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方法文章

小鼠肺部空气膨胀结合血管灌注固定

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DOI：

10.3791/62215

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2021年2月2日

 ,  ,  , 
1Division of Pulmonary, Sleep and Critical Care Medicine, Department of Medicine, National Jewish Health, 2Section of Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition, Children's Hospital Colorado

本文内容

摘要

本文介绍一种通过空气膨胀结合血管灌注固定的肺组织固定方法，可保持气道、肺泡及间质内细胞的空间位置，适用于结构与功能分析。该方法利用空气膨胀装置维持恒定的气道压力，同时经由右心室灌注固定液，随后对肺组织进行组织学研究所需的处理。

摘要

肺组织学常用于研究气道细胞在肺稳态及疾病发生过程中的作用。然而，常用的灌注固定方法会将气道细胞和黏液冲入终末气道，从而改变组织形态。相比之下，血管灌注固定技术在保持气道内细胞位置和形态以及黏膜层结构方面更具优势。但是，如果未同时施加恒定的气道正压，肺部可能发生塌陷，毛细血管可能突入肺泡腔，导致肺解剖结构发生扭曲。本文介绍一种经济有效的方法，在血管灌注固定过程中通过气道充气，以维持小鼠肺组织中气道和肺泡细胞及其间质的形态与位置，便于后续组织学分析。该方法通过气管向肺部输送恒定气压，气源来自一个密闭的充气腔室，腔室内气压由可调节的液柱高度维持，同时将固定液经右心室进行灌注。

引言

肺组织学是评估健康和疾病状态下肺部结构的金标准，也是肺部研究人员最常用的工具之一1。该技术最关键的环节之一是肺组织的正确分离与保存，因为此步骤的差异可能导致组织质量下降和结果错误1,2,3。在活体动物中，肺容积由肺的向内弹性回缩力与胸壁及膈肌通过表面张力传递的向外作用力之间的平衡决定。因此，当打开胸腔时，向外的作用力消失，肺即发生塌陷。由塌陷肺组织制备的组织学切片呈现拥挤的形态，解剖结构之间（即气腔、血管系统和间质）的界限难以分辨。为克服这一难题，研究人员常在化学固定过程中对肺进行充气，以维持气腔大小和肺部结构。

肺可以用空气或液体充盈。由于气-液界面处的分子间作用力不同，用空气和液体充盈肺至相同体积所需的压力存在差异。与液体充盈（例如 12 cmH2O）相比，空气充盈需要更高的压力（例如 25 cmH2O）以克服表面张力并打开塌陷的肺泡4。一旦肺泡被充分招募，较低的压力即可维持肺泡开放至相同体积，此时压力-容积曲线趋于平台，根据帕斯卡定律，压力在肺内均匀分布4,5,6,7,8。

目前存在两种主要的小鼠肺组织固定与膨胀方法，用于组织学样本的保存。最常用的方法是向肺泡腔内灌注液体——通常含有固定剂。该方法的主要优点是操作相对简便，且无需过多培训。然而，在侧重于血管系统的研究中，尽管经气管灌注固定剂可能更受青睐，但经气管注入的液体会将近端气道的细胞和黏蛋白推入远端肺泡区域，而气体膨胀法则不会产生此类影响1,3,4,9,10,11。此外，在液体膨胀过程中，白细胞可能意外地从上皮脱落，导致其形态发生改变，人为呈现出简单、圆形的外观4,10,11,12。最后，液体膨胀肺组织还可能无意中压迫间质结构4,10,11。综上所述，这些因素可能导致保存后的肺组织中正常解剖结构和细胞分布发生扭曲，从而限制了该技术的应用。

一种可选的组织保存方法是血管灌注固定法。该方法通过下腔静脉或右心室将固定液灌注至肺血管系统。此方法可保存肺泡腔内细胞的位置和形态。然而，除非在灌注固定过程中使肺组织保持膨胀状态，否则肺组织很可能发生塌陷。

通过气道充气结合血管灌注固定的联合方法，综合了上述各种固定技术的优势。本文提供了该技术的详细操作方案。所需材料和设备相对便宜，易于获取和组装。如图1A所示，完成的装置通过可调节的液体填充柱为肺部提供恒定的气道压力，同时利用蠕动泵经由右心室输送固定液。经此处理后，肺组织形态得以良好保存，可进一步用于结构与功能的相关分析。

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方案

本方案中描述的所有方法均已获得国家犹太卫生研究院动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：该实验方案分为三个部分。第一部分详细介绍了充气-灌注/固定设备的构建。第二部分描述了实验前设备的安装与设置。最后一部分说明了动物的准备以及实验操作步骤。

