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方法文章

通过暂时性双侧肾动脉阻断建立急性肾损伤的大动物模型

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DOI：

10.3791/62230

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2021年2月2日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School

本文内容

摘要

本研究介绍了一种高度可重复的猪肾缺血-再灌注损伤大动物模型，通过经皮双侧肾动脉球囊导管临时阻断60分钟，随后再灌注24小时建立。

摘要

急性肾损伤（AKI）与术后较高的发病率和死亡率风险相关。缺血-再灌注损伤（IRI）是导致AKI最常见的原因。为了模拟这一临床情况，本研究提出了一种高度可重复的大型动物模型，通过经皮暂时性双侧肾动脉球囊导管阻断在猪体内建立肾IRI模型。将球囊导管经股动脉和颈动脉插入并推进至肾动脉近端，实现60分钟的肾动脉阻断。通过向主动脉注射碘化对比剂，评估肾脏血管是否显影，以确认动脉阻断成功；此外，还可通过球囊导管尖端脉搏波形变平来进一步验证阻断效果。双侧肾动脉阻断60分钟后，放气并移除球囊导管，动物恢复24小时。研究结束时，血浆肌酐和血尿素氮显著升高，而估算的肾小球滤过率（eGFR）和尿量显著降低。该模型所需碘化对比剂用量极少，不影响肾功能。双侧肾动脉阻断能更真实地模拟围手术期肾脏低灌注的临床情况，而经皮入路可最大程度减少炎症反应的影响以及开放手术（如剖腹手术）常见的感染风险。该临床相关猪模型的建立与可重复性，有助于向人类临床应用的转化研究。

引言

急性肾损伤（AKI）是外科患者中一种常见的诊断状况，与较高的发病率和死亡率相关1,2。现有数据显示，全球住院患者中甚至有一半可能受到AKI影响，且在重症监护病房患者中的死亡率高达50%1,3。尽管AKI发病率很高，目前的治疗手段仍局限于预防性策略，例如液体管理和透析。因此，探索AKI的替代疗法一直是研究热点4,5,6。

根据病因，急性肾损伤（AKI）通常分为肾前性、肾性和肾后性三类4,5,6。大多数外科手术患者的AKI与肾前性因素相关，主要由低血容量引起，导致肾脏发生缺血-再灌注损伤（IRI）2。临床上表现为尿量减少以及因肾功能下降导致的肌酐水平升高。肾脏是一个高代谢器官，对缺血非常敏感。为了更深入地了解AKI的病理生理机制及其潜在的治疗策略，建立一种高度可重复的大型动物肾IRI模型十分必要5。

为了模拟围手术期肾脏低灌注的临床情况，双侧肾动脉阻断模型被认为较为合适。既往描述的单侧肾动脉阻断模型，无论是否联合对侧肾脏切除，其临床适用性均不足7,8。尽管这些模型足以诱发急性肾损伤（AKI），但在损伤类型和持续时间方面，均无法真实反映临床实际情况。

本文旨在介绍一种在血管造影引导下，通过球囊导管经皮双侧暂时性阻断肾动脉的猪模型。双侧肾动脉阻断可模拟临床肾低灌注情况，随后撤除球囊以实现再灌注9,10。文中详细描述了相关技术步骤，包括导管插入、导管引导、血管造影以及血流动力学监测。该方法不仅能够实现对肾动脉阻断的高度可控性和可重复性，而且经皮入路相比开放手术方式，可减少对机体的损伤程度，从而最大限度地降低炎症反应的影响。

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方案

所有体内研究均按照美国国立卫生研究院关于动物护理和使用的指南进行，并经波士顿儿童医院动物护理和使用委员会批准（方案编号 18-06-3715）。所有动物的饲养和实验均符合《实验动物护理和使用指南》的要求。图1展示了本研究的时间线，包括麻醉、手术准备以及主要结局指标测量的时间点。

