非肌型肌球蛋白2b进行纯化及体外表征的工作流程。该实验体系可用于快速、可重复地定量分析纯化的肌球蛋白构建体的机械化学特性。尽管此处展示的两种肌球蛋白仅为众多可能中的具体示例，但经过适当调整后，这些条件和方法可广泛适用于大多数肌球蛋白及其他多种分子马达蛋白。

此处讨论的实验方案可根据实验室和实验的具体需求进行调整。例如，如表达与分子生物学部分所述，本文所用蛋白是通过两种或多种病毒共感染产生的；然而，使用多表达载体（如 p-FastBac 双表达载体或 BiGBac 表达系统）同样可实现成功的蛋白表达53。

多个因素可能影响重组蛋白的顺利制备。为防止蛋白质降解，必须确保蛋白质纯化的每一步均在适当的温度下进行，所有离心步骤均在 4 °C 下完成，其余操作均在冰上进行。透析后的蛋白质样品在凝胶电泳中可能出现额外条带，这可能提示存在降解或污染。通过尺寸排阻层析或离子交换层析进行后续纯化，可提高样品纯度54。为此，...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明无利益冲突。

致谢

感谢张芳博士在准备本研究所需试剂过程中提供的技术支持。本工作由美国国家心肺血液研究所/国立卫生研究院院内研究计划基金 HL001786 资助 J.R.S.。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 mL 注射器BD309628
2 M CaCl2 溶液VWR10128-558
2 M MgCl2 溶液VWR10128-298
27号针头Becton Dickinson309623
5 M NaCl 溶液KD MedicalRGE-3270
乙酸ThermoFisher Scientific984303
乙酸戊酯Ladd Research Industries10825
Anti-FLAG M2 亲和凝胶Millipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
生物素标记的G-肌动蛋白细胞骨架公司AB07
牛血清白蛋白Millipore Sigma5470
bPEG-硅烷Laysan Bio, IncBiotin-PEG-SIL-3400-1g
Bradford 试剂浓缩液伯乐（Bio-Rad）5000006
钙调蛋白PMID: 2985564
过氧化氢酶Millipore SigmaC40
细胞系（Sf9）在 SF-900 II SFM 中ThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
圆形滤纸 - 滑动实验Millipore SigmaWHA1001125
圆形滤纸 - 倒置实验Millipore SigmaWHA1001090
cOmplete，无EDTA蛋白酶抑制剂片剂Millipore Sigma5056489001这应于4℃保存 °C. 平板可直接使用，或通过将1片溶于2 mL蒸馏水中配制成25倍浓缩液。所得溶液可在4℃保存 °C下保存1-2周，或在-20℃下至少保存12周 °C. 
浓缩管（100,000 截留分子量）EMD Millipore CorporationUFC910024截留分子量（MWCO）并非必须 "一刀切" 只要截留分子量（MWCO）小于待纯化蛋白的总分子量即可。本文中的非肌球蛋白2b（NM2b）使用截留分子量为100,000的浓缩管进行浓缩，而肌球蛋白5a（M5a）则使用截留分子量为30,000的浓缩管进行浓缩。
考马斯亮蓝 R-250 染料ThermoFisher Scientific20278
盖玻片架Millipore SigmaZ688568-1EA
盖玻片：肌动蛋白滑动丝测定VWR International48366-227
盖玻片：倒置运动性测定法Azer ScientificES0107052
透析袋（3500 道尔顿截留分子量）Fischer Scientific08-670-5A透析管的直径可以不同，但截留分子量（MWCO）应保持一致。本研究中使用的非肌球蛋白2b（NM2b）在18 mm透析管中进行透析。透析管可保存于4 ℃的20%乙醇溶液中。 °C.
DL-二硫苏糖醇Millipore SigmaD0632
双面胶带Office Depot909955
DYKDDDDK 肽GenScriptRP10586这可以溶解在含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN 的缓冲液中3，以及10 mM MOPS（pH 7.2），最终浓度为50 mg/mL。可于-20℃保存 °300 毫摩尔 µL 等分试样。 
EGTAMillipore SigmaE4378
洗脱柱伯乐（Bio-Rad）761-1550这些可重复使用。清洗时，先用 2–3 柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗层析柱，然后在 4 °C 下冷藏保存。° 使用前置于冰上。
乙醇Fischer ScientificA4094
G-肌动蛋白PMID: 4254541G-actin 储存液可保存在 200 μM 在液氮中2.
