该实验流程可用于对囊性纤维化患者肺部细菌生物膜的既定 体外模型进行抗生素敏感性检测。使用该模型可提高MBEC（最小生物膜清除浓度）检测的临床有效性。
方法文章
囊性纤维化肺部中Pseudomonas aeruginosa和Staphylococcus aureus生物膜的离体模型抗生素疗效检测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
对于囊性纤维化（CF）患者肺部存在的细菌生物膜，其抗生素的有效处方受到限制，原因是使用标准诊断方法（如肉汤微量稀释法、纸片扩散法或Etest）进行抗生素药敏试验（AST）的结果与抗生素治疗后的临床疗效之间相关性较差。尽管尝试利用现成的生物膜培养平台来改进药敏试验，但结果改善甚微。体外生物膜系统难以模拟CF肺部的理化环境，因而也无法准确再现细菌的生理状态和生物膜结构，这同样制约了针对CF感染的新疗法的发现。本文介绍一种实验方案，可在包含猪支气管组织和合成CF痰液的离体CF肺模型（ex vivo pig lung, EVPL）中，对形成成熟、类似体内状态生物膜的CF病原体进行药敏试验。
多种体外 已有多种检测生物膜对抗生素敏感性的方法，可在微量滴定板中使用标准实验室培养基或不同配方的合成囊性纤维化痰液进行。培养基以及生物膜附着基质（聚苯乙烯板与细支气管组织）均可能影响生物膜对抗生素的耐受性。我们发现临床分离株在上述条件下表现出增强的耐受性 铜绿假单胞菌 和 金黄色葡萄球菌 在离体模型中，生物膜对抗生素治疗的反应与标准微量稀释法测定的最低抑菌浓度（MIC）或纸片扩散法测定的敏感/耐药分类均无相关性。
该离体平台可用于患者样本的个体化生物膜药敏试验，并可作为药物研发过程中潜在抗生物膜药物的增强型检测平台。通过采用更接近体内环境的检测平台，优化处方用药或加速抗生物膜药物的发现，可显著改善囊性纤维化（CF）患者的健康结局，同时降低临床治疗和研发研究的成本。
引言
慢性生物膜感染影响免疫防御功能受损的个体。高风险人群包括患有遗传性疾病囊性纤维化（cystic fibrosis, CF）的患者1。在婴儿早期，异常黏稠且具有黏附性的呼吸道黏液被微生物定植，导致细支气管发生难以治愈的生物膜感染2,3。细菌以被大量基质包裹的生物膜形式生长，是慢性感染区别于健康宿主急性感染的重要特征之一；生物膜状态不仅通过基质限制抗生素扩散而保护细菌，还可降低细菌对抗生素的敏感性（例如通过诱导休眠状态或上调外排泵的表达）4,5。然而，宿主组织在疾病特异性条件下发生的生理和化学改变，进一步使细菌的生理状态不同于急性感染或标准实验室培养条件下的状态。在囊性纤维化中，典型例子包括利用非常规碳源（如肺表面活性物质释放的脂肪酸和氨基酸，以及黏蛋白经微生物降解后产生的代谢物）、受损组织释放的微量营养素（如铁），以及微氧环境6,7,8。
因此，特定生物膜感染环境中的理化条件可能影响对抗生素的反应。首先，胞外基质的结构和深度取决于局部环境条件，例如营养物质或剪切力。其次，环境信号可触发特定抗生素耐药基因的表达。例如，囊性纤维化（CF）病原体Pseudomonas aeruginosa在CF痰液中相较于体外培养条件下表现出β-内酰胺酶表达升高和孔蛋白表达降低9；而另一种CF病原体Burkholderia cenocepacia在CF痰液中生长时会上调β-内酰胺酶和外排泵10。第三，宿主体内条件可诱导生理或遗传性转变为对抗生素耐受的表型，这类表型在体外难以重现。其中包括囊性纤维化病原体Staphylococcus aureus的小菌落变异体11,12。
所有这些数据表明，当诊断实验室从致病性生物膜中分离单个克隆，并在标准实验室培养基（肉汤微量稀释法、纸片扩散法或Etest）中对浮游或琼脂平板培养的菌落进行药敏试验（AST）时，结果往往无法预测哪些抗生素在体内实际有效。即使使用了体外 生物膜检测方法，由于培养基和附着表面与体内条件不同，可能无法诱导出类似体内的生物膜表型，因此使用流动池或高通量微孔板平台的检测可能会高估抗生素的敏感性13。这一问题同样存在于学术界和工业界致力于开发新型抗生物膜药物的研究人员中：若使用流动池、微量滴定板或美国疾病控制中心（CDC）生物膜反应器等体外平台来评估药物潜力，可能会将生物膜疗效的标准设定过低，从而在研发流程中产生假阳性结果。