1. 诱导、麻醉与插管

  1. 为避免不必要的应激和不适，通过肌内注射给予猪混合药物（替来他明/唑拉西泮 4-6 mg/kg 和赛拉嗪 1.1-2.2 mg/kg），同时使用面罩吸入 3% 异氟烷进行镇静。
  2. 用 95% 乙醇对耳部区域消毒后，穿刺耳缘静脉并置入 20 G 静脉套管针以建立静脉通路。开始维持性输液（0.9% NaCl，5 mL/kg/h）。
  3. 确认麻醉效果充分后，使用气管导管（体重 40-50 kg 的猪选用 7 号导管）进行气管插管。以每分钟 12 次呼吸的频率进行球囊通气，并将猪转运至手术室。
  4. 将动物仰卧位置于手术台上。立即开始机械正压通气，吸入氧浓度（FiO2）为 0.50，潮气量为 10 mL/kg，呼吸频率为每分钟 12 次，并持续进行呼气末二氧化碳监测（capnography）。
  5. 将脉搏血氧仪传感器置于耳部或下唇底部，用于持续监测。
  6. 使用空气加温垫维持正常体温（37 °C）。
  7. 为维持全身麻醉状态，通过气管导管持续给予 0.5-4% 异氟烷。在整个操作过程中，持续监测心电图（ECG）、动脉血压、体温和呼气末二氧化碳，以评估麻醉深度。
  8. 插入 Foley 导尿管以评估动物的体液状态，并通过引流袋收集尿液来监测尿量。
    ​注意：由于雌性猪的尿道解剖结构更便于导尿，因此优先选用雌性猪。

2. 外科准备与血管通路

  1. 以无菌方式覆盖动物。
  2. 用碘伏和95%乙醇对颈部右侧区域进行三次消毒。
  3. 切开暴露以进行右侧颈总动脉和右侧颈外静脉插管。将胸锁乳突肌向外牵拉，并分离至右侧颈总动脉和右侧颈外静脉。
  4. 在动脉和静脉中均插入5F血管造影鞘管，并用2-0丝线固定。
  5. 采用Seldinger技术将5F血管造影鞘管插入左侧股动脉。
    1. 采用Seldinger技术时，使用空心针穿刺股动脉，经针腔插入带软头的导丝，并将其推进至股动脉内。
    2. 用手固定导丝，同时撤出穿刺针。沿导丝将血管造影鞘管送入股动脉，然后撤出导丝。必要时可使用超声引导。

3. 肾缺血-再灌注损伤的诱导

  1. 静脉注射肝素钠 200 IU/kg，以实现全身抗凝（目标活化凝血时间 (ACT) > 300 秒）。
  2. 在透视引导下注射碘化对比剂进行血管造影，以识别肾动脉。
    注意：为降低对比剂诱导的肾毒性风险，将碘化对比剂与生理盐水按 1:1 比例稀释。记录所有动物的给药剂量，以确保剂量一致。
  3. 识别肾动脉，手动将导丝推进至引导导管中。
  4. 通过右侧颈动脉将 5F JL4 引导导管置于左肾动脉内（图 1A）。
  5. 通过左侧股动脉将第二个 5F JL4 引导导管置于右肾动脉内（图 1A）。
  6. 使用导丝引导 5F 经皮腔内血管成形术 (PTA) 扩张导管进入每侧肾动脉。
    注意：最好将球囊置于肾动脉近端，以便在球囊扩张后不会遗留任何肾动脉分支或侧支保持开放。
  7. 将每个球囊导管就位，并将压力管连接至每个导管。
  8. 检查压力监测仪上是否存在动脉脉搏波形，以确认导管位置正确。
  9. 充盈每个球囊，目标球囊内压力约为 2.5 atm（图 1B）。
  10. 通过观察球囊导管尖端脉搏波形变平，确认肾脏血流停止。
  11. 注射碘化对比剂（1:1 稀释），检查肾血管是否显影。
    注意：也可将碘化对比剂注入球囊内以显示充盈后的球囊形态。然而，该方法在确认肾动脉闭塞方面不如脉搏波形变平敏感。
  12. 缺血 60 分钟后，小心放气并从肾动脉中移除球囊导管。
  13. 进行血管造影（使用 1:1 稀释的对比剂），确认肾动脉通畅及肾再灌注建立（图 1C）。
  14. 从左股动脉移除 5F 血管造影鞘管。
  15. 在穿刺部位施加牢固压力 30 分钟。
  16. 通过给予鱼精蛋白（3 mg/kg）逆转肝素作用，直至 ACT 恢复正常。
  17. 为在术后期间采集尿液，使用 2-0 丝线间断缝合将导管固定于弗利导尿管，并缝合于皮肤上。
  18. 将血管造影鞘管保留在右侧颈动脉和右侧颈静脉内，并使用 2-0 丝线间断缝合固定，以便在整个研究期间进行血液采样。
  19. 使用 2-0 丝线连续缝合分两层缝合颈部切口。
  20. 在切口部位注射布比卡因（3 mg/kg）以减轻疼痛。
  21. 缺血结束后继续以 0.9% NaCl 溶液按 5 mL/kg/h 的速度对动物进行补液，共持续 2 小时。
  22. 将芬太尼贴剂（25–50 µg/h）贴于动物背部，以减轻术后疼痛。
  23. 肌肉注射布伦诺啡（0.005–0.1 mg/kg）以减轻术后疼痛。
  24. 监测动物状态，并维持机械通气直至动物苏醒。

