Method Article

体外荧光显微镜基于动感检测的肌素特异性适应

DOI:

10.3791/62180

⸱

February 4th, 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Molecular Physiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Department of Physiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania

In This Article

Summary

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这里介绍的是一个过程来表达和净化肌素5a，然后讨论其特征，使用合奏和单分子体外荧光显微镜为基础的测定，以及如何修改这些方法来描述非肌肉肌素2b。

Abstract

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肌素蛋白与丝状活性素（F-actin）结合和相互作用，存在于噬菌体树的生物体中。它们的结构和酶特性适应它们在细胞中执行的特殊功能。肌素 5a 在 F - actin 上游行， 在细胞中运输黑色素体和囊泡。相反，非肌肉肌素2b作为一个双极丝，包含约30个分子。它向灯丝中心移动相反极性的F-actin，肌素分子在重复循环之前异步工作，以结合作用素，传递功率冲程，并分离。非肌肉肌素 2b 及其其他非肌肉肌素 2 等形体具有包括细胞粘附、细胞因子和张力维护等角色。肌素的机械化学可以通过使用纯化蛋白进行体外动能检测来研究。在滑翔行动素灯丝检测中，肌素被绑在显微镜覆盖面，并转移荧光标记的F-actin，可以跟踪。然而，在单分子/合奏运动性测定中，F-actin 必然会与覆盖唇结合，并观察到荧光标记肌素分子在F-actin上的运动。在本报告中，概述了使用亲和色谱法从 Sf9 细胞中重组肌素5a的净化。在此之后，我们概述了两个荧光显微镜为基础的检测:滑翔作用素灯丝检测和倒置运动性检测。通过这些测定，可以使用图像分析软件提取行动素移位速度和单分子运行长度和速度等参数。这些技术也可以应用于研究非肌肉肌素2等形体的单丝运动，在此背景下讨论的非肌肉肌素2b。此工作流表示一个协议和一组定量工具，可用于研究非肌肉肌素的单分子和合奏动力学。

Introduction

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肌酸是运动蛋白，利用从腺苷三磷酸盐（ATP）水解1中提取的能量对作用素丝施加力。肌素包含头部、颈部和尾部域。头部域包含作用素结合区域以及 ATP 结合和水解的站点。颈部域由智商图案组成，它们与光链、镇静素或镇静蛋白类蛋白质2、3结合。尾部区域具有几种功能，特定于每类肌素，包括但不限于两个重链的变暗，货物分子的结合，并通过与头部域的自动抑制相互作用调节肌素1。

肌素的多功能性因班级而异。其中一些属性包括值班比率（肌素的机械周期的一部分，肌素必然作用）和过程性（电机在分离前在其轨道上进行多个步骤的能力）4。超过40类肌素是根据序列分析5，6，7，8确定的。第2类肌素被归类为"常规"，因为它们是第一个被研究的:因此，所有其他类型的肌素被归类为"非常规"。

肌素 5a （M5a） 是 5 级肌素，是一种加工电机，这意味着它可以在分离前沿行动素采取多个步骤。它有一个高关税比率，表明它花了很大一部分机械周期必然行动9，10，11，12，13，14。与其他肌酸一样，重链包含一个N-终端电机域，包括一个行动素结合和ATP水解站点，然后是一个颈部区域，作为一个杠杆臂，与六个智商图案，结合到基本的光链（ELC）和镇静剂（CAM）15。尾部区域包含α-螺旋线圈，使分子变暗，然后是用于结合货物的球状尾部区域。其动力学反映了它参与黑色素细胞中的黑色素体的运输和Purkinje神经元16，17的内质视网膜的运输。M5a 被认为是典型的货物运输电机18。

类 2 肌素， 或传统的肌素， 包括肌素， 骨骼， 心脏和光滑的肌肉的力量收缩除了非肌肉肌素 2 （NM2） 异形， NM2a， 2b， 和 2c19.NM2同构体存在于所有细胞的细胞质中，在细胞因子、粘附、组织形态和细胞迁移19、20、21、22中具有共同作用。本文讨论了非肌肉肌素2b（NM2b）23背景下的常规肌素协议。NM2b，与M5a相比，具有较低的关税比率，并且酶速度较慢，V最大值为0.2 s-123，而M5a的V最大值为≈18s-124。值得注意的是，用两个头截断的NM2b构造不会轻易在行动上进行处理性移动:相反，每次遇到行动素会导致功率冲程，然后分离分子25。

NM2b 包含两个肌素重链，每个链条都有一个球状头域、一个杠杆臂（带一个 ELC 和一个调节光链 （RLC））和一个α螺旋线圈杆/尾域，大约 1，100 个氨基酸长，使这两个重链变暗。NM2b的酶活性和结构状态受RLC23磷酸化调节。未磷基NM2b，在ATP和生理离子强度（约150mM盐）的存在下，采用紧凑的构象，其中两个头参与不对称的相互作用，尾巴折回头部在两个地方23。在这种状态下，肌素与作用素没有很强的相互作用，并且具有非常低的酶活性。在RLC磷酸化由镇静肌素依赖肌素光链激酶（MLCK）或Rho相关蛋白激酶，分子延伸和与其他肌素通过尾部区域，形成约30肌素分子23的双极丝。上述RLC的磷化也导致NM2b的ACTPase活性增加约四倍26，27，28。这种双极丝排列，每端都有许多肌素电机，在收缩和张力维护中的作用得到优化，其中具有对立极性的作用线可以相互移动23，29。因此，NM2b 已被证明是与行为素交互时作为电机的合奏。这种灯丝中的大量电机使NM2b灯丝在作用丝上进行处理性移动，使体外细丝的处理性成为可能，以29为特征。

虽然在理解肌素在细胞中的作用方面取得了进展，但有必要在蛋白质水平上了解其个体特征。为了理解在简单的蛋白质-蛋白质相互作用水平，而不是细胞内部的活性肌素相互作用，我们可以表达和净化重组肌素用于体外研究。这些研究的结果然后告诉机械生物学家关于特定肌素的生物物理性质，最终驱动复杂的细胞过程12，13，14，25，29。通常，这是通过添加亲和力标签到全长或截断肌素结构和净化通过亲和色谱29，30，31。此外，该结构可以设计为包括基因编码的氟磷或合成荧光蛋白标签。通过添加这样的荧光标签，可以进行单分子成像研究来观察肌素力学和动力学。

经过净化，肌素可以通过几种方式进行特性。ATPase 活性可以通过色度测量方法进行测量，从而深入了解电机在不同条件下的整体能耗和作用亲和力。为了了解其动力的机械化学性，需要进一步的实验。本文详细介绍了两种体外荧光显微镜方法，可用于描述纯化肌素蛋白的体外特性。

