方法文章

利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性

7.6K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62235

⸱

2022年2月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physical Sciences Platform, Sunnybrook Research Institute, 2Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto, 3Department of Physics, Norwegian University of Science and Technology, 4Department of Clinical Medicine, University of Bergen, 5Exact Therapeutics AS, 6Department of Medical Biophysics, University of Toronto

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了实现实时观察所需的手术与技术操作步骤 体内 利用聚焦超声联合微泡处理增强血脑屏障通透性期间对啮齿类动物大脑进行多光子荧光成像

摘要

血脑屏障（BBB）是药物成功递送至大脑的主要挑战之一。在微泡存在的情况下应用超声波，已成为一种有效的方法，可短暂且局部地增加血脑屏障的通透性，促进药物通过旁细胞和跨细胞途径穿越血脑屏障。在超声-微泡治疗期间对血管系统进行成像，将为超声-微泡治疗在脑内的作用机制与动态过程提供有价值且新颖的见解。

本文介绍了一种利用颅窗结合环形换能器和20倍物镜进行活体多光子显微成像的实验方法。该装置可在超声-微泡治疗期间实现对大脑的高空间和时间分辨率成像。通过开颅式颅窗获得对大脑的光学通路。简言之，移除直径3–4 mm的颅骨区域，暴露的脑组织以玻璃盖玻片密封。一个0.82 MHz的环形换能器固定在另一块玻璃盖玻片上，并安装于其上方。在换能器盖玻片与覆盖颅窗的盖玻片之间使用1%（w/v）琼脂糖，以避免产生气泡，从而防止超声传播受阻。若遵循无菌手术操作并采取抗炎措施，可在数周内重复进行超声-微泡治疗及成像。通过静脉注射荧光标记的葡聚糖偶联物，用于可视化血管系统并量化超声-微泡诱导的效应（如渗漏动力学、血管变化）。本文详细描述了颅窗的制备、环形换能器的安装、成像流程、常见问题的排查方法，以及该技术的优势与局限性。

引言

治疗神经系统疾病的一个关键挑战是血脑屏障（BBB）的存在。BBB 限制了亲水性、带电、极性以及大分子量（> 400 Da）的物质进入脑实质1。目前用于将治疗药物递送穿过 BBB 进入脑实质的一种方法是使用立体定向颅内注射2。其他正在研究中的侵入性较小的方法，受限于所用技术的复杂性，例如设计用于通过受体介导机制穿越 BBB 的药物3，或在靶向区域的空间精度上存在局限，例如鼻内注射4或高渗溶液给药5。

将超声与静脉注射的微泡（一种超声造影剂）联合使用，已发展为一种非侵入性手段，可暂时增加血脑屏障（BBB）的通透性6。通过使用聚焦换能器7或可操控的换能器相控阵列8,9，可将超声精确靶向至脑内特定区域，精度达毫米级别，从而最大限度减少脱靶效应。通过磁共振成像引导7,10,11,12,13,14或立体定向框架15，可针对每个受试者的脑部解剖结构定制超声-微泡治疗方案。此外，通过实时监测微泡产生的声学信号，可对血脑屏障通透性增加的程度进行实时调控16,17,18。目前，全球范围内正在进行多项临床试验，以评估超声-微泡治疗的安全性和可行性（例如，ClinicalTrials.gov 注册号 NCT04118764）。

超声-微泡血脑屏障处理通常通过确认处理引起的血脑屏障通透性增加来评估，可在增强磁共振成像中观察到对比剂渗漏，或通过染料外渗进行评估 体内 成像或 离体 组织学。然而，大多数显微分析已经完成 离体超声微泡治疗完成后11,19，从而遗漏了超声暴露期间及暴露后即刻的动态生物学响应。在超声暴露过程中进行实时成像，有助于阐明超声-微泡介导的血脑屏障开放治疗的驱动机制及其后续响应，进而加深对其治疗应用的理解。此外，结合慢性颅窗的使用， 体内 成像技术将能够实现纵向研究，以评估超声-微泡治疗的时间效应。