4. 动物恢复

  1. 苏醒后，将动物安置于温度可控的房间内。
  2. 持续将动物从一侧向另一侧翻转，直至其完全恢复意识并具备自主活动能力。
  3. 自由提供水和食物。

5. 功能评估

  1. 根据所需方案采集血液和尿液样本。
    注意：本研究中设定以下时间点：基线（开始水化方案后1小时且肾动脉阻断前）、缺血结束时以及再灌注时（2小时、6小时、24小时）。
  2. 采集动脉和静脉血样本，储存于含锂肝素或EDTA涂层的真空采血管中，用于后续分析。
    注意：直接从颈动脉和颈外静脉的导管中抽取血液。
  3. 从 Foley 导尿管收集尿液样本，并将其储存于15 mL离心管中用于分析。
    注意：从连接于 Foley 导尿管的引流袋中收集尿液。
  4. 为测定尿量，清空引流袋并收集1小时内的尿液。
    注意：在6小时时间点，若未连接引流袋，则关闭连接 Foley 导尿管的管路30分钟，随后使用60 mL注射器收集尿液以测定尿量。

6. 安乐死

  1. 再灌注期结束后，按照上述方法进行麻醉并实施监测。
  2. 继续以每小时每千克体重5 mL的速度输注0.9%氯化钠溶液以维持水化。
  3. 利用动脉和静脉导管采集血液样本，并通过导尿管测定尿量。收集最终的血液和尿液样本，并计算尿量。
  4. 使用10号刀片从剑突向下至骨盆中部做一条15厘米长的正中腹腔切口。
  5. 使用直型侧向拉钩牵开腹壁皮肤。
  6. 解剖腹壁侧方的腹膜附着结构，以暴露右侧和左侧腹膜后间隙。
  7. 辨认并钝性分离双侧肾动脉和肾静脉。
  8. 使用2-0丝线结扎双侧肾动脉和肾静脉，并行双侧肾切除术，完整获取组织标本用于组织学和代谢分析。
  9. 采用首选的安乐死方法（如放血法、戊巴比妥钠）处死动物。

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结果

功能分析
本研究的代表性结果来自6只动物，所展示的数据以均值±均值标准误表示。通过测定尿量、估算肾小球滤过率（eGFR）、血浆肌酸酐和血尿素氮（BUN）来评估肾功能。肾功能生物标志物采用便携式化学分析仪进行检测。eGFR根据以下公式计算：eGFR =1.879 × BW1.092/PCr0.6 （BW：体重，单位为kg；PCr：血浆肌酸酐，单位为mg/dL）10,11。

双侧肾动脉阻断60分钟后，尿量从基线时的3.6 mL/kg/h ± 0.5 mL/kg/h显著下降至0.2 mL/kg/h ± 0.1 mL/kg/h（p < 0.01）。再灌注后6小时（1.2 mL/kg/h ± 0.1 mL/kg/h；p = 0.02 vs. 基线）和24小时（1.3 mL/kg/h ± 0.4 mL/kg/h；p = 0.02 vs. 基线）...