其中第一种方法是滑翔作用素丝测定，可用于定量研究肌素电机的合奏特性，以及定性地研究一批纯化蛋白33的质量。虽然本文讨论了使用总内部反射荧光（TIRF）显微镜进行此测定，但这些实验可以有效地使用配备数码相机的广域荧光显微镜进行，这在许多实验室中很常见。在此检测中，肌素电机的饱和层连接到覆盖唇上。这可以使用硝基纤维素，抗体，膜，SiO2衍生表面（如三甲基氯西兰），除其他29，33，35，36，37，38。荧光标记的活性丝通过覆盖唇室，在室室中，作用素与附着在表面的肌素结合。添加 ATP（和 NM2 研究中的激酶）后，对腔室进行成像，以观察表面肌素对作用素丝的转移。跟踪软件可用于关联每个滑翔行动丝的速度和长度。分析软件还可以提供移动和静止作用素丝的数量，这可用于确定给定肌素制备的质量。停滞的细丝的比例也可以故意调节通过表面系绳的Actin到其他蛋白质，并测量，以确定肌素39的负荷依赖性。由于每个作用素灯丝可以由大量的可用电机推动，这种测定是非常可重复的，最终测量的速度是强大的扰动，如改变在开始肌素浓度或在解决方案中存在其他因素。这意味着它可以很容易地修改，以研究肌素活动在不同的条件下，如改变的磷化，温度，离子强度，溶液粘度，以及由表面系绳引起的负载的影响。虽然诸如不能进行ATP水解的强结合肌素"死头"等因素可导致作用素丝停滞，但存在多种方法来缓解此类问题并允许精确测量。肌素的动能特性因班级而异，根据所使用的具体肌素，此测定中的行为素丝滑翔速度可能从低于 20 nm/s（肌素 9）40、41和高达 60，000 nm/s（Characean 肌素 11）42。

第二次检测颠倒了滑翔行动素丝测定12的几何形状。在这里，作用细丝连接到覆盖唇表面，M5a单分子或NM2b单双极丝的运动被可视化。此检测可用于量化单肌素分子或丝在行动素上的运行长度和速度。盖唇涂有一种化合物，可阻断非特定结合，同时使表面功能化，如生物素聚乙烯乙二醇（生物素-PEG）。添加改良的维丁衍生物，然后使表面和生物素化作用素通过腔室，导致一层F-actin稳定地绑在腔室底部。最后，激活和荧光标记肌素（通常为 1-100 nM）流经腔室，然后成像以观察肌素在固定作用素丝上的运动。

这些模式代表快速和可重复的方法，可用于检查非肌肉和肌肉肌素的动态。本报告概述了净化M5a和NM2b的程序，分别代表非常规和常规肌素。随后，将讨论一些肌素特异性适应，这些适应可以执行，以在两种类型的检测中成功捕获运动。

表达和分子生物学
感兴趣的肌素的 cDNA 必须克隆到经过修改的 pFastBac1 矢量上，该载体在表示 M5a-HMM 时编码 C 端端旗标签 （DYKDDDDK），如果表示 NM2b23、43、44、45、46的全长分子，则编码 N-终端标志。NM2b 上的 C 端旗标签导致 FLAG 亲和力列的蛋白质亲和力减弱。相比之下，N-终端标记的蛋白质通常与旗亲和力列23结合得很好。N-终端标记蛋白保留酶活性、机械活性和磷酸依赖调节23。

在本文中，使用了截断的鼠标 M5a 重质肌蛋白 （HMM） 样结构，在 FLAG 标签和肌素重链的 C 终点之间使用了 GFP。请注意，与 NM2b 不同，M5a-HMM 可以使用 N 或 C 端标志成功标记和纯化，在这两种情况下，产生的构造都将是活性。M5a 重链在氨基酸 1090 中被截断，在 GFP 和 M5a47的线圈线圈区域之间含有三个氨基酸链 （GCG）。GFP 和 FLAG 标签之间没有添加其他链接器。M5a - hmm 与平静的杜林共同表达。全长人类NM2b结构与ELC和RLC共同表达。RLC 的 N-术语通过五种氨基酸 （SGLRS） 的链接器与 GFP 融合在一起。直接连接到标志标签的是一个光环塔格。在光环塔格和肌素重链的N终点之间，有一个由两种氨基酸（AS）制成的链接器。

两种肌素制剂均从一升感染巴库洛病毒的 Sf9 细胞培养中纯化，密度约为2×106 细胞/mL。每个子组的 baculo 病毒数量取决于由制造商说明确定的病毒的感染倍数。在M5a病例中，细胞与两种不同的巴库洛病毒共同感染，一种用于镇静剂，另一种用于M5a重链。在NM2b病例中，细胞与三种不同的病毒共同感染，一种用于ELC，一种用于RLC，另一种用于NM2b重链。对于使用多种肌素（或其他多复合蛋白）的实验室，这种方法是有效的，因为它允许重链和轻链的许多组合，常用的轻链，如镇静剂，可以与许多不同的肌素重链共同感染。所有细胞工作都是在生物安全柜中完成的，采用适当的无菌技术，以避免污染。

对于 M5a 和 NM2b 的表达，通过离心机在感染后 2-3 天收集产生重组肌素的 Sf9 细胞，并存储在 -80 °C 下。 细胞颗粒是通过在4°C下离心共感染的Sf9细胞，在2，800 x g下30分钟获得的。蛋白质净化过程详见下文。