在囊性纤维化（CF）患者中，抗生素药敏试验（AST）结果与抗生素治疗后的临床结局之间相关性较差，这一问题已广为人知。由于缺乏统一的、针对CF的AST结果解读指南，许多临床医生直接忽略诊断实验室提供的药敏结果，转而根据具体病例情况决定用药方案。曾有研究尝试通过使用卡尔加里生物膜装置（Calgary biofilm device）来改进CF患者的药敏试验，该装置利用置于微量培养板孔内塑料小柱表面生长的生物膜，并在标准AST培养基（如阳离子调节的穆勒-欣顿肉汤）中进行试验14,15。然而，该方法在预测抗生素体内疗效方面并不优于传统的浮游菌AST16。这对CF患者的影响极为显著。 尽管反复使用抗生素（包括常规吸入抗生素，以及英国CF患者每年平均接受27天的静脉抗生素治疗）17，患者仍频繁且不可预测地发生急性肺部加重事件，导致进行性肺损伤，并在约90%的病例中最终因呼吸衰竭死亡。在最近的一项分析中，细菌性肺部感染是CF患者药物费用最强的预测因素，平均每年使直接医疗费用增加€3.6K/患者18,19。
对于原本健康个体的急性感染，当前的研究和政策集中于基于例如即时检测基因组预测的快速药敏试验（AST），这是理想方案20。然而，对于慢性囊性纤维化（CF）感染，显然需要采取不同的方法：即在模拟宿主环境的模型中实施药敏试验，这些模型能更真实地再现体内环境和病原体的代谢状态，并允许形成更接近实际的生物膜结构。
我们此前已开发出一种囊性纤维化（CF）生物膜模型，该模型由猪细支气管组织片段组成，将其在合成的CF痰液中孵育，并接种P. aeruginosa或S. aureus。未感染的EVPL组织在7天内保持正常的组织病理学特征，但P. aeruginosa和S. aureus的实验室或临床分离株均能在此模型中稳定地在组织周围形成类似体内感染的聚集体，模拟了CF感染的致病过程21,22,23。本文介绍了一种利用该高有效性、高通量模型作为针对CF定制的生物膜抗菌药物敏感性试验（AST）平台的操作方案，并展示了典型实验结果，表明病原菌在该模型中形成的生物膜对临床常用抗生素具有高度耐受性。该模型可便捷地整合到生物膜形成防控相关的研究与开发流程中，并有望应用于诊断性AST。所用的大多数设备（见材料表）在典型的微生物学实验室中均可常规获得，但需配备均质器（bead beater），且根据我们与合作者的经验，可能还需采购合适的紫外杀菌柜。由于肺组织来源于商业屠宰场或肉铺，该模型不存在伦理问题。
方案
本方案使用来自商业屠宰场的猪肺，该屠宰场提供供人类食用的肉类。根据英国法规，使用因肉类生产而屠宰的动物的剩余组织无需伦理审批；我们建议读者在开始工作前查阅当地相关法律法规及机构指南。
1. 合成囊性纤维化痰液培养基（SCFM）的制备
- 为用于EVPL组织的SCFM培养基配制，请遵循Palmer等人24所述配方，但需修改为去除配方中的葡萄糖。
注意：Palmer等人的配方包含游离氨基酸、阳离子、阴离子和乳酸，其浓度代表了囊性纤维化（CF）患者痰液样本中检测到的平均浓度。研究表明，该配方可诱导铜绿假单胞菌PA14（P. aeruginosa PA14）产生与在冻干患者痰液制备的培养基中相似的碳利用通路及群体感应信号表达24。1 L改良SCFM的配方见表S1。 - 配制完成后应立即对SCFM进行过滤除菌，并于4 °C保存，最长可保存1个月。
2. 离体猪肺（EVPL）组织的解剖与感染
- 解剖前，使用实验室中培养 P. aeruginosa/S. aureus 的标准琼脂（例如，LB 琼脂 + 1.2% 琼脂），制备所需细菌菌株的琼脂平板。
- 计算实验所需的猪支气管组织块数量，包括未感染的对照组织块。将此数量乘以 2，以便在两个重复肺组织中重复实验，以验证结果的可重复性。
- 将所需组织块的总数乘以 0.5，以确定所需 SCFM 琼脂糖溶液（mL）的体积，用于制备琼脂糖垫，确保每块组织有 400 µL 培养基，并额外预留 SCFM 琼脂糖以补偿移液误差或制备过程中的蒸发损失。
