小鼠肺部空气膨胀结合血管灌注固定

摘要

本文介绍一种通过空气膨胀结合血管灌注固定的肺组织固定方法，可保持气道、肺泡及间质内细胞的空间位置，适用于结构与功能分析。该方法利用空气膨胀装置维持恒定的气道压力，同时经由右心室灌注固定液，随后对肺组织进行组织学研究所需的处理。

摘要

肺组织学常用于研究气道细胞在肺稳态及疾病发生过程中的作用。然而，常用的灌注固定方法会将气道细胞和黏液冲入终末气道，从而改变组织形态。相比之下，血管灌注固定技术在保持气道内细胞位置和形态以及黏膜层结构方面更具优势。但是，如果未同时施加恒定的气道正压，肺部可能发生塌陷，毛细血管可能突入肺泡腔，导致肺解剖结构发生扭曲。本文介绍一种经济有效的方法，在血管灌注固定过程中通过气道充气，以维持小鼠肺组织中气道和肺泡细胞及其间质的形态与位置，便于后续组织学分析。该方法通过气管向肺部输送恒定气压，气源来自一个密闭的充气腔室，腔室内气压由可调节的液柱高度维持，同时将固定液经右心室进行灌注。

引言

肺组织学是评估健康和疾病状态下肺部结构的金标准，也是肺部研究人员最常用的工具之一¹。该技术最关键的环节之一是肺组织的正确分离与保存，因为此步骤的差异可能导致组织质量下降和结果错误^1,2,3。在活体动物中，肺容积由肺的向内弹性回缩力与胸壁及膈肌通过表面张力传递的向外作用力之间的平衡决定。因此，当打开胸腔时，向外的作用力消失，肺即发生塌陷。由塌陷肺组织制备的组织学切片呈现拥挤的形态，解剖结构之间（即气腔、血管系统和间质）的界限难以分辨。为克服这一难题，研究人员常在化学固定过程中对肺进行充气，以维持气腔大小和肺部结构。

肺可以用空气或液体充盈。由于气-液界面处的分子间作用力不同，用空气和液体充盈肺至相同体积所需的压力存在差异。与液体充盈（例如 12 cmH₂O）相比，空气充盈需要更高的压力（例如 25 cmH₂O）以克服表面张力并打开塌陷的肺泡⁴。一旦肺泡被充分招募，较低的压力即可维持肺泡开放至相同体积，此时压力-容积曲线趋于平台，根据帕斯卡定律，压力在肺内均匀分布^4,

方案

本方案中描述的所有方法均已获得国家犹太卫生研究院动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：该实验方案分为三个部分。第一部分详细介绍了充气-灌注/固定设备的构建。第二部分描述了实验前设备的安装与设置。最后一部分说明了动物的准备以及实验操作步骤。

1. 水柱装置的构建（图1B）

1. 从60 mL滑动接头注射器上取下活塞。
2. 在注射器30 mL刻度处缠绕胶带，将注射器高度设定在此标记处，以实现25 cmH₂O的初始充气压力。在整个操作过程中，该标记也应保持为柱内液面的高度。将胶带标记为"25 cm"（如图1A所示）或"充气"。
   注：采用25 cmH₂O的充气压力是为了确保塌陷的气道空间得以复张。一旦肺泡完成复张，压力将降低至20 cmH₂O，以避免气道过度扩张。
3. 从胶带处向活塞端方向量取5 cm，并在注射器上再缠绕另一段胶带。将注射器下移至该标记处，以便在固定过程中将充气压力降至20 cmH₂O。将此胶带标记为"20 cm"（如图1A所示....

结果

在完整的胸腔中，肺脏通过胸壁经胸膜腔施加的向外作用力而保持扩张状态^6,14。当解剖过程中切开膈肌时，胸膜腔的完整性被破坏，肺脏应发生塌陷（图2A、2B）。为了重新扩张肺脏，需进行通气充气。首先施加25 cm水柱压力，以确保塌陷的气道空间充分复张。因此，当打开动物固定容器外的三通阀时，空气将经气管进入肺内，此时可轻易观察到肺膨胀过程（图2C）。一旦肺完全扩张，即将充气压力降低至20 cm水柱压力（图2D）。选择20 cm水柱压力的原因在于其可维持肺脏完全扩张状态，同时避免气道空间过度膨胀。

气管结扎后（图3A）以及从胸腔取出后（图3B），肺.......

讨论

尽管气管内灌注固定法被普遍使用，但该方法会移位气道中的白细胞，并可能改变正常的肺部结构。本方案提供的经气道充气联合血管灌注固定的固定方法克服了这些缺陷，能够更准确地保存肺部解剖结构。要通过血管灌注固定法获得高质量的组织，关键在于仔细监测气道充气压力、避免漏气，以及确保固定液充分灌注至血管系统。

该操作的一个局限性在于，当胸腔完整性被破坏时，肺脏会塌陷，而塌陷后的肺脏需要重新充气，才能进行准确的组织学评估。一种可替代的方案是使用小型动物呼吸机，以在不引起肺塌陷的情况下维持肺膨胀。然而，此类设备通常较为昂贵，而本文所述方案则提供了一种经济的解决方法。在健康肺脏中，肺泡上皮细胞产生的表面活性物质有助于降低表面张力，大多数情况下肺脏可被轻易重新扩张。但在病变肺脏中，组织可能更为僵硬，且肺表面活性物质功能可能发生改变，从而促进肺塌陷。为减轻这一效应，可通过稍高的空气充气压力（例如 25 cmH₂O）“招募”塌陷区域⁵。随后可降低压力，使肺脏轻度回缩至生理大小。在我们的操作经验中，20 cm 水柱压力效果良好。过高的压力可能.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
00117XF-单通旋塞 M Luer，每包100个	Cole-Parmer	Mfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF	旋塞
BD 60 mL 注射器，滑动接头	BD	309654	用于构建水柱的注射器
BD PrecisionGlide 针头 25G × 5/8	BD Biosciences	305122	用于血管灌注/固定的针头
母Luer螺纹式面板安装 1/4-28 UNF 转公Luer	Nordson Medical	FTLLBMLRL-1	母Luer接头
来源于猪肠黏膜的肝素钠盐	Sigma-Aldrich	H3393	肝素溶液
BD Intramedic Luer-Stub接头，20号规格	BD Biosciences	427564	Luer-Stub接头
双公Luer转母Luer螺纹式三通接头	Nordson Medical	LT787-9	公Luer接头
Nalgene 180 透明塑料PVC管	ThermoFisher Scientific	8000-9020	管路
多聚甲醛水溶液 - 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	固定液。用磷酸盐缓冲液稀释至4%
Permatex Ultra Blue 多用途RTV硅胶密封胶	Permatex	81724	用于密闭腔室气密性密封的硅胶密封剂
磷酸盐缓冲液，1×，不含钙和镁	Corning	21-040-CV	用于构建气压膨胀腔室的瓶子，以及配制肝素和固定液的缓冲液
Sterilite Ultra Seal 16.0杯矩形食品储存盒	Sterilite	0342	动物处理容器