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Protocol

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1. 蛋白质纯化

  1. 细胞裂解和蛋白质提取
    1. 根据表 1 准备 1.5倍提取缓冲。过滤并存储在 4 °C 下。
    2. 开始解冻冰上的细胞颗粒。当颗粒解冻时，用 1.2 mM 二硫醇 （DTT）、5 μg/mL 脂蛋白、0.5 μM 苯甲基磺胺 （PMSF） 和两片蛋白酶抑制剂补充 100 mL 提取缓冲剂。继续冰上
    3. 一旦颗粒解冻，每10 mL细胞培养基添加1 mL的补充提取缓冲。例如，如果细胞颗粒由 500 mL 的细胞培养形成，则在颗粒中添加 50 mL 的补充提取缓冲。
    4. 将细胞颗粒声波化，同时将其留在冰上。对于每个颗粒，请使用以下条件:5 s On，5 s OFF，持续时间为 5 分钟，功率为 4-5。
    5. 将所有同质化溶解剂收集到烧焦器中，并加入 ATP（0.1 M 库存溶液;pH 7.0），使 ATP 的最终浓度为 1 mM。在寒冷的房间里搅拌15分钟。ATP 将活性肌素与活性肌素分离，使其在以下离心步骤中分离。因此，必须立即着手采取下一步行动，尽量减少ATP耗尽和重新装订采取行动的可能性。
    6. 在 4°C 下以 48，000 x g为 1 h 的离心剂。 当这种情况发生时，根据制造商的说明，开始用 100 mL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 清洗 1-5 mL 的 50% 抗弗拉格亲和力树脂（用于由 1 升细胞形成的颗粒）。例如，对于 5 mL 的树脂，洗 10 mL 的 50% 泥浆。在最后的洗涤步骤中，用 1-5 mL 的 PBS 重新使用树脂，其体积足以产生 50% 的泥浆。
    7. 在解冻离心后，将超纳特与洗过的树脂浆和岩石在冷室中轻轻地混合1-4小时。在等待时，制作 表 1 中描述的缓冲器，并将它们放在冰上。
  2. 标志亲和力净化准备
    1. 在 500 x g 的第 1.7 步中将解决方案离心，在 4 °C 下进行 5 分钟。 树脂将包装在管子的底部。在不干扰树脂的情况下，取出超高纳特。
    2. 将树脂重新用 50 mL 缓冲器 A 中重新使用， 如表 1 中所详述的，离心机在 500 x g 下，在 4 °C 下 5 分钟使用。 在不干扰树脂的情况下，取出超高纳特。
    3. 将树脂重新装在 50 mL 的缓冲 B 中， 如表 1 中所详述，离心机在 500 x g 下以 5 分钟在 4 °C 下使用。 再次重复此步骤，并在缓冲 B 的 20 mL 中重新使用树脂。然后，通过手轻轻倒置管子约10次，彻底混合树脂和缓冲器。
  3. 蛋白质的解放和浓度
    1. 制作 表 1 中描述的 30 mL 的 Elution 缓冲器，让它在冰上冷却。
    2. 在寒冷的房间里设置放流柱。轻轻地将树脂浆倒入柱中。用 1-2 列量的缓冲 B 作为底部的树脂包装清洗柱，确保树脂不会干涸。
    3. 流 1 mL 的 Elution 缓冲器通过树脂，并在 1.5 mL 管中收集流经。重复上述步骤，收集 12，1 mL 分数。
    4. 此时，对分数进行粗略的布拉德福德测试，以定性地确定哪些分数是最集中的48。在一排 96 井板上， 移液器 60 μL 1x 布拉德福德试剂。收集分数时，每口井混合每个分数的 20 μL。较深的蓝色表示更集中的分数。
    5. 在 50 mL 管中，通过通过柱子轻轻管道将剩余的 Elution 缓冲器收集剩余的蛋白质，以释放与柱流中的树脂结合的任何剩余肌素。此流程将集中在下一步。确保树脂按照制造商的说明再生并储存。
    6. 使用 100，000 MWCO 浓缩管将三个最集中的分数集中到 50 mL 管中，并进一步集中流经以及剩余的 1 mL 分数。将集中的样品以 750 x g 的速度加载到浓缩管和离心机上，在 4 °C 下持续 15 分钟，然后重复，直到所有被清除的蛋白质都浓缩到大约 0.5-1 mL 的最终体积。
      注:这种毛孔大小允许肌素分子的保留，其质量是分子重量截断的几倍。光链在此浓度过程中与电机域紧密结合，通过在最终产品上执行 SDS-PAGE 凝胶电泳来验证。
  4. 透析和闪光冻结
    1. 制作 2 L 的透析缓冲器，如 表 1中所述。将样品装在透析袋或室中，在冷室过夜。请注意，NM2b 和 M5a 的透析缓冲器的组成不同。
      注:在NM2b的情况下，这个透析步骤的目的是形成肌素丝在低离子强度缓冲。然后，这些细丝的沉积提供了额外的净化步骤，并允许样品的浓度。因此，第二天透析室会有可见的白色沉淀物。这些灯丝将通过离心收集，并在第 5.1 步脱聚。在M5a-HMM的情况下，在隔夜透析后，蛋白质将足够纯净，用于随后的检测。如有必要，可以执行进一步的净化步骤，如凝胶过滤或离子交换色谱。对于透析后的 M5a 恢复，请前往第 5.2 步。
  5. 透析后恢复肌素
    1. 对于 NM2b，请小心地从透析袋或室中卸下整个样品，并在 4 °C 下离心机中卸下整个样品，在 49，000 x g 下 15 分钟收集肌素丝。丢弃超高超剂，并按表 1中描述的增量将存储缓冲器添加到颗粒中，直到颗粒溶解。温和的上下管道有助于使颗粒溶化。通常，这不需要每根管子超过 500 μL。在确保颗粒完全溶解在高离子强度存储缓冲器中后，可以执行额外的离心步骤（15 分钟，49，000 x g），以便在需要时去除不需要的聚合物，因为肌素现在将未聚合，并将继续留在超高分子中。
    2. 对于 M5a-HMM，小心地从透析室和离心机中收集整个样品，在 4 °C 下 15 分钟，在 49，000 x g 下，以防出现任何不需要的聚合物。拿超纳特
  6. 浓度确定和闪光冻结
    1. 要确定产品的浓度，使用光谱光度计测量波长 260、280、290 和 320 nm 的吸收量。用方程1计算mg/mL（c毫克/mL）的浓度，其中A280表示280纳米的吸收，A320表示320纳米的吸收。由此产生的毫克/mL浓度可以转化为肌素分子的μM与方程2，其中M是整个蛋白质的分子重量（包括重链，光链，氟，和所有标签）。
      c毫克/mL =（A280 - A320） / ε （1）
      μM 分子 = 1000cmg/mL/M （2）
      注:如果稀释是必要的，那么它必须在高离子强度缓冲中完成。灭绝系数（ε）可以通过将蛋白质的氨基酸序列导入 ExPASy 等程序来确定。M5a-HMM 的典型产量约为 0.5-1 mL 的 1-5 毫克/mL 蛋白质，全长 NM2b 的产量为 0.5-1 mL，为 0.5-2 毫克/mL。本文中使用的M5a-HMM的灭绝系数为0.671。本文使用的NM2b的灭绝系数为0.611。
    2. 将纯化肌素存储在两种方式之一。将 10-20 μL 之间的 Aliquot 放入薄壁管（如聚合链式反应管）中，并将管子放入液氮容器中进行闪存冻结。或者，将20-25μL肌素之间的移液器直接储存到液氮中，并将蛋白质的冷冻珠储存在无菌低温管中。无论哪种情况，产生的管子都可以储存在 -80 °C 或液氮中，供将来使用。
      注:由于下面描述的两种动能检测都需要少量的蛋白质，因此如前所述，储存在小小的阿利报价中是经济的。