- 每 15 mL 所需 SCFM 中加入 0.12 g 琼脂糖，以配制含 0.8%（重量/体积）琼脂糖的所需总体积 SCFM 溶液。
- 加热 SCFM 琼脂糖溶液，直至琼脂糖完全溶解。建议使用低功率家用微波炉加热，具体时间取决于微波炉功率。待琼脂糖冷却至约 50 °C（手感温热但可安全持握），切勿进一步冷却。
- 使用移液器，为每个所需组织块向 24 孔板的一个孔中加入 400 µL SCFM 琼脂糖溶液。
- 将含 SCFM 琼脂糖的 24 孔板置于紫外线下灭菌 10 分钟。
- 为每例完整肺组织的解剖准备三份重复洗涤液，每份含 20 mL 无菌 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）和 20 mL 无菌 Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基，并补充 50 µg/mL 氨苄西林。
- 为每例完整肺组织的解剖准备一份 40 mL SCFM 作为最终洗涤液。所有洗涤液可于 4 °C 保存过夜，或立即使用。
- 屠宰后应尽快从指定来源获取肺组织，并通过家用冷藏箱运输至实验室以保持低温。
注：屠宰当天的肺组织因储存导致的瘀伤较少，但屠宰后冷藏保存不超过 4 天的组织也可使用。由于冷藏箱需带入屠宰场或肉店，每次使用后必须根据当地实验室指南进行去污处理，且不使用时应存放于微生物学实验室外，以降低污染风险和生物安全 containment 的破坏。 - 在灭菌台面并使用火焰保护下，将肺组织置于覆盖高压灭菌铝箔的洁净塑料砧板上。检查支气管是否保持完整。若在屠宰场或运输过程中造成损伤，则该肺组织不适用于实验。
- 将调色刀在火焰上加热，短暂接触支气管周围肺组织区域，以灭菌组织表面。
- 使用无菌固定剃刀片切除支气管周围的表面组织。切口应与支气管平行，以避免损伤。
- 暴露支气管后，在可见最高点处对支气管进行横切，以分离支气管。
- 使用无菌镊子轻轻夹住支气管游离端，用无菌固定剃刀片切除任何残留的多余组织。在支气管出现分支前进行最后一次横切，以将支气管从肺组织中完全分离。
- 将支气管放入第一份 DMEM/RPMI 1640 洗涤液中。保持在洗涤液中，并重复步骤 2.11–2.14，从同一肺组织中采集足够数量的支气管段，以满足计划实验所需的组织数量。
- 将同一肺组织的其他支气管段也放入洗涤液（步骤 2.16）中，至少静置洗涤 2 分钟。
- 从第一份 DMEM/RPMI 1640 洗涤液中取出支气管，转移至无菌培养皿中。
- 使用无菌镊子轻轻夹持每段支气管，避免损伤组织。尽可能去除残留软组织，并使用无菌解剖剪将组织切成约 5 mm 宽的条状。
- 将所有支气管组织条放入第二份 DMEM/RPMI 1640 洗涤液中，至少静置洗涤 2 分钟。
- 使用无菌镊子从第二份洗涤液中取出组织条，注意避免损伤组织。将组织转移至洁净无菌的培养皿中。
- 去除支气管上残留的软组织，并使用无菌解剖剪将组织条切成约 5 mm × 5 mm 的小方块。
- 向培养皿中加入第三份 DMEM/RPMI 1640 洗涤液，通过轻轻旋转培养皿使组织块在洗涤液中轻柔混匀。
- 将第三份洗涤液从培养皿中倒出，注意不要移走组织块。
- 向含组织的培养皿中加入最终的 SCFM 洗涤液，确保所有组织块均被覆盖。
- 将组织块在 SCFM 中置于紫外线下灭菌 5 分钟。
- 使用无菌镊子将每块灭菌后的支气管组织转移至含 SCFM 琼脂糖垫的 24 孔板的各个孔中。
- 为使每块组织感染目标细菌菌株，用连接于无菌 0.5 mL 胰岛素注射器的 29 G 针头尖端接触琼脂平板上的菌落，随后将针头轻触组织块表面，轻微刺破组织。
注：使用配备 29 G 针头的胰岛素注射器可精确且舒适地持握针头，同时使手指远离针头和肺组织。也可使用未连接注射器的 29 G 针头完成此步骤，但需要更高的操作技巧，并增加针刺伤风险。胰岛素注射器易于获取。 - 对于未感染的对照组，使用连接于无菌 0.5 mL 胰岛素注射器的 29 G 针头尖端轻轻刺破每块组织表面。