本方案旨在描述在啮齿类动物中进行超声-微泡治疗实时多光子成像所需的手术及技术操作流程（图1）。该流程分为两个部分：首先，制备颅窗以实现in vivo成像；其次，在颅骨顶部安装环形换能器，以实现同步超声辐照与成像。神经科学家已广泛使用颅窗技术进行in vivo神经血管耦合20、β-淀粉样蛋白病理发生21以及神经免疫学22等方面的研究。本方案中详细描述了在小鼠和大鼠颅骨上制备急性（非恢复型）和慢性（恢复型）颅窗的手术操作。特别是针对慢性实验的颅窗制备方法，已有充分文献记录23,24,25。为与现有文献保持一致，本方案将始终采用“急性”和“慢性”这两个术语。用于in vivo成像的环形换能器设计此前也已有报道26。尽管这些技术已可获取，并且实时成像超声-微泡治疗能够提供重要研究信息，但目前成功发表使用该技术文献的研究实验室仍极为有限26,27,28,29,30,31,32。因此，本方案系统阐述了开展此类实时超声-微泡实验的手术与技术细节。虽然所指定的超声辐照与成像参数已针对血脑屏障（BBB）实验进行了优化，但该技术也可用于研究超声对大脑的其他效应，例如神经调控33,34、β-淀粉样斑块监测31以及免疫细胞反应32。

方案

所有以下实验程序均经挪威食品和安全管理局、Sunnybrook 研究所动物护理委员会以及加拿大动物护理委员会批准，并依照其规定进行。

1. 材料准备

  1. 准备开颅窗手术及超声-微泡治疗所需的材料。对于慢性开颅窗实验，需要无菌的器械和材料、无菌的手术环境，以及术前和术后的药物给药23,24,25。
  2. 换能器与盖玻片的制备
    1. 检查换能器的物理完整性：观察是否存在裂纹或凹痕。确保换能器顶部和侧面的电极完好无损。
    2. 将氰基丙烯酸酯胶水滴入小碟中。使用涂布工具在换能器表面均匀涂抹一层薄胶。
    3. 将换能器放置在玻璃盖玻片上，用力按压20–30秒。
      注：可使用3D打印模具辅助对齐玻璃盖玻片与环形换能器，确保对盖玻片和环形换能器施加牢固且均匀的压力（图2）。
    4. 检查换能器与盖玻片之间是否存在气泡。若发现气泡，应取下盖玻片并从步骤1.2.3重新开始，因为气泡会阻碍超声波的传播。在室温下固化过夜。
    5. 一旦换能器粘附到玻璃盖玻片上，需进行阻抗匹配（图3）。
      注：本方案使用自制的锆钛酸铅环形换能器（外径10 mm，厚度1.4 mm，高度1.2 mm）35，通过定制匹配电路实现50 Ω阻抗和0°相位负载匹配。换能器在厚度振动模式下以0.82 MHz驱动，在盖玻片下方约1 mm处形成圆形焦点。具有类似参数（外径10 mm，厚度1.5 mm，高度1.1 mm）的环形换能器已有表征26，并广泛应用于多光子显微成像实验27,28,29,31,32,36。
  3. 换能器的重复使用与盖玻片更换
    1. 若盖玻片出现裂纹，或残留有前次实验的碎屑（如毛发、胶水），则需更换盖玻片。移除盖玻片时，将换能器和盖玻片浸入丙酮中20分钟以溶解胶水。
      注：丙酮可能影响换能器和/或电极的完整性。操作前请咨询制造商。
    2. 用镊子轻轻拉动盖玻片，检查胶水是否已被丙酮溶解。每10分钟检查一次，以避免换能器长时间暴露于丙酮中。