2. 滑翔作用灯丝检测

  1. 盖滑准备
    1. 在乙酸淀粉中制作1%的亚硝基纤维素溶液。
    2. 获得组织培养皿（150 x 25 mm），并在盘底添加圆形滤纸（直径125毫米）。
    3. 将8个1.5号厚度22毫米方形盖片装上架子，用约2-5 mL的200防乙醇清洗，然后用2-5mL蒸馏水（dH2O）清洗。重复此洗涤步骤，以水结尾。然后，使用过滤的气管或 N2线完全干燥盖片。
    4. 采取一个盖唇和缓慢移液器10微升的1%硝基纤维素溶液沿滑的一个边缘。然后，在一个光滑的运动中，使用光滑的侧面 200 μL 移液器尖端将其涂抹在盖唇的其余部分。将此盖片放在组织培养皿上，并向上放置硝基纤维素侧。重复处理剩余的盖片，让它们干燥，同时准备剩余的试剂，并在涂层后 24 小时内使用覆盖滑。
  2. 会议厅准备
    1. 用光学透镜纸擦拭显微镜滑梯，以清理大碎片。切割两片双面胶带，长度约2厘米。
    2. 沿着显微镜滑梯的长边中间放置一块。确保磁带边缘与幻灯片边缘对齐。将第二块磁带放在第一块磁带下方约 2 mm 处，使两者平行对齐。这将创建一个流量室，可以容纳大约 10 μL 的溶液（见图 1）。
    3. 从第 1 部分中取出亚硝基纤维素涂层的覆盖唇之一。小心地将盖片粘在胶带上，使涂有硝基纤维素的侧面与胶带直接接触（见 图1）。使用移液器尖端，轻轻按压滑动胶带接口，以确保盖唇正确粘附在滑动上。用剃须刀刀片切割悬在滑梯边缘的多余的胶带。
  3. 行动准备
    1. 在聚合缓冲区（50 mM KCl，2 m MCl2，1 mM DTT，25 m M MOPS（pH 7.0））中聚合球蛋白（G-actin）在4°C过夜，使20μM F-actin。
    2. 稀释 F-actin 到 5 μM 的动感缓冲 （20 mM MOPS， 5 m MgCl2， 0.1 m M EGTA， 1 mM DTT （pH 7.4）） 。标签与至少 1.2 倍摩尔过量的罗达胺 - phaoidin 。在冰上离开（覆盖在铝箔中）至少2小时。这可以使用长达1-2个月，储存在冰上。
  4. 执行肌素 5a 滑翔行动灯丝检测
    注:本节提供了肌素5a（HMM）滑翔检测的细节。
    1. 为 表 2 中描述的肌素 5a 准备解决方案，并将其保留在冰上。
    2. 流经流量室的肌素 5a （50-100 nM） 的 10 μL，等待 1 分钟。
    3. 在 50 m M MB 中以 1 μL 的 1 毫克/mL BSA 以 1 mM DTT（"低盐"缓冲器）流入 10 μL。再重复洗两次，第三次洗后等待 1 分钟。使用纸巾或滤纸的一角，通过通道轻轻地将纸的一角放置在流动室出口处，从而将溶液槽芯入通道。
    4. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    5. 在 10 μL 的黑色行动素溶液（5 μM F-actin，1 μM 镇静素和 1 mM ATP 在 50 m MB 与 1 mM DTT 中流动），以消除"死头"，如 讨论 部分所讨论的。
      1. 派佩特解决方案与1 mL注射器和27G针切开行动细丝，然后引入溶液到腔室。再重复这一步两次，第三次后等待 1 分钟。大约20个管道事件就足够了。
      2. 要执行"死头"旋转，在 1 mM ATP 和 1 mM MgCl2 的盐浓度为 500 mM 的情况下，在肌素中加入一个气压测量量的 F-actin。然后超中心在 480，000 x g 15 分钟在 4 °C. 死去的肌素会在弹丸里
    6. 流在 50 μL 的 50 mM MB 与 1 mM DTT 和 1 mM ATP 耗尽自由行动丝室。
    7. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。重复此洗涤两次，以耗尽任何 ATP 的腔室。
    8. 在 10 μL 的 20 nM 罗丹作用素 （Rh-Actin） 溶液中流动，其中包含 1 mM DTT 在 50 m MB 中，等待 1 分钟，以便将行为素丝与连接到盖唇表面的肌素 5a 进行严格结合。
    9. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗，洗去不与表面绑定的 Rh-Actin 灯丝。再重复洗两次。
    10. 流在 30 μL 的最终缓冲器中。
    11. 使用 561 nm 的激发波长在荧光显微镜上记录图像，以可视化 Rh-Actin。适当的曝光时间为 200 ms，激光功率为 1.4 mW，总采集持续时间为 0.5-1 分钟。