葡萄糖Millipore SigmaG8270
葡萄糖氧化酶Millipore SigmaG2133
100 mM 甘氨酸缓冲液，pH 2–2.5，1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTag普洛麦格G100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
大孔径移液器吸头Fischer Scientific02-707-134
亮肽素蛋白酶抑制剂ThermoFisher Scientific78435
Mark12 未染色标准蛋白分子量标记ThermoFisher ScientificLC5677
甲醇Millipore SigmaMX0482
甲基纤维素Millipore SigmaM0512
显微镜载玻片Fischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-硅烷Laysan Bio, IncMPEG-SIL-2000-1g
肌球蛋白轻链激酶PMID: 23148220FLAG标签的MLCK可采用与本文所述FLAG标签肌球蛋白相同的方法进行纯化。 
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidin赛默飞世尔科技31050
硝酸纤维素Ladd Research Industries10800
NuPAGE 4% 至 12% Bis-Tris 小型蛋白凝胶，15 孔ThermoFisher ScientificNP0323PK2
NuPAGE LDS 样品缓冲液 (4X)ThermoFisher ScientificNP0007
磷酸盐缓冲液，pH 7.4ThermoFisher Scientific10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF 可用异丙醇配制成 0.1 M 的储存液，并于 4 ℃ 保存 °C. 加入异丙醇会导致晶体析出，但可通过室温搅拌使其溶解。使用前应立即将PMSF逐滴加入快速搅拌的溶液中，终浓度为0.1 mM。 
刀片Office Depot397492
罗丹明-鬼笔环肽ThermoFisher ScientificR415可将储备液用100%甲醇稀释至终浓度为200 μM.
Sf9培养基ThermoFisher Scientific12658-027这应于4℃保存° C. 其保质期为自生产日期起18个月。
组织培养皿 - 滑动实验康宁353025每个组织培养皿可容纳约九个盖玻片。
组织培养皿 - 倒置实验康宁353003每个组织培养皿可容纳约四个盖玻片。
平滑侧 200 µL 吸头托马斯科学公司1158U38
设备
离心ThermoFisher Scientific75006590
显微镜尼康型号：Eclipse Ti，配备 H-TIRF 系统和 100 倍 TIRF 物镜（数值孔径 1.49）
显微镜相机Andor型号：iXon DU888 EMCCD 相机（1024 × 1024 传感器格式）
显微镜环境控制箱Tokai HIT定制温控盒
显微镜激光装置尼康LU-n4 四激光单元，配备用于 405 nm、488 nm、561 nm 和 640 nm 的固态激光器
中型台式离心机ThermoFisher Scientific型号：CR3i
Misonix 超声波破碎仪MisonixXL2020
Optima Max-Xp 台式超速离心机Beckman Coulter393315
等离子清洗机Diener electronic GmbH + Co. KG系统类型：Zepto
超声波破碎仪探头（3.2 mm）Qsonica4418
标准培养箱结合蛋白模型：56
Waverly 试管混合器WaverlyTR6E
软件
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST（版本 1.01）http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST 可用于基于 Mac OSX 和 Linux 的系统。
图像稳定插件https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
成像软件NIS Elements（AR 软件包）
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
文件：TrackMate-手册.pdf
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md

参考文献

  1. Sellers, J. R. Myosins: A diverse superfamily. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1496 (1), 3-22 (2000).
  2. Cheney, R. E., Mooseker, M. S. Unconventional myosins. Current opinion in cell biology. 4 (1), 27-35 (1992).
  3. Rhoads, A. R., Friedberg, F. Sequence motifs for calmodulin recognition. FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11 (5), 331-340 (1997).
  4. Vilfan, A. Ensemble velocity of non-processive molecular motors with multiple chemical states. Interface Focus. 4 (6), 20140032(2014).
  5. Richards, T. A., Cavalier-Smith, T. Myosin domain evolution and the primary divergence of eukaryotes. Nature. 436 (7054), 1113-1118 (2005).
  6. Odronitz, F., Kollmar, M. Drawing the tree of eukaryotic life based on the analysis of 2,269 manually annotated myosins from 328 species. Genome Biology. 8 (9), 1-23 (2007).
  7. Kollmar, M., Mühlhausen, S. Myosin repertoire expansion coincides with eukaryotic diversification in the Mesoproterozoic era. BMC Evolutionary Biology. 17 (1), 1-18 (2017).
  8. Berg, J. S., Powell, B. C., Cheney, R. E. A millennial myosin census. Molecular Biology of the Cell. 12 (4), 780-794 (2001).
  9. De La Cruz, E. M., Sweeney, H. L., Ostap, E. M. ADP inhibition of myosin V ATPase activity. Biophysical Journal. 79 (3), 1524-1529 (2000).