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讨论

急性肾损伤（AKI）是一种常见的临床疾病，全球高达50%的住院成人患者受其影响6,12。为了进一步研究该疾病的病理生理机制及潜在治疗靶点，亟需一种具有临床相关性的动物模型。尽管目前已有一些模拟AKI的小鼠模型，但这些模型并不能完全复制相应的临床情况，也无法充分反映人类肾脏的解剖结构。本研究提出一种具有临床相关性的猪模型，以促进向人类临床应用的转化13。

本方案描述了一种经皮穿刺方法，该方法不仅具有临床相关性，而且与开放性方法相比，可最大限度地减少炎症反应及感染风险。还应强调的是，所有动物均应采用一致的水化方案，以实现最佳的血流动力学控制，并避免肾灌注不足11。在动物处于麻醉状态时，这一水化过程易于实施；但在恢复期，当饮水为自由摄取时，往往无法准确控制水化程度。

应谨慎使用含碘造影剂，以避免造影剂引起的肾毒性。可通过与...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

我们感谢 Arthur Nedder 博士提供的帮助与指导。本工作由 Richard A. 和 Susan F. Smith 总统创新奖、Michael B. Klein 及其家族、Sidman 家族基金会、Michael B. Rukin 慈善基金会、Kenneth C. Griffin 慈善研究基金以及波士顿投资委员会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.9% 氯化钠注射液，USP，100 ml Viaflex 塑料容器Baxter2B1302用于动物补水
造影剂 100.0ml 注射液，瓶装碘佛醇 74%CARDINAL HEALTH133311用于血管系统显影
Bard Bardia 封闭式尿液引流袋BARD Inc802001用于尿液收集
BD Vacutainer K2 EDTABD367841用于血液样本储存
BD Vacutainer 锂盐肝素BD366667用于血液样本储存
聚维酮碘（Betadine）Henry Schein6906950用于皮肤消毒
Bookwalker 牵开器Codman用于皮肤牵拉
布比卡因 0.25%Hospira在切口部位给药以提供镇痛
缓释型丁丙诺啡（Buprenorphine SR）Zoo Pharm10mg/ml 瓶装，剂量：0.2mg/kg 皮下注射
导管，血管造影用 5.0 Fr × 100.0 cm，0.038 英寸 JR4MERIT MEDICAL SYSTEM INC7523-21用于识别肾动脉
带套囊气管插管Emdamed在手术期间建立可靠的气道
EKG Medtronics-Physiocontrol LifePak 20 血氧饱和度监测仪GE Healthcare Madison WI用于血氧饱和度监测
Encore 26 注射器BOSTON SCIENTIFIC710113用于充盈球囊导管
乙醇 95%（乙基酒精）Henry Schein用于皮肤消毒
芬太尼透皮贴剂Mylan剂量：25–50 mcg/hr，经皮给药（TD）
金硅涂层 Foley 导尿管TELEFLEX MEDICAL INC180730160用于尿液收集
肝素钠LEO Pharma A/S剂量：200 IU/kg 静脉注射
i33 超声设备Phillips必要时用于股动脉插管的超声引导
Inqwire 诊断用导丝 - 0.035" (0.89 mm) - 260 cm (102") - 1.5 mm J 型头端MERIT MEDICAL SYSTEM INC6609-33用于引导球囊导管至肾动脉
静脉导管，20 号规格Santa Cruz BiotechnologyInc SC-360097用于液体输注
异氟烷Patterson Veterinary Supply, Inc.21283620剂量：3%，吸入给药（INH）
Metzenbaum 钝头弯剪，14.5 cm - 5(3/4)"Rudolf MedicalRU-1311-14M用于组织分离和切割
新生儿一次性压力传感器套件，含 30ml/hr 冲洗装置及双四通旋塞，用于连续监测Argon Medical041588505A用于压力测量
Powerflex pro PTA 扩张导管 6 × 20 mm - 轴长 (135cm)CARDINAL HEALTH4400602X用于肾动脉闭塞
压力监测管路 mll/mll - 12" 透明，mll/mllSmiths MedicalB1571/MX571用于压力测量
手术包Molnlycke Health Care97027809手术单、纱布垫、注射器、烧杯等
鱼精蛋白Henry Schein1044148用于逆转肝素作用
手术刀片 - 10 号规格Cardinal Health (Allegiance)32295-010用于皮肤切口
四通旋塞，大孔径，旋转式，带直型公接头，无菌Peoplesoft1550用于连接管路
直型侧向牵开器Codman用于皮肤牵拉
缝线，Perma HND，18 英寸，2-0 编织黑丝线CARDINAL HEALTH 1A185H用于缝合切口及固定导管
造影剂注射器，10ml，固定式公鲁尔接头，红色MERIT MEDICAL SYSTEM INCMSS111-R用于给予造影剂
医用注射器，60ml，低死腔，塑料，无菌，无乳胶，一次性使用CARDINAL HEALTH 1BF309653用于尿液收集及冲洗血管导管
Tilzolan（替来他明/唑拉西泮）Patterson Veterinary Supply, Inc.07-893-1467剂量：4–6 mg/kg，肌内注射（IM）
赛拉嗪（Xylazine）Putney, INC剂量：1.1–2.2 mg/kg，肌内注射（IM）