      注意:确保收购率适当缩放到移动灯丝的速度。在收集数据用于跟踪程序之前，一个重要的考虑因素是获取帧速率。帧之间的子像素运动将导致对速度的高估，需要几百纳米的运动才能获得准确的值。最佳的采集速率功能是使帧之间至少保持一个像素距离的滑翔。如果此处用于成像的 TIRF 显微镜，此阈值转换为 130 nm:因此，肌素预计行驶 1 μm/s 必须以 5 帧/s（0.2 s 间隔）的速度进行成像，以实现 200 nm 的运动，而肌素预期行驶 10 nm/s 需要 0.05 帧/s（20s 间隔）。因此，如果有必要，在此阶段可以对数据进行减小采样（有关详细信息，请参阅 讨论 ）。
  5. 执行非肌肉肌素 2b 滑翔行动肌丝检测
    注:本节提供了全长非肌肉肌素 2b 滑翔检测的详细信息。非肌肉肌素 2b 滑翔作用体丝检测协议不同于肌素 5a 协议在某些步骤。确保每个步骤都使用正确的缓冲器。例如，NM2b 检测要求肌素附着在高盐缓冲器的盖唇上，而 M5a 可以在高盐缓冲器或低盐缓冲器中附着在覆盖液上。此外，M5a 滑翔作用素灯丝检测使用肌素浓度较低，以降低在采集过程中分解的肌素丝的频率。
    1. 准备表 2 中描述的 NM2b 解决方案，并将它们保留在冰上。
    2. 在 500 mM 动性缓冲器 （MB） （"高盐"缓冲器） 和 1 mM 二恶英 （DTT） 的 10 μL 中流过流量室，等待 1 分钟。
      注:高盐缓冲器分离肌素丝，允许单肌素分子附着在表面，因为非肌肉肌素2b可以聚合成丝在离子浓度<150mM。
    3. 流量在 1 μL 的 1 毫克/mL 牛血清白蛋白 （BSA） 在 500 m M MB 与 1 mM DTT （"高盐" 缓冲） 如 表 2所述。再重复洗两次，第三次洗后等待 1 分钟。使用纸巾或滤纸的一角，通过通道将溶液芯过。
    4. 按 表 2中描述的 10 微升 500 m M MB 洗涤，1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    5. 如 表 2 中所述，黑色行为素溶液的 10 μL 流量，以消除"死头"， 讨论部分进 一步讨论了这一点。黑色actin溶液包含 5 μM 未标记的 F-actin、1-10 nM MLCK、1 mM ATP、0.2 m M CaCl2、1μM CaM 和 1 mM DTT，在 50 mM NaCl 动性缓冲中，用于磷酸化腔面上的非肌肉肌素 2b。
      1. 派佩特解决方案与1 mL注射器和27G针切开行动细丝，然后引入溶液到腔室。再重复这一步两次，第三次后等待 1 分钟。大约，20个管道事件就足够了。
    6. 流在 50 μL 的 50 mM MB 与 1 mM DTT 和 1 mM ATP 耗尽自由行动丝室。
    7. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。重复此洗涤两次，以耗尽任何 ATP 的腔室。
    8. 流在 10 μL 的 20 nM Rh-Actin 溶液中，包含 1 mM DTT 在 50 m M MB 中，等待 1 分钟，以便将行动肌丝严格绑定到连接到表盖唇表面的非肌肉肌素 2b 上。
    9. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗，洗去不与表面绑定的 Rh-Actin 灯丝。再重复洗两次。
    10. 流在 30 μL 的最终缓冲器中。对于非肌肉肌素 2b 滑翔作用素灯丝检测， 最终缓冲器还包括镇静剂， CaCl2，和肌素光链激酶， 以提供全磷化非肌肉肌素 2b 在视频成像.0.7% 甲基纤维素也可以包含在最终缓冲区，如果作用素丝只是松散绑定或不绑定到表面。 讨论 部分进一步讨论了这个问题。
    11. 使用 561 nm 的激发波长在荧光显微镜上记录图像。适当的曝光时间为 200 ms，激光功率为 1.4 mW，总采集持续时间为 0.5 -3 分钟。
      注意:确保收购率适当缩放到移动灯丝的速度。在收集数据用于跟踪程序之前，一个重要的考虑因素是获取帧速率。帧之间的子像素运动将导致对速度的高估，需要几百纳米的运动才能获得准确的值。最佳的采集速率功能是使帧之间至少保持一个像素距离的滑翔。如果此处用于成像的 TIRF 显微镜，此阈值转换为 130 nm:因此，肌素预计行驶 1 μm/s 必须以 5 帧/s（0.2 s 间隔）的速度进行成像，以实现 200 nm 的运动，而肌素预期行驶 10 nm/s 需要 0.05 帧/s（20s 间隔）。因此，如果有必要，在此阶段可以对数据进行低抽样（有关详细信息，请参阅 讨论 ）。