- 使用移液器向每孔加入 500 µL SCFM。
- 将每块 24 孔板的透气密封膜在紫外线下灭菌 10 分钟（材料表）。
- 取下 24 孔板的盖子，替换为已灭菌的透气密封膜。
- 将培养板置于 37 °C 恒温培养箱中，按所需时间静置培养（感染）。检查未感染对照组组织块上是否无接种病原体的可见生长（污染对照）。
注：如需要，可在步骤 2.5 的 SCFM 琼脂糖垫和步骤 2.30 的覆盖 SCFM 中加入氨苄西林，终浓度为 20 µg/mL。这可抑制肺组织上大多数内源性细菌的生长，而不影响 P. aeruginosa 或 S. aureus 的生长。但由于氨苄西林的存在可能影响对其他抗生素的敏感性，是否添加由使用者根据拟测试的菌株和抗生素自行决定。
3. 抗生素疗效的测定
注意：本实验步骤的示意图详见图S1。
- 为测定在EVPL上形成的生物膜对抗生素的耐受性，必须在解剖和感染过程中至少取自两个独立肺组织的肺组织样本进行平行设置。其中一组用于阴性对照（不加抗生素处理），每种待测抗生素浓度各需一组样本。
- 孵育48小时后，目视检查未感染的组织样本。猪肺内源性细菌可能已发生一定程度的生长，导致这些组织周围的SCFM变得浑浊。若观察到与所选研究菌种特征相符的生长现象（例如，P. aeruginosa特有的蓝绿色色素），则应使用新鲜肺组织重新开始实验。
- 若未感染的组织切片未见或仅有轻微细菌生长，则准备一个24孔清洗板和一个24孔处理板，每孔每块肺组织分别加入500 µL不含抗生素或含目标抗生素的新鲜SCFM。
- 用火焰灭菌的镊子将每块感染的组织从孵育板中取出，在清洗板的新鲜孔中轻轻振荡数秒，以去除未形成生物膜的游离细菌细胞，随后转移至处理板的相应孔中。
- 用新的透气膜密封处理板。
- 将处理板在37 °C条件下静置孵育18–24小时。
- 用火焰灭菌的镊子将每块肺组织从24孔板中取出，放入含有1 mL磷酸盐缓冲液（PBS）和1 g金属珠的无菌2 mL匀浆管中（材料表）。
- 以4 m/s速度振荡破碎40秒。
注意：根据材料表中推荐的珠子和匀浆仪进行珠磨处理不会引起细菌显著裂解，但各实验室在开展药敏试验（AST）前应验证其选用的珠子和匀浆仪对细菌的影响。 - 用PBS对肺组织匀浆液进行系列稀释，并接种于Luria肉汤（LB）琼脂平板，按照标准涂布方法测定各未处理及抗生素处理组织样本中的菌落形成单位（CFU）。
可选步骤：可在选择性培养基上制备双份平板以确认菌落身份；例如，使用甘露醇盐琼脂培养S. aureus。
结果
EVPL 模型提供了一个高通量的检测平台，使得能够一次性筛选大量细菌分离株对抗生素的敏感性（图 1 和 图 2），或在一次实验中筛选菌株对一系列抗生素浓度的反应（图 3）。经过实践，我们发现可在 2 小时内从肺组织中制备约 200 个细支气管组织切片。整个药敏试验（AST）可在正常工作时间内完成。在该模型中，Pseudomonas aeruginosa 和 Staphylococcus aureus 分离株的生长以及 48 小时生物膜的形成具有良好的可靠性，通过活菌计数监测时，可获得稳定的细菌载量（图 1 和 图 2）。在 EVPL 模型中培养的 Pseudomonas aeruginosa 和 Staphylococcus aureus 组织相关生物膜图像，以及用于光学显微镜观察和组织学染色的制备方案，可在我们的已发表文献中找到21,23。然而，不同细菌种类的菌落形成单位（CFU）计数的可重复性存在差异。该差异可通过方差分析（ANOVA）后的标准重复性计算进行量化25；我们发现，S. aureus 在重复肺组织样本中的 CFU 变异通常大于 P. aeruginosa。我们建议，当实验室首次采用该模型时，应通过对预实验进行重复性计算，以优化实验技术并确定最终实验所需的样本量（Sweeney 等人26 的数据补充材料中提供了示例）。