  10. Mehta, A. D., et al. Myosin-V is a processive actin-based motor. Nature. 400 (6744), 590-593 (1999).
  11. Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).
  12. Sakamoto, T., Amitani, I., Yokota, E., Ando, T. Direct Observation of Processive Movement by Individual Myosin V Molecules. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (2), 586-590 (2000).
  13. Veigel, C., Wang, F., Bartoo, M. L., Sellers, J. R., Molloy, J. E. The gated gait of the processive molecular motor, myosin V. Nature Cell Biology. 4 (1), 59-65 (2002).
  14. Sakamoto, T., Webb, M. R., Forgacs, E., White, H. D., Sellers, J. R. Direct observation of the mechanochemical coupling in myosin Va during processive movement. Nature. 455 (7209), 128-132 (2008).
  15. Cheney, R. E., et al. Brain myosin-V is a two-headed unconventional myosin with motor activity. Cell. 75 (1), 13-23 (1993).
  16. Wu, X., Bowers, B., Wei, Q., Kocher, B., Hammer, J. A. Myosin V associates with melanosomes in mouse melanocytes: evidence that myosin V is an organelle motor. Journal of Cell Science. 110 (7), 847-859 (1997).
  17. Wagner, W., Brenowitz, S. D., Hammer, J. A. Myosin-Va transports the endoplasmic reticulum into the dendritic spines of Purkinje neurons. Nature Cell Biology. 13 (1), 40-48 (2011).
  18. Hammer, J. A., Sellers, J. R. Walking to work: roles for class V myosins as cargo transporters. Nature reviews. Molecular cell biology. 13 (1), 13-26 (2011).
  19. Vicente-Manzanares, M., Ma, X., Adelstein, R. S., Horwitz, A. R. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 778-790 (2009).
  20. Beach, J. R., Hammer, J. A. Myosin II isoform co-assembly and differential regulation in mammalian systems. Experimental Cell Research. 334 (1), 2-9 (2015).
  21. Ebrahim, S., et al. NMII forms a contractile transcellular sarcomeric network to regulate apical cell junctions and tissue geometry. Current Biology. 23 (8), 731-736 (2013).
  22. Ma, X., Bao, J., Adelstein, R. S. Loss of Cell Adhesion Causes Hydrocephalus in Nonmuscle Myosin II-B-ablated and Mutated Mice. Molecular Biology of the Cell. 18 (6), 2305-2312 (2007).
  23. Billington, N., Wang, A., Mao, J., Adelstein, R. S., Sellers, J. R. Characterization of three full-length human nonmuscle myosin II paralogs. Journal of Biological Chemistry. 288 (46), 33398-33410 (2013).
  24. Li, X., Mabuchi, K., Ikebe, R., Ikebe, M. Ca2+-induced activation of ATPase activity of myosin Va is accompanied with a large conformational change. Biochemical and Biophysical Research Communications. 315 (3), 538-545 (2004).
  25. Nagy, A., et al. Kinetic characterization of nonmuscle myosin IIB at the single molecule level. Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 709-722 (2013).
  26. Sandquist, J. C., Swenson, K. I., DeMali, K. A., Burridge, K., Means, A. R. Rho kinase differentially regulates phosphorylation of nonmuscle myosin II isoforms A and B during cell rounding and migration. Journal of Biological Chemistry. 281 (47), 35873-35883 (2006).
  27. Scholey, J. M., Taylor, K. A., Kendrick-Jones, J. Regulation of non-muscle myosin assembly by calmodulin-dependent light chain kinase. Nature. 287 (5779), 233-235 (1980).
  28. Adelstein, R. S., Anne Conti, M. Phosphorylation of platelet myosin increases actin-activated myosin ATPase activity. Nature. 256 (5518), 597-598 (1975).
  29. Melli, L., et al. Bipolar filaments of human nonmuscle myosin 2-A and 2-B have distinct motile and mechanical properties. eLife. 7, 1-25 (2018).
  30. Fujita, K., Ohmachi, M., Ikezaki, K., Yanagida, T., Iwaki, M. Direct visualization of human myosin II force generation using DNA origami-based thick filaments. Communications Biology. 2 (1), (2019).
  31. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. Journal of Analytical Methods in Chemistry. 2013, Table 1 (2013).
  32. De La Cruz, E. M., Michael Ostap, E. Kinetic and equilibrium analysis of the myosin ATPase. Methods in Enzymology. 455 (08), 157-192 (2008).