3. 单分子 TIRF 检测

  1. 盖滑准备
    1. 将库存粉分为10毫克（1.5兆L管）的甲氧基-Peg-硅烷（mPEG）和10毫克的生物素-佩格-硅烷（bPEG）。在密封的无水分容器中储存 -20 °C，并在 6 个月内使用。
    2. 将8个1.5H（高精度）厚度22毫米方形盖片装上机架，用2-5mL的200防乙醇洗涤，然后用2-5mL蒸馏水洗净。重复此洗涤步骤，以水结尾。然后，使用气管或 N2 完全干燥盖片，用 argon 清洁等离子体 3 分钟。
    3. 将干净的盖片放在滤纸（90 毫米）的组织培养皿（100 x 20 mm）中，并在 70 °C 烤箱中孵育，同时执行以下步骤。
      注:等离子体清洗可以用其他化学清洗方法49代替。
    4. 使用 dH2O 准备 80% 乙醇溶液，并使用 HCl 将 pH 值调整为 2.0。 将其中 1 mL 添加到 10 毫克的 mPEG 和 1 mL 的 bPEG 阿利奎特中。漩涡溶解，这不应该超过30s。
    5. 服用 100 μL 的 bPEG 溶液，并添加 900 μL 的 80% 乙醇 （pH 2.0）.。此解决方案为 1 毫克/mL bPEG。然后，对两种 PEG 进行如下解决方案，彻底混合。
      1. 200微升10毫克/mL mPEG（最终浓度:2毫克/毫升）。
      2. 10 微升 1 毫克/毫升 bPEG（最终浓度:10 微克/毫升）。
      3. 80% 乙醇 （pH 2.0） 溶液中的 790 μL。
    6. 把盖片从烤箱里拿出来。小心地将 100 μL 的 PEG 溶液分配到每个盖唇的中心，确保只有顶部表面是湿的。然后，将滑倒放回烤箱中，孵育20至30分钟。
    7. 当盖唇开始呈现出洞形外观，表面明显有小圆圈时，将其从烤箱中取出。
    8. 用100%乙醇清洗每个盖唇，用气管干燥，放回烤箱。仅在第 2 步创建房间所需的时间进行孵化。
  2. 会议厅准备
    1. 清洁显微镜幻灯片，用于制作房间。切割两片双面胶带，长度约2厘米。
    2. 沿着显微镜滑梯的长边中间放置一块。确保磁带边缘与幻灯片边缘对齐。将第二块磁带放在第一块磁带下方约 2 mm 处，使两者平行对齐。
    3. 从烤箱中取出一个功能化的盖片（以 3.1 创建）。小心地将盖片粘在胶带上，使涂有 PEG 的侧面朝下，与胶带直接接触，如图 1所示。使用移液器尖端，轻轻按压滑动胶带接口，以确保盖唇正确粘附在滑动上。
    4. 用剃须刀刀片切割悬在滑梯上的多余的胶带。这些腔室可以立即使用或对放入 50 mL 管中，并存储在 -80 °C 的冰柜中，供将来使用。重要的是立即存储或表面会退化。
  3. 执行肌素 5a TIRF 显微镜检测
    1. 为 表 3 中描述的肌素 5a 倒置运动性检测准备解决方案，并将其保留在冰上。
    2. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗房间。
    3. 在 50 mM MB 中，1 mg/mL BSA 中的 10 μL 流量为 1 mM DTT。再重复洗两次，第三次洗后等待 1 分钟。使用纸巾或滤纸的一角，通过通道将溶液芯过。
    4. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    5. 流在 10 μL 的 NeutrAvidin 溶液在 50 m M MB 与 1 mM DTT 和等待 1 分钟。
    6. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    7. 在 10 μL 的生物酸化罗丹（bRh-Actin）中流动，其中含有 1 mM DTT 在 50 m MB 中，等待 1 分钟。对于此步骤，使用大孔移液器尖端，避免上下管道，以尽量减少荧光作用丝的剪切，以确保长行动素丝可以连接到表面（20-30 μm 或更长）。一个有效的替代方案是切割标准移液器尖端的圆锥体（开口为≈1-1.5毫米）。
    8. 用 10 微升 50 m M MB 和 1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    9. 在 30 μL 的最终缓冲器中加入 10 nM 肌素 5a，然后立即加载到 TIRF 显微镜上，并在找到 TIRF 成像模式的最佳对焦后进行记录。100-200 ms 之间的曝光时间适合在 1.4 mW 激光功率下，用于作用素和 GFP 标记肌素。速度分析的适当采集时间为 3 分钟。
  4. 执行非肌肉肌素 2b TIRF 显微镜检测
    注:本节提供了使用聚合和磷酸化丝的非肌肉肌素2b TIRF检测的细节。包括用于在管中对非肌肉肌素-2b进行磷化和聚合的详细协议（第 4.1-4.3 节）。
    1. 要磷酸盐纯化的 NM2b，使 10 倍激酶与以下条件混合:2 mM CaCl2，1 μM CAM， 1-10 nM MLCK 和 0.1 mM ATP.这可以带来500mMB与10mM DTT的体积。以1:10的体积比将10倍激酶混合物添加到肌酸中，使其在室温下孵育20-30分钟。通常，此步骤的肌素浓度为 1 μM。
    2. 将磷化肌素聚合成细丝，将 NM2b 的盐浓度降低到 150 mM NaCl。为此，在 dH2O 中将 4 倍 MB 稀释四次，使 1 倍运动缓冲 （1x MB） 没有盐。这 1x MB 可用于降低盐浓度，因为 NM2b 被冻结在 500 mM 的盐缓冲器中。
    3. 每3 μL的库存NM2b，加入7微升的1xMB，将盐浓度降低到150mM NaCl，并在冰上孵育20-30分钟，形成NM2b灯丝。
      注:只要 NM2b 是磷化的，最终的盐浓度为 150 mM，第 4.1-4.3 节的顺序并不重要。在30分钟-1小时的顺序孵化允许足够的时间完成磷化和聚合。
    4. 为 表 3 中描述的非肌肉肌素 2b 倒置运动性分析准备解决方案，并将其保留在冰上。
    5. 用 150 mM MB 的 10 微升 1 m M DTT 清洗房间。
    6. 流量在 10 μL 的 1 毫克/mL BSA 在 150 m M MB 与 1 mM DTT 重复此洗涤两次，并等待 1 分钟后的第三次洗涤。使用纸巾或滤纸的一角，通过通道将溶液芯过。
    7. 用 150 mM MB 的 10 微升 1 m M DTT 清洗。再重复洗两次。
    8. 流在 10 μL 的 NeutrAvidin 溶液在 150 m M MB 与 1 mM DTT 和等待 1 分钟。
    9. 用 150 mM MB 的 10 微升 1 m M DTT 清洗。再重复洗两次。
    10. 以 10 μL 的 bRh - actin 流式流动， 等待 1 分钟。对于此步骤，使用大孔移液器尖端，避免上下管道，以尽量减少荧光作用丝的剪切，以确保长动作丝可以连接到表面（20-30 μm 或更长）。一个有效的选择是切割标准移液器尖端的圆锥体。
    11. 用 150 mM MB 的 10 微升 1 m M DTT 清洗。再重复洗两次。
    12. 在 10 μL 的非肌肉肌素 2b 溶液 （约 30 nM） 中流动，等待 1 分钟。
    13. 用 150 MB 的 10 μL 和 1 mM DTT 清洗。再重复洗两次。
    14. 在 30 μL 的最终缓冲器中流动，然后立即加载到 TIRF 显微镜上，并在找到 TIRF 成像模式的最佳对焦后进行记录。100-200 ms 之间的曝光时间适合在 1.4 mW 激光功率下，用于作用素和 GFP 标记肌素。速度分析的适当采集时间为 3 分钟。