在EVPL中培养时，P. aeruginosa 和 S. aureus 的生物膜对抗生素的耐受性较标准行业认可的肉汤MIC（图1）及使用标准培养基的纸片扩散法检测中的敏感性显著增加（图2）。不同抗生素对EVPL中形成的生物膜具有可区分的作用效果，例如，在EVPL中，4–16×MIC浓度的环丙沙星可杀灭P. aeruginosa，而4–8×MIC浓度的氯霉素则不能（图1）。利奈唑胺每日两次、每次600 mg的给药方案可达到高于对敏感病原体MIC90（4 µg/mL）的血清浓度27，并被认为是在无不良副作用情况下的充分暴露剂量28。图2所示数据显示，对利奈唑胺在纸片扩散法中敏感的S. aureus种群，在EVPL中仍能在达到目标血清浓度甚至更高浓度（12 µg/mL）时存活。对于在EVPL中生长的P. aeruginosa生物膜，抗生素作用效果与MIC之间无明显相关性（图1）。获得更准确的体内抗生素耐受性评估至关重要，因为抗生素剂量不足可能会增加慢性感染中耐药菌株被选择出来的风险。
众所周知，生物膜生长模式可显著降低细菌对抗生素的敏感性。这促使了多种体外生物膜检测方法的开发以及最小生物膜清除浓度（MBEC）的应用14,15 而非 MIC，作为慢性感染中敏感性更准确的预测指标。此外，也建议使用 SCFM（不同配方）进行 MIC 或 MBEC 检测29在此，我们证明即使经过优化的体外实验也无法准确预测 P. aeruginosa EVPL中对多粘菌素的敏感性。实现3 log减少所需的抗生素量10 在EVPL中培养的细菌的杀灭效果通常显著高于根据标准体外实验（即使使用SCFM进行这些实验）计算出的MIC或MBEC，图3这与Cochrane综述的结论一致，该综述指出，与标准药敏试验相比，目前实施的体外生物膜药敏检测在囊性纤维化患者抗生素处方预测方面并未提供更高的预测能力。16.
使用该模型评估抗生素随时间对生物膜中细菌的影响也非常简便，因为可以接种足够数量的肺组织复制品，从而允许进行破坏性取样。除了能够区分不同抗菌药物之间的差异外，该模型还可揭示细菌在不同生长阶段或生物膜不同成熟度下，以及在不同抗生素给药间隔时敏感性的变化。图4展示了P. aeruginosa生物膜随着成熟度增加对美罗培南的耐受性逐渐增强。这一特性可用于评估新型药物的疗效，例如判断其是否在细胞快速分裂阶段更具作用效果。此外，在设计实验条件时，这一点也可能至关重要，因为有必要对生物膜的成熟度进行标准化和验证，以避免其年龄对实验结果产生影响。
在图5中，测定了S. aureus在暴露于氟氯西林后4 h和24 h的存活情况，可以观察到不同时间点及不同分离株之间细菌计数减少的差异。该结果可能对药物开发具有参考价值，例如在确定药代动力学和药效动力学参数，或阐明新型药物作用机制时。
随着培养时间的延长，细菌载量的差异通常会增加。这一点在图5的未处理对照组中可见，该组经历了48小时的生物膜形成以及额外24小时的抗生素给药间隔暴露。这种差异是模型本身的固有特性；每个肺组织样本相互独立，反映了肺组织自然存在的变异性。因此，必须确保包含足够数量的重复样本，以便对结果进行有效验证和准确解读。我们建议读者回顾我们之前提出的对数据进行重复计算的建议，以确定合适的样本量。
为简便起见，我们展示了从每次实验中单对肺脏获取的重复组织切片中选出的代表性数据，但实际上有必要对来自多个重复动物的组织切片进行重复实验。这是为了考虑个体猪之间可能存在的生物学差异，我们建议读者参考已发表的工作，了解来自重复猪只组织的结果之间的一致性程度，以及如何在数据分析的方差分析（ANOVA）/一般线性模型（GLM）统计分析中对这种变异进行校正21,26。
图111 CF 的总菌落形成单位（CFU） 铜绿假单胞菌 经抗生素处理后从EVPL模型中分离出的临床菌株。 抗生素治疗的代表性结果 P. aeruginosa 在EVPL模型中，每种菌株在EVPL组织上培养48小时后，转移至抗生素（三角形）或PBS作为对照（圆形）处理18小时，随后测定每肺组织的CFU。括号中所示为在标准阳离子调节MHB中测定的相应抗生素的MIC（位于每种菌株对应的x轴位置）。菌株按MIC值递增顺序排列。适当情况下采用t检验分析数据，非参数数据集则采用Mann-Whitney U检验。抗生素处理组与未处理组组织之间的显著差异以星号表示。P < 0.05). A. 