参考文献

  1. Ali Pour, P., Kenney, M. C., Kheradvar, A. Bioenergetics consequences of mitochondrial transplantation in cardiomyocytes. Journal of the American Heart Association. 9 (7), 014501(2020).
  2. Giraud, S., Favreau, F., Chatauret, N., Thuillier, R., Maiga, S., Hauet, T. Contribution of large pig for renal ischemia-reperfusion and transplantation studies: The Preclinical Model. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 14(2011).
  3. Amdisen, C., et al. Testing Danegaptide effects on kidney function after ischemia/reperfusion injury in a new porcine two week model. PLoS ONE. 11 (10), 1-13 (2016).
  4. Bhargava, P., Schnellmann, R. G. Mitochondrial energetics in the kidney. Nature Reviews Nephrology. 13 (10), 629-646 (2017).
  5. Bonventre, J. V., Weinberg, J. M. Recent advances in the pathophysiology of ischemic acute renal failure. Journal of the American Society of Nephrology. 14 (8), 2199-2210 (2003).
  6. Case, J., Khan, S., Khalid, R., Khan, A. Epidemiology of Acute Kidney Injury in the Intensive Care Unit. Critical Care Research and Practice. 2013, 9(2013).
  7. Jabbari, H., et al. Mitochondrial transplantation ameliorates ischemia/reperfusion-induced kidney injury in rat. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1866 (8), 165809(2020).
  8. Malagrino, P. A., et al. Catheter-based induction of renal ischemia/reperfusion in swine: Description of an experimental model. Physiological Reports. 2 (9), 1-13 (2014).
  9. Freeman, R. V., et al. Nephropathy requiring dialysis after percutaneous coronary intervention and the critical role of an adjusted contrast dose. American Journal of Cardiology. 90 (10), 1068-1073 (2002).
  10. Gasthuys, E., et al. Postnatal maturation of the glomerular filtration rate in conventional growing piglets as potential juvenile animal model for preclinical pharmaceutical research. Frontiers in Pharmacology. 8 (431), 1-7 (2017).
  11. Doulamis, I. P., et al. Mitochondrial transplantation by intra-arterial injection for acute kidney injury. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 319 (3), 403-413 (2020).
  12. Rewa, O., Bagshaw, S. M. Acute kidney injury-epidemiology, outcomes and economics. Nature Reviews Nephrology. 10 (4), 193-207 (2014).
  13. Grossini, E., et al. Levosimendan Protection against Kidney Ischemia/Reperfusion Injuries in Anesthetized Pigs. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 342 (2), 376-388 (2012).
  14. Laskey, W. K., et al. Volume-to-creatinine clearance ratio. A pharmacokinetically based risk factor for prediction of early creatinine increase after percutaneous coronary intervention. Journal of the American College of Cardiology. 50 (7), 584-590 (2007).

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