4. 图像分析

  1. 滑翔行动丝检测的图像分析
    注:图像可以使用材料列表中链接的软件和手册进行分析。请务必注意，此处描述的程序需要 TIFF 堆栈进行分析。分析滑翔作用素丝测定的过程如下50。
    1. 将原始电影堆栈上传到指定的文件夹结构中，并将电影文件夹中最重要的目录输入到程序中。
      注:程序分析整个目录和子目录中的文件，将最低级别的目录视为复制。将生成每组复制品的平均统计数据。在这种情况下，每个肌素都使用一部电影。在描述小说肌素或研究新的实验条件时，建议分析每个腔室三个视场 （FOV） 的电影，总共三个腔室，并重复此工作流程，以进行三次肌素制备调查。
    2. 使用脚本"堆栈2tifs"与用户输入的帧速率一起将每个 TIFF 堆栈转换为包含一系列单独 TIFF 文件和相应元数据的文件夹.txt 包含每个帧的开始时间的文件夹。对于不在 TIFF 堆栈格式中的数据，必须首先使用软件（如 材料表中列出的软件）进行转换。
      注:此脚本是软件包的一部分。脚本的信息可以在这里找到:"https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/bin/stack2tifs"
    3. 在获取过程中使用 -px 参数，即像素大小（以 nm 为单位）。在这种情况下，像素大小为 130 nm。使用 -xmax 和 -ymax 参数缩放散射图输出的轴。这些对应于绘制时间最长的长丝长度和最大绘图速度（以 nm/s 为内）。
      注:这些是估计值，可以设置为高于预期值，以确保数据包含在图中。经过分析，原始数据也可以导出用于其他统计或图形软件进行查看和分析。
    4. 使用 -minv 参数（这是最小速度截止参数）来定义不移动的细丝，因此可以排除在分析之外。对于慢肌素（如 NM2b），此参数必须低（在此示例中为 5 nm/s），以避免切断真正的滑翔运动。对于快速肌素（如 M5a），此参数可以更高（在此示例中为 100 nm/s），以应用更严格的过滤器，同时保留真正的滑翔速度分布。
    5. 使用 -pt 截止参数来识别平滑运动。对于每个采样窗口，值计算等价于 100 x 速度标准偏差/平均速度。比截止值更高的轨道具有更多的可变速度，并且被排除在进一步分析之外。在此示例中，使用了 33 的截止值。具有较高值的轨道具有更可变的速度，并排除在进一步分析之外。
    6. 使用 - 最大值以设置帧之间的最大允许链接距离。这是由 nm 单位的灯丝中心移动的计算帧到帧距离。它可以是有用的排除零星运动或灯丝之间的不正确联系。在此示例中，参数的默认值为 2，000 nm。
  2. TIRF 显微镜检测的图像分析
    注:分析图像软件中特别列出的单分子 TIRF 检测的过程 材料表 如下所示29.
    1. 单击并拖动录制的显微镜视频到软件的工作空间打开它51。然后，拆分收购渠道。点击 图像>颜色>分裂通道。
      注:在采集过程中发生明显阶段漂移时，必须稳定图像以校正成像平面上的仪器漂移。在这种情况下，没有使用Z轴漂移补偿，因为用于获取此数据的显微镜很好地稳定了Z对焦。要在图像分析程序上稳定图像，安装与 材料列表链接的适当稳定器插件。图像稳定器为图像中的对象假定固定位置，并使用前一帧的滚动平均值作为参考。因此，建议的程序是从包含标记行为素图像的通道开始，因为这是在固定位置。
    2. 单击 插件，然后查找 图像稳定器:确保 选择翻译 并保留默认设置。检查 日志转换系数旁边的框。应用此日志步骤允许在下一步中将计算的移位参数应用于其他通道。允许完成该过程。
    3. 然后，打开带有标记肌素的通道，通过单击 插件>图像稳定器日志应用程序应用稳定。如果由于单个通道中对高速率成像的要求而无法在同一采集期间获取 Actin 图像，则通过选择包含静态物体（如生物素化纤维标记或非专门与生物素-PEG 表面绑定的荧光片）的区域来漂移以稳定图像堆栈。此区域可以从原始堆栈裁剪并稳定，然后将产生的转移值应用到原始堆栈。
      注:在实践中，在运动实验中观察到的漂移相对于以几百纳米/小时移动的肌素运动可以忽略不计，但对于最慢的肌素来说，这成为一个重要的考虑因素。
    4. 然后，打开轨道伴侣，点击 插件:然后，在其下拉菜单点击 跟踪 ，最后在 跟踪伴侣。此时，图像分析将根据荧光和检测条件的参数进行优化。但是，理想的起始参数如下。
      1. 校准设置:保留所有默认值。
      2. 探测器:洛格探测器。
      3. 估计斑点直径:0.5-1.0 微米。
      4. 阈值:25-200。（这可以通过在选择数字后单击 预览 来确定，以查看检测到的斑点是否与电影匹配并进行适当调整。
      5. 初始阈值:未设置。
      6. 视图:超堆栈显示器。
      7. 将滤镜设置在点上:未设置。
      8. 跟踪器:简单的 LAP 跟踪器。
        注:这些取决于帧速率和肌素速度，并且必须足够大，以连接后续位置，同时排除不同粒子之间的不需要连接。
      9. 连接最大距离:1.0微米。
      10. 缩小间隙最大距离:1.0 微米。
      11. 缩小间隙最大帧间隙: 1.
      12. 设置轨道上的滤镜:轨道位移（>0.39-仅包含移动超过 3 像素的点）、轨道中的点（>3-仅包含至少 3 个点的轨道）。可能会引入其他过滤器，如"最小速度"，以排除长时间失速的斑点。过滤的结果必须通过对轨道的视觉检查来检查，以确保在保留与行为素相关的轨道的同时，删除虚假的轨道（即不在行为轨道的背景中的肌素运动）。
    5. 显示 选项 屏幕出现后，单击相关输出的 分析 。保存生成的三个表（跟踪统计、跟踪统计中的链接和跟踪统计中的斑点）。 跟踪统计 表将包含速度和位移数据，然后可以随后分析，以描述一种新的蛋白质或某种实验条件的影响，例如。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肌素的纯化可以通过执行减少硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳（如图2所示）来评估。虽然这个数字代表最终的，透析后肌素，SDS-PAGE可以在净化程序的不同阶段的alquot上执行，以确定任何产品丢失给超高纳特。肌素 5a HMM 有一个带在 120-130 kDa 范围和全长非肌肉肌素 2b 有一个带在 200-230 kDa 范围， 对应于重链29，44.肌素 5a 也有一个乐队接近 17 kda 标记， 标记平静。非肌肉肌素 2b 的带子约为 17 kDa， 表示 ELC。由于此 NM2b 制备中存在 GFP 标记的 RLC，因此 RLC 的显示速度约为 47 kDa:但是，如果没有 GFP 标记，则未标记的 RLC 将出现在大约 20 kDa 下。

视频 1和图3中显示的滑翔动作灯丝检测代表了理想...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这里介绍的是肌素 5a 和非肌肉肌素 2b 的净化和体外特征的工作流程。这组实验有助于以快速可重复的方式量化纯化肌素结构的机械化学特性。虽然这里显示的两种肌素只是许多可能性中的两个具体例子，但条件和技术可以应用到大多数肌素和许多其他运动蛋白中，并采用一些定制技术。

此处讨论的协议会根据实验室和实验的个别需求而有所不同。例如，正如在表达和分子生物学部分所讨论的，本文中使用的蛋白质是由两种或两种以上病毒的共同感染产生的:然而，成功的蛋白质表达也可以通过多表达载体，如p-FastBac双表达载体或BiGBac表达系统53实现。