1. 水柱装置的构建（图1B）

  1. 从60 mL滑动接头注射器上取下活塞。
  2. 在注射器30 mL刻度处缠绕胶带，将注射器高度设定在此标记处，以实现25 cmH2O的初始充气压力。在整个操作过程中，该标记也应保持为柱内液面的高度。将胶带标记为"25 cm"（如图1A所示）或"充气"。
    注：采用25 cmH2O的充气压力是为了确保塌陷的气道空间得以复张。一旦肺泡完成复张，压力将降低至20 cmH2O，以避免气道过度扩张。
  3. 从胶带处向活塞端方向量取5 cm，并在注射器上再缠绕另一段胶带。将注射器下移至该标记处，以便在固定过程中将充气压力降至20 cmH2O。将此胶带标记为"20 cm"（如图1A所示）或"固定"。
  4. 将一段180聚氯乙烯（PVC）管路连接至注射器的滑动接头端。管路长度应根据注射器与空气充气室之间的距离而定（约25–30 cm）。
  5. 将一个公端鲁尔（2）螺纹三通接头（长度1.219英寸，高度0.904英寸，内径0.0904英寸）插入管路的另一端。该公端鲁尔接头将连接至空气充气室的旋塞阀（步骤2.4）。

2. 气体膨胀室的构建（图1C）

  1. 在带有螺旋盖的500 mL塑料容器上钻两个孔（直径约4 mm），孔的尺寸应与雌性鲁尔接头（长度1.224英寸，高度0.312英寸，内径0.098英寸）相匹配。
    注意：可使用空的培养基或缓冲液容器作为充气室。
  2. 在雌性鲁尔接头的螺纹部分涂抹硅胶垫圈密封剂，并将较小的一端插入容器上预先钻好的孔中。
  3. 在雌性鲁尔接头进入容器的周围涂抹硅胶垫圈密封剂，以确保密封不漏气。
  4. 在充气室下方的雌性鲁尔接头上安装一个单向旋塞阀。
  5. 将管路剪成约25 cm长，并在管路两端连接雄性鲁尔接头。将管路一端的雄性鲁尔接头连接至充气室上未使用的雌性鲁尔接头，另一端的雄性鲁尔接头将连接至动物处理容器。

3. 动物处理容器的构建（图1D）

  1. 在大型塑料容器的侧面钻一个孔（直径约 4 mm），孔的直径应与雌性鲁尔接头（female Luer）相匹配。该塑料容器用于收集多余的固定液。
    注意：本实验使用了尺寸为 30 cm × 22 cm、容量为 3.8 L 的塑料储物盒。
  2. 在雌性鲁尔接头的螺纹部分涂抹硅胶垫圈密封剂，并将其较小的一端插入容器上预先钻好的孔中。
  3. 在雌性鲁尔接头穿过容器壁的内外两侧周围均涂抹硅胶垫圈密封剂，以确保形成气密性密封。
  4. 将一个单向止流阀拧紧在雌性鲁尔接头上。来自空气膨胀室的管路将连接至该止流阀。

4. 溶液的配制

  1. 肝素溶液
    1. 用无钙 PBS 和肝素（20 U/mL）填充容器。每只小鼠准备总共 10 mL 肝素溶液。肝素是一种抗凝剂，可在灌注固定过程中防止血管内形成血凝块。在灌注固定前，将使用肝素溶液冲洗肺部血液。
  2. 固定液
    警告：固定剂可能对健康造成危害，应在化学通风橱中使用。所有装置均设置在化学通风橱内，以避免吸入固定剂。
    1. 用无钙 PBS 和多聚甲醛（终浓度 4%）填充容器。每只小鼠准备总共 50 mL 固定液。
      ​注意：所用固定剂的类型可能有所不同，具体取决于后续组织学研究。

5. 灌注装置的制备

注意：建议使用蠕动泵将液体输送到血管系统，以确保恒定的流速。以下为蠕动泵的设置说明，不同型号的操作可能有所差异。若无蠕动泵，也可构建第二个水柱装置，通过35 cm H2O的高度进行液体灌注。

  1. 首先将管路绕在滚轮组件上。
  2. 将管路固定到带凹槽的固定柱上。
  3. 安装卡扣杠杆时，先将左侧杠杆套入管路，用顶部固定，再安装右侧杠杆并固定到位。
  4. 将管路的近端插入肝素溶液中，远端插入动物处理容器中。
  5. 启动泵以排出管路中的空气，将肝素溶液预充满管路。
  6. 在管路左侧末端安装一支 25G x 5/8" 针头。