回收的可存活菌落数量 P. aeruginosa 在EVPL模型中培养并经处理的生物膜 64 µg/mL 氯霉素（记录的最高 MIC 值）。针对每个分离株，使用 Cohen's 方法计算氯霉素处理与未处理组织切片之间 CFU 的标准化均值差 d. 标准测试中的 MIC 值与 EVPL 模型中活细胞数量减少之间不存在相关性，该结果由 Cohen's 法测定 d （斯皮尔曼等级相关系数，rs = 0.45, p = 0.16) B. 结果 P. aeruginosa 在EVPL模型中培养并经处理的生物膜 64 µg/mL 环丙沙星（记录的最高 MIC 值）。虚线以下的数值低于检测限。 请点击此处以查看该图的放大版本。
图2. 8 的总菌落形成单位（CFU） 金黄色葡萄球菌 经利奈唑胺处理后从EVPL模型中回收的囊性纤维化临床分离株。 每种菌株在EVPL组织上培养48小时后，转移至利奈唑胺（三角形）处理24小时，或不加处理作为对照（圆形）。根据EUCAST指南进行的标准纸片扩散法检测结果显示，所有菌株均对利奈唑胺敏感。30 抑菌圈 > 21 mm）。适当情况下使用 t 检验进行数据分析，非参数数据集则采用 Mann-Whitney U 检验（P < 0.05）。对于所有菌株，抗生素处理组与未处理组之间均未发现显著差异。虚线以下的数值低于检测限。 A. 结果 S. aureus EVPL 模型中经处理的生物膜 4 µg/mL 利奈唑胺（根据EUCAST分类的敏感/耐药临床折点）31). B. 实验结果 S. aureus EVPL 模型中经处理的生物膜 12 µg/mL 利奈唑胺（数据引自 Sweeney 等人）23). 请点击此处以查看此图的放大版本。
图3。实验室菌株PA14及4株来自EVPL模型的CF临床分离株在经不同浓度多粘菌素处理后，可存活的Pseudomonas aeruginosa菌落计数结果。每种菌株均在EVPL组织上培养48小时，随后暴露于多粘菌素中18小时。各菌株名称旁括号内所示为其在标准阳离子调节的MHB培养基中测定的MIC值。垂直线表示在MHB（实线）和SCFM（虚线）中测定的MBEC值，其中SED6菌株在两种培养基中的值相同。空心数据点代表与未处理样本（0 µg/mL 多粘菌素）相比，导致肺组织中CFU减少≥3-log10的最低多粘菌素测试浓度（数据引自Sweeney等26）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4。在 EVPL 模型上培养 24 小时后，Pseudomonas aeruginosa 活菌数量随时间变化的代表性结果，以及随后使用 64 µg/mL 美罗培南处理的效果。 实验室菌株 P. aeruginosa PA14 和 3 株囊性纤维化（CF）临床分离株在 EVPL 组织上按横轴所示时间培养后，转移至含美罗培南的环境（三角形）继续培养 24 小时，或不加处理作为对照（圆形）。随后测定每肺组织的菌落形成单位（CFU/lung）。各菌株名称旁括号内所示为其在阳离子调节的MHB培养基中测定的最低抑菌浓度（MIC）。请点击此处查看该图的高清版本。
图 5。在 EVPL 模型上生长后，经 5 µg/mL 氟氯西林处理 24 小时过程中金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的代表性活菌计数。 对照菌株 ATCC29213 及两株囊性纤维化（CF）临床分离株在 EVPL 组织上培养 48 小时后，转移至含氟氯西林的环境中（三角形）或不做处理作为对照（圆形），分别在 4 小时和 24 小时后测定每肺组织的菌落形成单位（CFU/lung）（数据引自 Sweeney 等人23）。 请点击此处查看该图的高清版本。
图 S1。 请点击此处下载该图。
表 S1. 请点击此处下载该表格。
讨论
离体肺模型具有高通量、低成本的优点，并且由于其使用肉类工业的消费后废弃物，不存在伦理问题。该模型旨在比目前可用的体外抗生素敏感性试验平台更准确地模拟慢性感染的人类囊性纤维化气道。本文展示的结果表明，在此类情况下，该模型可能更准确地预测抗生素敏感性。