  33. Kron, S. J., Spudich, J. A. Fluorescent actin filaments move on myosin fixed to a glass surface. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (17), 6272-6276 (1986).
  34. Homsher, E., Wang, F., Sellers, J. R. Factors affecting movement of F-actin filaments propelled by skeletal muscle heavy meromyosin. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 262 (3), 714-723 (1992).
  35. Bunk, R., et al. Actomyosin motility on nanostructured surfaces. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (3), 783-788 (2003).
  36. Ito, K., et al. Recombinant motor domain constructs of Chara corallina myosin display fast motility and high ATPase activity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 312 (4), 958-964 (2003).
  37. Pyrpassopoulos, S., Feeser, E. A., Mazerik, J. N., Tyska, M. J., Ostap, E. M. Membrane-bound Myo1c powers asymmetric motility of actin filaments. Current Biology. 22 (18), 1688-1692 (2012).
  38. Lindberg, F. W., et al. Controlled surface silanization for actin-myosin based nanodevices and biocompatibility of new polymer resists. Langmuir. 34 (30), 8777-8784 (2018).
  39. Greenberg, M. J., Moore, J. R. The molecular basis of frictional loads in the in vitro motility assay with applications to the study of the loaded mechanochemistry of molecular motors. Cytoskeleton. 67 (5), 273-285 (2010).
  40. Liao, W., Elfrink, K., Bähler, M. Head of myosin IX binds calmodulin and moves processively toward the plus-end of actin filaments. Journal of Biological Chemistry. 285 (32), 24933-24942 (2010).
  41. O'Connell, C. B., Mooseker, M. S. Native Myosin-IXb is a plus-, not a minus-end-directed motor. Nature Cell Biology. 5 (2), 171-172 (2003).
  42. Higashi-Fujime, S., et al. The fastest-actin-based motor protein from the green algae, Chara, and its distinct mode of interaction with actin. FEBS Letters. 375 (1-2), 151-154 (1995).
  43. Kengyel, A., Wolf, W. A., Chisholm, R. L., Sellers, J. R. Nonmuscle myosin IIA with a GFP fused to the N-terminus of the regulatory light chain is regulated normally. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 31 (3), 163-170 (2010).
  44. Wang, F., et al. Effect of ADP and ionic strength on the kinetic and motile properties of recombinant mouse myosin V. Journal of Biological Chemistry. 275 (6), 4329-4335 (2000).
  45. Sakamoto, T., Yildiz, A., Selvin, P. R., Sellers, J. R. Step-size is determined by neck length in myosin V †. Biochemistry. 44 (49), 16203-16210 (2005).
  46. Moore, J. R., Krementsova, E. B., Trybus, K. M., Warshaw, D. M. Myosin V exhibits a high duty cycle and large unitary displacement. Journal of Cell Biology. 155 (4), 625-636 (2001).
  47. Bryant, Z., Altman, D., Spudich, J. A. The power stroke of myosin VI and the basis of reverse directionality. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (3), 772-777 (2007).
  48. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  49. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).
  50. Aksel, T., Choe Yu, E., Sutton, S., Ruppel, K. M., Spudich, J. A. Ensemble force changes that result from human cardiac myosin mutations and a small-molecule effector. Cell Reports. 11 (6), 910-920 (2015).
  51. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  52. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).
  53. Weissmann, F., et al. biGBac enables rapid gene assembly for the expression of large multisubunit protein complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2564-2569 (2016).
  54. Bird, J. E., et al. Chaperone-enhanced purification of unconventional myosin 15, a molecular motor specialized for stereocilia protein trafficking. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (34), 12390-12395 (2014).
  55. Bookwalter, C. S., Kelsen, A., Leung, J. M., Ward, G. E., Trybus, K. M. A toxoplasma gondii class XIV myosin, expressed in Sf 9 cells with a parasite co-chaperone, requires two light chains for fast motility. Journal of Biological Chemistry. 289 (44), 30832-30841 (2014).
  56. Rahman, M. A., Salhotra, A., Månsson, A. Comparative analysis of widely used methods to remove nonfunctional myosin heads for the in vitro motility assay. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 39 (5-6), 175-187 (2018).
  57. Aguilar, H. N., Tracey, C. N., Tsang, S. C. F., McGinnis, J. M., Mitchell, B. F. Phos-tag-based analysis of myosin regulatory light chain phosphorylation in human uterine myocytes. PLoS One. 6 (6), 20903(2011).
  58. Kinoshita, E., et al. Separation of phosphoprotein isotypes having the same number of phosphate groups using phosphate-affinity SDS-PAGE. PROTEOMICS. 8 (15), 2994-3003 (2008).