6. 气体充盈装置的制备

  1. 将用于水柱的注射器放入铁环架中。
  2. 从动物平台到水柱上的"25 cm"胶带标记处（步骤1.2），测量出25 cm的垂直高度。
  3. 将水柱管的末端连接至气室的旋塞上。
  4. 将气室雌性鲁尔接头的管路连接至动物处理容器的旋塞上。
    注意：如果充气室的构造如图1C所示，反向连接管路可能导致水泄漏至连接气管插管的管路中。
  5. 确保气室的盖子已紧密关闭。
  6. 确保动物处理容器外侧的旋塞处于关闭状态，而连接水柱至充气室的管路上的旋塞处于打开状态。
  7. 将注射器注水至"25 cm"标记处。水将通过管路从注射器流入气室。当压力达到平衡后，水流将停止。
    1. 由于化学通风橱内环境气压的波动，水可能会缓慢渗入充气室。请密切关注注射器内的水位，必要时补充加水。在整个操作过程中，保持水位始终位于"25 cm"标记处。
      注意：通常在25 cmH2O气压充气的初始阶段，水位会保持稳定；但在固定过程中可能需要向注射器中添加更多水。如果水持续流动而不停止，可能是充气室内存在漏气。此时可能需要在鲁尔接头周围涂抹更多硅胶密封剂以防止漏气。

7. 动物准备（图2）

注意：本实验步骤已根据 Gage 等人的方法进行了修改13我们已在成年雄性个体中完成了该操作。 不同年龄的雌性小鼠，未观察到 年龄或性别偏倚

  1. 使用戊巴比妥钠（150 mg/kg，腹腔注射）处死动物。在开始解剖前，确保动物已死亡。
    注意：虽然本操作在已处死的动物上进行，但也可在活体动物上实施，以利用心脏泵送灌注液流经全身。
  2. 在腹壁两侧做两个侧向切口。第一个切口位于肋骨下方，第二个切口位于髋部上方。沿中线从下切口向上切口方向剪开。
  3. 使用钝头剪刀，小心地在膈肌侧面做一切口。一旦刺破膈肌，肺应立即塌陷。
    注意：必须小心避免刺破肺组织。若肺被刺破，则在后续步骤中较难充分膨胀。
  4. 沿膈肌横向剪开，以打开胸腔。
  5. 从剑突沿胸骨向上剪至颈静脉切迹，并在肋骨上方横向剪开，以完全暴露心脏和肺。将肋骨两侧固定于操作台。
  6. 在气管上方的颈部做一中线切口。去除覆盖的皮肤、肌肉、甲状腺及周围结缔组织，暴露气管。
  7. 使用弯头镊子，将两根缝线从气管后方穿过。其中一根用于固定充气用鲁尔接头，另一根则在完成肺充气和血管灌注固定后，用于结扎气管。
  8. 使用18G × 1" 针头或Vannas弹簧剪刀，在气管上刺一小孔。
  9. 将一个20G鲁尔接头插入气管上的小孔中。
  10. 在鲁尔接头插入部位远端的气管处，用一根缝线结扎固定接头。
  11. 将动物转移至动物处理容器中。
  12. 将鲁尔接头连接至动物处理容器内部的雌性鲁尔接口上。

8. 肺的空气灌注、灌流与固定（图2）

  1. 将25G × 5/8针头" 将连接至灌注装置管路的针头插入心脏右心室。
  2. 剪断腹主动脉，使血液从心脏流出，以促进灌注液流经肺部。
  3. 打开动物处理容器外侧的活塞以使肺部膨胀。
    注意：肺部完全膨胀可能需要一定时间。请观察注射器中的水位，除非肺部存在漏气，否则水位不应迅速下降。
  4. 在25 cmH₂O压力下使肺部膨胀2O 持续 5 分钟。以 25 cmH₂O 进行充气2O 可预处理肺部，并有助于复张肺不张区域。
    ​注意：可能需要向注射器中加入少量水以维持25 cm的高度。炎症和/或实验诱导的肺损伤可能影响肺的膨胀。在此情况下，可能需要将膨胀压力增加至最高35 cmH₂O。2以协助招募萎陷的肺区。
  5. 在肺膨胀的最后1分钟，打开蠕动泵，调节流速至10 mL/min。肝素溶液应从瓶中经导管流入动物体内。
    1. 肝素灌注的目的是防止血管内血栓形成。因此，持续灌注肝素直至肺组织变白且无血液残留。若肺组织未变白，可能需要调整右心室针头位置。
  6. 充气5分钟后，关闭蠕动泵，并将灌注管路从肝素溶液切换至固定液。
  7. 降低水柱注射器至 "20 cm" 在压力从25 cmH2O降至20 cmH2O的过程中，水柱内的气泡发生移动是正常现象（步骤1.3）。2O.
    1. 检查注射器中的液位，应处于 "25 cm" 标记。此时可能需要添加更多。
  8. 等待1分钟，使肺部压力从25 cmH₂O降至20 cmH₂O2O.
  9. 以6.5 mL/min的流速重新启动灌注泵。
  10. 血管灌注固定10至15分钟。