确保结果可靠且可重复的关键步骤包括以下内容：
- 在屠宰、采集和处理肺组织样本的过程中，应采用一致的时间控制和储存方法。重要的是在屠宰后尽快使用肺组织，并尽可能减少污染风险。若肺组织不够新鲜，实验菌株在其中的生长能力可能下降，已有相关观察报道。
- 在SCFM制备和肺组织切片过程中保持无菌操作至关重要。健康肺组织本身并非无菌环境，因此共生菌的存在可能反映了慢性感染的“自然”状态。然而，如前所述，多物种菌群内部的细菌相互作用可能影响实验结果及对抗生素的敏感性，因此应尽量避免污染，并在使用前对肺组织进行灭菌处理。我们推荐使用紫外线灭菌，因其似乎不会破坏组织完整性；必要时可辅以额外的抗生素洗涤。但应谨慎使用抗生素，因其可能通过引入选择性压力而影响实验结果，并可能改变待测细菌群体的基因表达。
- 应使用模拟感染的阴性对照组织样本，并在非选择性富集培养基上培养细胞计数平板，以检测灭菌过程中未能清除的任何污染物或共生菌的生长。这对于降低这些细菌对药敏试验（AST）结果的干扰至关重要。同时，建议制备两份针对目标微生物的特异性选择性琼脂细胞计数平板，因为重复平板有助于加快菌落鉴定和细胞计数。
- 首次使用该模型或使用新的细菌菌株或基因型时，应开展预实验，以评估不同组织切片间生物膜CFU的变异情况，并通过功效分析确定最佳实验样本量（例如，从多少个重复肺组织中获取多少个重复组织切片）。
- 本实验采用非标准化的接种物，以便在培养48小时后快速接种，并形成相对一致的生物膜负荷（尤其是对于P. aeruginosa）。若需检测抗菌药物在生物膜早期生长阶段的效果，可考虑使用在ASM中悬浮的、标准化CFU的菌落培养细菌进行接种。我们不建议使用浮游态细菌接种：早期预实验表明，这会导致急性侵袭性生长，无法形成可靠的生物膜。
本方案为铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）的应用提供了一个可靠的原型模型，且在金黄色葡萄球菌（S. aureus）的应用方面具有较大的开发潜力，但该模型在某些应用场景下仍存在一些局限性，未来需加以解决。组织接种来源于单菌落，以促进克隆菌群的形成。结果显示，对于铜绿假单胞菌（P. aeruginosa），在48小时时对菌体数量影响较小。然而，金黄色葡萄球菌（S. aureus）的细菌载量表现出更大的变异性，鉴于不同细菌在该模型中的生长行为可能存在差异，标准化的初始接种量以及严格制备大小和重量一致的组织样本可能需根据所研究的生物体进行调整。此外，由于不同实验室在精确解剖/感染技术或所用猪的品种/地方品系方面可能存在差异，结果也可能有所不同。为评估该模型在不同实验实施中细菌种群的可重复性，我们建议在结果的统计分析中纳入重复性计算25，并基于预实验进行重复性/功效分析，以确定最终实验所需的最优样本量。
EVPL 相较于传统平板检测的一个关键优势在于，它并非检测浮游生长或在非生物表面生长的细菌，而是能够在宿主环境中实现细菌生物膜的空间结构构建，并支持细胞分化。这对于研究理化梯度和营养梯度对抗菌药物活性的影响具有重要意义，同时也适用于评估在慢性感染的不同微环境中活性治疗手段的递送与可及性，以及细菌之间的细胞间相互作用。后一点尤为重要，因为在囊性纤维化（CF）中经常观察到多菌种感染，且这类感染在与哮喘和慢性阻塞性肺疾病等其他呼吸系统疾病相关的感染中正变得越来越重要。该模型有望被开发用于临床诊断中个体化患者痰液样本的药敏试验（AST）。目前，已有类似试验正在进行，使用一种模拟伤口的体外模型来培养来自慢性伤口的清创生物膜并进行生长与药敏试验（美国德克萨斯州拉伯克市西南区域伤口护理中心，R. Wolcott 博士）。
此外，该模型使用的是死后组织，因此宿主免疫反应对抗生素敏感性的影响有限。目前的体外模型同样未考虑宿主免疫反应，因此我们并不认为这一点会成为该模型在未来应用于药敏试验（AST）的障碍。然而，在确定药代动力学和药效学参数以及抗生素给药指南时，会纳入对免疫反应的考量。尽管我们的研究已显示出组织内存在残余免疫细胞及免疫反应的证据23（以及 S. Azimi，个人交流），但如果希望该模型更贴近体内条件，则免疫反应的模拟仍是模型进一步优化和开发的重点方向。