  59. Yang, Y., et al. A FERM domain autoregulates Drosophila myosin 7a activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (11), 4189-4194 (2009).
  60. Kalwarczyk, T., et al. Comparative analysis of viscosity of complex liquids and cytoplasm of mammalian cells at the nanoscale. Nano Letters. 11 (5), 2157-2163 (2011).
  61. Brizendine, R. K., et al. Velocities of unloaded muscle filaments are not limited by drag forces imposed by myosin cross-bridges. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (36), 11235-11240 (2015).
  62. Umemoto, S., Sellers, J. R. Characterization of in vitro motility assays using smooth muscle and cytoplasmic myosins. The Journal of Biological Chemistry. 265 (25), 14864-14869 (1990).
  63. Reck-Peterson, S. L., Tyska, M. J., Novick, P. J., Mooseker, M. S. The yeast class V myosins, Myo2p and Myo4p, are nonprocessive actin-based motors. Journal of Cell Biology. 153 (5), 1121-1126 (2001).
  64. Hachikubo, Y., Ito, K., Schiefelbein, J., Manstein, D. J., Yamamoto, K. Enzymatic Activity and Motility of Recombinant Arabidopsis Myosin XI, MYA1. Plant and Cell Physiology. 48 (6), 886-891 (2007).
  65. Bing, W., Knott, A., Marston, S. B. A simple method for measuring the relative force exerted by myosin on actin filaments in the in vitro motility assay: Evidence that tropomyosin and troponin increase force in single thin filaments. Biochemical Journal. 350 (3), 693-699 (2000).
  66. Molloy, J. E., Burns, J. E., Kendrick-Jones, J., Tregear, R. T., White, D. C. S. Movement and force produced by a single myosin head. Nature. 378 (6553), 209-212 (1995).
  67. Finer, J. T., Simmons, R. M., Spudich, J. A. Single myosin molecule mechanics: piconewton forces and nanometre steps. Nature. 368 (6467), 113-119 (1994).
  68. Bao, J., Huck, D., Gunther, L. K., Sellers, J. R., Sakamoto, T. Actin structure-dependent stepping of Myosin 5a and 10 during processive movement. PLoS One. 8 (9), 74936(2013).
  69. Ricca, B. L., Rock, R. S. The stepping pattern of Myosin X is adapted for processive motility on bundled actin. Biophysical Journal. 99 (6), 1818-1826 (2010).
  70. Barua, B., Nagy, A., Sellers, J. R., Hitchcock-DeGregori, S. E. Regulation of nonmuscle myosin II by tropomyosin. Biochemistry. 53 (24), 4015-4024 (2014).
  71. Hodges, A. R., et al. Tropomyosin is essential for processive movement of a class V myosin from budding yeast. Current biology: CB. 22 (15), 1410-1416 (2012).
  72. Hundt, N., Steffen, W., Pathan-Chhatbar, S., Taft, M. H., Manstein, D. J. Load-dependent modulation of non-muscle myosin-2A function by tropomyosin 4.2. Scientific Reports. 6 (1), 20554(2016).
  73. Los, G. V., et al. HaloTag: A novel protein labeling technology for cell imaging and protein analysis. ACS Chemical Biology. 3 (6), 373-382 (2008).
  74. Nelson, S. R., Ali, M. Y., Warshaw, D. M. Quantum dot labeling strategies to characterize single-molecular motors. Methods in Molecular Biology. 778, 111-121 (2011).
  75. Forkey, J. N., Quinlan, M. E., Alexander Shaw, M., Corrie, J. E. T., Goldman, Y. E. Three-dimensional structural dynamics of myosin V by single-molecule fluorescence polarization. Nature. 422 (6930), 399-404 (2003).
  76. Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors. MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).
  77. Haldeman, B. D., Brizendine, R. K., Facemyer, K. C., Baker, J. E., Cremo, C. R. The kinetics underlying the velocity of smooth muscle myosin filament sliding on actin filaments in vitro. The Journal of Biological Chemistry. 289 (30), 21055-21070 (2014).
  78. Ruhnow, F., Kloβ, L., Diez, S. Challenges in estimating the motility parameters of single processive motor proteins. Biophysical Journal. 113 (11), 2433-2443 (2017).
  79. Zheng, Q., Blanchard, S. C. Single fluorophore blinking. Encyclopedia of Biophysics. , 2322-2323 (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

2b 5a
基于体外荧光显微镜的运动分析技术针对肌球蛋白的特异性优化
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。