2. 动物准备

  1. 使用医疗空气、氧气和异氟烷的混合气体在诱导室中对动物进行麻醉。
    注意：已有报道称使用氧气作为载气会影响微泡的半衰期37,38，并减弱超声-微泡诱导的血脑屏障通透性增加的程度27，但同时也可能降低缺氧和死亡的风险39。应根据项目目标和兽医建议选择载气。也可使用氯胺酮/赛拉嗪等注射类麻醉剂；然而，使用吸入性麻醉剂更易于控制麻醉深度和血氧水平。
  2. 通过夹捏脚趾检查动物是否达到足够的麻醉深度。称量动物体重以确定需给予的葡聚糖、微泡及药物剂量。去除动物头部的毛发，并将动物固定于立体定位仪上。
  3. 对于急性实验，必须建立全身循环通路以注射葡聚糖和微泡。为此，将27号导管插入尾静脉。
    注意：虽然也可采用眶后静脉注射，但由于在进行双光子成像时头部操作空间有限，推荐使用尾静脉。
  4. 将动物转移至立体定位仪，并切换为鼻罩供麻醉气体。使用热源（如加热垫或装有温水的手套）维持动物核心体温在37 °C。
  5. 使用直肠探头监测动物体温，使用脉搏血氧仪监测动物生理状态。涂抹眼药膏。注射适当的术前镇痛药和/或抗炎药（见材料表）。
  6. 在开始颅窗手术前，检查动物的麻醉深度、心率、O2饱和度、呼吸频率和体温。
  7. 开始颅窗手术时，使用脱毛膏和/或脱毛剪去除头部毛发。去除从两眼之间至颈部前半段区域的毛发（图4A）。
    注意：脱毛膏接触皮肤时间过长会导致皮肤灼伤。对于慢性颅窗手术，在去除毛发后，用聚维酮碘和70%乙醇交替擦拭头皮进行消毒。准备无菌手术区域。无菌状态必须保持至第2.15步。
  8. 用非优势手持镊子夹起两眼之间的皮肤，沿矢状缝提起头皮。使用弯头剪刀剪除皮肤以暴露顶骨（图4B）。若颅骨或头皮出血，用棉签施加稳固压力止血；必须在出血停止后才能进入下一步。
    注意：对于急性手术，可将皮肤向后推并用液体氰基丙烯酸酯胶水或组织粘合剂将其粘附于颅骨上。
  9. 使用棉签去除覆盖在颅骨外表面的骨膜。
  10. 在手术显微镜（6–25倍）下使用牙科钻（0.5 mm钻头，中等速度）在顶骨上划出一个圆形轮廓，标记颅窗在颅骨上的预期位置（图5）。应避开矢状缝、人字缝和前囟，因为这些区域较薄且覆盖有较大的血管。
    注意：为便于钻孔，可使用记号笔和模板在颅骨上画出颅窗的轮廓（图5A）。对于大鼠，钻取矩形而非圆形的颅窗可能更为方便。由于大鼠颅骨较厚，建议先用0.7 mm钻头在密质骨上划出轮廓，再用0.5 mm钻头完成钻孔。
  11. 钻孔时施加轻柔压力；过度施压会增加损伤脑组织的风险。为防止钻孔过程中颅骨过热，可用注射器向颅骨滴加生理盐水，或使用浸有生理盐水的外科海绵进行冷却。
  12. 交替进行钻孔与冷却，直至形成的骨岛与周围颅骨完全分离。用镊子或钻头轻轻按压骨岛以检查钻孔进展。持续钻孔直至骨岛完全分离。
    注意：颅骨最薄区域出现细小裂纹是钻孔即将完成的良好提示。过早尝试移除骨岛可能导致骨碎片刺入脑组织，损伤硬脑膜并引起炎症和出血。
  13. 使用精细镊子夹住骨岛边缘或上层密质骨将其取出（图6A）。通过放置一块预先浸泡过生理盐水的外科海绵保持脑组织湿润。若观察到出血，将外科海绵置于出血区域。必须在出血完全停止后才能进入下一步。
    注意：若5分钟后仍持续出血，则该动物不能用于双光子成像实验。对于大鼠，若硬脑膜较厚，可能需要将其去除。去除硬脑膜时，应在手术显微镜高倍镜下使用精细镊子操作。
  14. 放置颅窗时，用镊子夹取玻璃盖玻片，在其一侧滴加一滴生理盐水，然后将其移至颅骨孔洞上方。确保盖玻片下方无气泡。
    注意：小鼠使用5 mm玻璃盖玻片，大鼠使用8 mm盖玻片。由于大鼠颅骨较厚，应使用琼脂糖溶液代替生理盐水填充盖玻片与脑组织之间的空隙。也可将换能器及其盖玻片直接粘附于颅骨上，而不使用单独的颅窗盖玻片。若选择此方式，请继续至第3.1步。详见图1。
  15. 在盖玻片周围边缘涂抹一层氰基丙烯酸酯胶水（图6B），以将其固定于颅骨上。确保盖玻片下方无胶水残留。对盖玻片施加压力，确保胶水不接触脑组织。
  16. 待胶水完全干燥后，使用牙科钻将胶水表面磨平。确保手术区域内的所有胶水碎屑均被清除。
    ​注意：对于慢性颅窗，应注射必要的术后药物（见材料表），提供伤口护理用软膏和软质食物，并在加热灯下恢复动物状态。