9. 肺脏的提取（图3）

  1. 在Luer接头远端的气管上用第二根线绳紧密结扎。将Luer接头从气管上移除。
  2. 从心脏中取出针头。
  3. 使用钝头剪刀剪断纵隔后方的结缔组织，从而将肺和心脏从胸腔中游离出来。注意避免刺破肺组织。
  4. 小心地将心脏从肺组织中分离出来。
  5. 将肺组织置于固定液中过夜。
    ​注意：固定时间的长短取决于后续组织学研究的具体要求。
    1. 将肺组织放入含有20–25 mL固定液的50 mL锥形管中。将固定气管的线绳穿过锥形管开口，并通过管盖螺纹固定。将锥形管倒置，以确保具有浮力且充气膨胀的肺组织完全浸没在固定液中，否则肺组织会浮至液面。
  6. 对肺组织进行组织学研究所需的后续处理。

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结果

在完整的胸腔中，肺脏通过胸壁经胸膜腔施加的向外作用力而保持扩张状态6,14。当解剖过程中切开膈肌时，胸膜腔的完整性被破坏，肺脏应发生塌陷（图2A、2B）。为了重新扩张肺脏，需进行通气充气。首先施加25 cm水柱压力，以确保塌陷的气道空间充分复张。因此，当打开动物固定容器外的三通阀时，空气将经气管进入肺内，此时可轻易观察到肺膨胀过程（图2C）。一旦肺完全扩张，即将充气压力降低至20 cm水柱压力（图2D）。选择20 cm水柱压力的原因在于其可维持肺脏完全扩张状态，同时避免气道空间过度膨胀。

气管结扎后（图3A）以及从胸腔取出后（图3B），肺...

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讨论

尽管气管内灌注固定法被普遍使用，但该方法会移位气道中的白细胞，并可能改变正常的肺部结构。本方案提供的经气道充气联合血管灌注固定的固定方法克服了这些缺陷，能够更准确地保存肺部解剖结构。要通过血管灌注固定法获得高质量的组织，关键在于仔细监测气道充气压力、避免漏气，以及确保固定液充分灌注至血管系统。

该操作的一个局限性在于，当胸腔完整性被破坏时，肺脏会塌陷，而塌陷后的肺脏需要重新充气，才能进行准确的组织学评估。一种可替代的方案是使用小型动物呼吸机，以在不引起肺塌陷的情况下维持肺膨胀。然而，此类设备通常较为昂贵，而本文所述方案则提供了一种经济的解决方法。在健康肺脏中，肺泡上皮细胞产生的表面活性物质有助于降低表面张力，大多数情况下肺脏可被轻易重新扩张。但在病变肺脏中，组织可能更为僵硬，且肺表面活性物质功能可能发生改变，从而促进肺塌陷。为减轻这一效应，可通过稍高的空气充气压力（例如 25 cmH2O）“招募”塌陷区域5。随后可降低压力，使肺脏轻度回缩至生理大小。在我们的操作经验中，20 cm 水柱压力效果良好。过高的压力可能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家心肺血液研究所（NHLBI）资助，资助编号为 HL140039 和 HL130938。作者感谢 Shannon Hott 和 Jazalle McClendon 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
00117XF-单通旋塞 M Luer，每包100个Cole-ParmerMfr # VPB1000050N – Item # EW-00117-XF旋塞
BD 60 mL 注射器，滑动接头BD309654用于构建水柱的注射器
BD PrecisionGlide 针头 25G × 5/8BD Biosciences305122用于血管灌注/固定的针头
母Luer螺纹式面板安装 1/4-28 UNF 转公LuerNordson MedicalFTLLBMLRL-1母Luer接头
来源于猪肠黏膜的肝素钠盐Sigma-AldrichH3393肝素溶液
BD Intramedic Luer-Stub接头，20号规格BD Biosciences427564Luer-Stub接头
双公Luer转母Luer螺纹式三通接头Nordson MedicalLT787-9公Luer接头
Nalgene 180 透明塑料PVC管ThermoFisher Scientific8000-9020管路
多聚甲醛水溶液 - 32%Electron Microscopy Sciences15714-S固定液。用磷酸盐缓冲液稀释至4%
Permatex Ultra Blue 多用途RTV硅胶密封胶Permatex81724用于密闭腔室气密性密封的硅胶密封剂
磷酸盐缓冲液，1×，不含钙和镁Corning21-040-CV用于构建气压膨胀腔室的瓶子，以及配制肝素和固定液的缓冲液
Sterilite Ultra Seal 16.0杯矩形食品储存盒Sterilite0342动物处理容器

参考文献

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