为囊性纤维化提供更具临床有效性的药敏试验，将有助于满足英国《2008年健康与社会照护法案》的一项关键建议，即"应建立相关程序，以确保合理处方和抗菌药物管理"。我们认为，EVPL 是满足这一需求的理想候选模型。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢所有原始论文的共同作者，本文中的示例结果均来自他们的工作。本研究由英国医学研究理事会（MRC）新研究者研究基金（资助编号 MR/R001898/1）资助，该基金授予FH；NEH和IA获得了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）中部地区整合生物科学培训合作伙伴关系（MIBTP）的博士生奖学金；FA获得了华威大学本科生科研支持计划的资助，用于开展暑期科研项目。我们感谢史蒂夫·奎格利父子公司（位于沃里克郡卡本顿）和约翰·泰勒父子公司（位于考文垂厄尔斯登）提供肺组织样本。我们还要感谢华威大学生命科学学院媒体制备设施的支持，特别感谢Cerith Harries和Caroline Stewart，以及华威大学抗菌筛选设施的Anita Catherwood提供的帮助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.5 mL 胰岛素注射器，带 29G 针头 | |||
| 24孔培养板 | |||
| 70% 乙醇或类似的表面消毒剂，用于解剖器械的火焰灭菌 | |||
| 制备铜绿假单胞菌/金黄色葡萄球菌划线的琼脂平板（任何合适的培养基） | |||
| 琼脂糖 | |||
| 铝箔——经高压灭菌预消毒——用于覆盖解剖肺组织时所用的切板。 | |||
| 设计用于2 mL离心管的珠磨破碎仪 | MP Biomedicals | 116004500 | FastPrep-24 Classic 珠磨破碎仪与裂解系统 |
| 用于多孔板的Breathe-easy或Breathe-easier密封膜 | Diversified Biotech | BEM-1 或 BERM-2000 | |
| 本生灯 | |||
| 砧板——我们建议使用塑料砧板，以便用酒精轻松去污。 | |||
| 用于运输肺脏至实验室的冷藏箱 | |||
| 不同尺寸的解剖剪 | |||
| 杜尔贝科’DMEM（杜尔贝科改良伊格尔培养基） | |||
| Fisherbrand 2 mL 加强型离心管 | 赛默飞世尔科技 | 15545809 | |
| Fisherbrand 2.38 mm 金属珠 | 赛默飞世尔科技 | 15505809 | |
| 杀菌紫外线柜 | |||
| 胰岛素注射器 - 0.5 mL，配29G针头。 | VWR | BDAM324892 | |
| 大型刮刀 | |||
| 用于评估肺部生物膜匀浆中菌落形成单位（CFU）的LB琼脂平板 | |||
| 固定式剃须刀片 | |||
| Nalgene RapidFlow PES 75 mm x 0.1 µm × 500 ml 无菌滤器单元 | 赛默飞世尔科技 | 10474415 | 用于SCFM培养基的滤膜除菌 |
| 培养皿 | |||
| 磷酸盐缓冲液 | |||
| 塑料砧板和铝箔，用于创建无菌且可清洁的解剖操作面 | |||
| Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基 | |||
| SCFM 成分如表 S1 所列 | |||
| 镊子的选择（推荐使用钝头镊子） | |||
| 选择性琼脂平板，用于必要时特异性评估肺部生物膜匀浆中铜绿假单胞菌 / 金黄色葡萄球菌的菌落形成单位（CFU）。 | |||
| 根据您所在机构的健康规定，用于处置受污染的锐器和猪未成熟组织的合适容器 &和安全政策。 |
参考文献
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