有几个因素会阻碍重组蛋白的成功生产。为了防止蛋白质降解，蛋白质净化的每一步都必须在适当的温度下完成，所有离心步骤都在 4 °C 下进行，所有其他步骤都在冰上执行。过量的频带可能在透析蛋白产品的凝胶中明显。这可能表明退化或污染。随后通过大小排除或离子交换色谱进行净化可以提高样品的纯度。为此，建议在蛋白质纯化过程的每一...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢张方博士为准备用于收集这些数据的试剂提供的技术援助。这项工作得到了NHLBI/NIH校内研究计划基金HL001786对J.R.S的支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1 mL注射器BD309628
2 M CaCl2 溶液VWR10128-558
2 M MgCl2 溶液VWR10128-298
27 规格针头Becton Dickinson309623
5 M NaCl 溶液KD 医用RGE-3270
乙酸ThermoFisher Scientific984303
乙酸戊酯Ladd Research Industries10825
抗 FLAG M2 亲和凝胶Millipore SigmaA2220https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/a2220bul.pdf
ATPMillipore SigmaA7699
生物素化的 G-肌动蛋白Cytoskeleton， Inc.AB07
牛血清白蛋白Millipore Sigma5470<
strong>bPEG-硅烷Laysan Bio， Inc生物素-PEG-SIL-3400-1g
Bradford 试剂浓缩物Bio-Rad5000006
钙调蛋白PMID：2985564
过氧化氢酶Millipore SigmaC40
Cell Line （Sf9） SFMThermoFisher Scientific11496015http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bevtest.pdf https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/bactobac_man.pdf
圆形滤纸 - 滑动测定Millipore SigmaWHA1001125
圆形滤纸 - 倒置测定Millipore SigmaWHA1001090
cOmplete，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂Millipore Sigma5056489001这应该储存在 4 &°C。片剂可以直接使用，也可以通过将 1 片溶解在 2 mL 蒸馏水中来复溶为 25x 储备液。所得溶液可储存在 4 °C 1-2 周或至少 12 周，温度为 -20 &°C。
<强>浓缩管 （100,000 MWCO）EMD Millipore CorporationUFC910024MWCO 小于被纯化蛋白质的总分子量，管的 MWCO 就不一定是"一刀切"的。本文中的 NM2b 用 100,000 MWCO 管浓缩，M5a 用 30,000 MWCO 管浓缩。
考马斯亮蓝 R-250 染料ThermoFisher Scientific20278
盖玻片架Millipore SigmaZ688568-1EA
strong>Coverslips：滑行作用丝测定VWR International48366-227
Coverslips：倒置运动测定Azer ScientificES0107052
透析管 （3500 Dalton MCWO）Fischer Scientific08-670-5A透析管的直径可以变化，但 MWCO 应相同。本文使用的 NM2b 在 18 mm 透析管中透析。试管可储存在 4 &°C 的 20% 酒精溶液中。
DL-二硫苏糖醇Millipore SigmaD0632
双面胶带Office Depot 909955
DYKDDDDK 肽GenScriptRP10586将其溶解在含有 0.1 M NaCl、0.1 mM EGTA、3 mM NaN3 和 10 mM MOPS（pH 7.2）的缓冲液中，最终浓度为 50 mg/mL。这可以在 -20 °C as 300 和微量;L 等分试样。
EGTAMillipore SigmaE4378
洗脱柱Bio-Rad761-1550这些可以重复使用。要清洁，请用 2-3 倍柱体积的 PBS 和蒸馏水冲洗色谱柱。将色谱柱冷却在 4°C 使用前。
乙醇Fischer ScientificA4094
G-肌动蛋白PMID：4254541G-肌动蛋白原液可储存在 200 μ;M 在液体 N2 中。
葡萄糖Millipore SigmaG8270<
strong>葡萄糖氧化酶Millipore SigmaG2133
甘氨酸缓冲溶液，100 mM，pH 2-2.5,1 LSanta Cruz Biotechnologysc-295018
HaloTagPromegaG100A
HClMillipore Sigma320331
KClFischer ScientificP217-500
大口吸液管吸头Fischer Scientific02-707-134
亮肽素蛋白酶抑制剂ThermoFisher Scientific78435
Mark12 未染色标准标准标准品>ThermoFisher ScientificLC5677
甲醇Millipore SigmaMX0482
甲基纤维素Millipore SigmaM0512
显微镜载玻片Fischer Scientific12-553-10
MOPSFischer ScientificBP308-100
mPEG-硅烷Laysan Bio， IncMPEG-SIL-2000-1g
肌球蛋白轻链激酶PMID：23148220标记的 MLCK 的纯化方法与 本文中纯化 FLAG 标记的肌球蛋白的方式相同。
NaN3Millipore SigmaS8032
NeutrAvidinThermoFisher Scientific31050
硝酸纤维素Ladd Research Industries10800
NuPAGE 4 至 12% Bis-Tris 迷你蛋白凝胶，15 孔ThermoFisher科学NP0323PK2
NuPAGE LDS 样品缓冲液 （4X）赛默飞世尔科技NP0007
磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4赛默飞世尔科技10010023
PMSFMillipore Sigma78830PMSF 可以在异丙醇中制成 0.1 M 储备液，并储存在 4&°C 中。添加异丙醇会导致结晶沉淀，可通过在室温下搅拌溶解。临使用前，可以将 PMSF 滴加到快速搅拌的溶液中，最终浓度为 0.1 mM。
Razor BladesOffice Depot397492
罗丹明-鬼笔环肽ThermoFisherScientific R415原液可以用 100% 甲醇稀释至终浓度为 200 μm。
Sf9 培养基ThermoFisher Scientific12658-027这应该储存在 4&°C 下。其保质期为自生产之日起 18 个月。
组织培养皿 - 滑动测定Corning353025每个组织培养皿可容纳大约 9 个盖玻片。
组织培养皿 - 倒置检测Corning353003每个组织培养皿可容纳大约四个盖玻片。
<强>光滑面 200 &L 移液器吸头Thomas Scientific1158U38
设备
离心机ThermoFisher Scientific75006590
显微镜尼康型号：Eclipse Ti，配备 H-TIRF 系统，配备 100 倍 TIRF 物镜（N.A. 1.49）
显微镜相机Andor型号：iXon DU888 EMCCD相机（1024 x 1024传感器格式）
显微镜环境控制箱Tokai HIT定制Thermobox
显微镜激光单元尼康LU-n4四个激光单元，带405nm、488nm、561nm和640nm
的固态激光器中型台式离心机ThermoFisher Scientific型号：CR3i
Misonix SonicatorMisonixXL2020
Optima Max-XP台式超速离心机Beckman Coulter393315
Plasma-CleanerDiener electronic GmbH + Co. KGSystem类型：Zepto
超声波探头（3.2 mm）Qsonica4418
标准培养箱binder：56
Waverly 管式混合器WaverlyTR6E
软件
ImageJ FIJIhttps://imagej.net/Fiji/Downloads
FAST（版本 1.01）http://spudlab.stanford.edu/fast-for-automatic-motility-measurementsFAST 可用于基于 Mac OSX 和 Linux 的系统。
图像稳定器插件https://imagej.net/Image_Stabilizer
ImageJ TrackMatehttps://imagej.net/TrackMate
成像软件NIS Elements（AR 包）
http://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html
https://github.com/turalaksel/FASTrack
https://github.com/turalaksel/FASTrack/blob/master/README.md
SF-900 II 中的 只要 <型号 File:TrackMate-manual.pdf

References

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