3. 环形换能器的放置

  1. 制备1% (w/v) 琼脂糖溶液。在小烧杯或锥形瓶中加入0.1 g琼脂糖和10 mL PBS (1×) 或生理盐水，通过将烧杯置于加热板上或在微波炉中加热（30–45秒）使琼脂糖完全溶解。
  2. 步骤3.2–3.5具有时间敏感性，因为琼脂糖溶液冷却较快。用1 mL注射器吸取约0.5 mL琼脂糖溶液。
    注意：为保护脑组织完整性，使用前应确保琼脂糖温度接近体温。
  3. 将琼脂糖充分覆盖于颅窗的盖玻片上。
    注意：若组织出现苍白，说明琼脂糖温度过高，动物需实施安乐死。若脑表面无独立盖玻片覆盖（即换能器及其盖玻片直接放置于脑表面，参见步骤2.14），则此步骤中应将琼脂糖直接涂布于脑表面。
  4. 将换能器置于颅窗上方（图6C）。施加稳固压力，使换能器与颅窗之间残留的琼脂糖尽可能少。确保换能器在XY平面居中、在Z平面与颅窗平行，且琼脂糖中无气泡存在。
  5. 当琼脂糖冷却至果冻样稠度时，用刮刀或手术刀切除换能器盖玻片边缘多余的琼脂糖。确保换能器盖玻片下方无气泡残留。
  6. 用刮刀将一层氰基丙烯酸酯胶水涂布于换能器盖玻片的边缘，并延伸至颅骨表面，使换能器牢固粘附于颅骨。
  7. 持续对换能器施加稳固压力，直至胶水完全干燥（10–15分钟）。

4. 多光子显微镜成像

  1. 将动物置于物镜下方（图7A）。确保物镜位于环形换能器的中心，并与换能器平行（图7B）。若使用水浸物镜，请用去离子且脱气的水填充环形换能器的中心部分。
    注意：脱气水对超声波的正常传播至关重要。
  2. 从物镜处于最高位置开始，然后缓慢降低物镜，直至其进入环形换能器内（图7A，B）。确保物镜不会与换能器或盖玻片发生碰撞。
    注意：交替使用目镜观察，以确认物镜的Z轴位置是否与脑表面处于同一平面，同时用肉眼观察，确保物镜不会与换能器或盖玻片发生碰撞。在经尾静脉注射荧光标记葡聚糖后，通过目镜观察软脑膜血管可能更为清晰（图7C）。
  3. 准备多光子显微镜进行成像。
    注意：本方案使用直立式多光子显微镜和工作距离为2 mm的20-25倍物镜，该工作距离足以聚焦至盖玻片下方的脑实质内。
  4. 准备葡聚糖溶液。根据制造商说明，向葡聚糖小瓶中加入适量磷酸盐缓冲液（PBS）。涡旋混合葡聚糖溶液1-3分钟，确保葡聚糖粉末完全溶解。将葡聚糖溶液经尾静脉注射。
  5. 设置图像扫描
    1. 使用目镜观察，确保物镜与脑组织表面平行。通过调整动物体位校正XZ和YZ方向的错位。
    2. 在多光子显微镜中选择一个视野。在超声暴露前设置XYZ扫描，以获取超声处理前血管结构的基线图像。
      ​注意：典型的成像参数如下：成像深度300-800 µm，步长2-5 µm，时间序列10-20组。确保在成像序列中物镜最低点不会接触换能器或盖玻片。

5. 超声处理

  1. 确保所有BNC电缆正确连接（图3）。
  2. 设置一个足够长时间的XYZT图像扫描，以捕获超声-微泡处理前、处理中和处理后的图像序列。
  3. 按照制造商的说明制备微泡。将微泡注入尾静脉并开始成像。
    注意：可使用输注泵进行微泡注射，以确保注射速率恒定，并实现微泡注射与成像同步进行。如果在成像过程中注射微泡，需确保尾静脉易于接触，同时避免探测器暴露于环境光中。
  4. 开始超声辐照。
    注意：典型的超声辐照参数如下：10 ms的脉冲周期，机械指数为0.2–0.4，脉冲重复频率在1–4 Hz之间。临床前超声-微泡研究中所使用的超声辐照和微泡参数已被广泛研究，并在文献中有详细记录（例如，参见40的综述）。
  5. 在整个超声辐照期间及辐照结束后持续进行多光子成像。注意观察血管外是否有右旋糖酐渗出，因其提示血脑屏障通透性增加。
    注意：如果在血管外空间检测到右旋糖酐，但位于视野边缘，则可能有视野外的血管受到影响。这可能是由于换能器与物镜焦点未对准所致。在此情况下，通过移动物镜或重新调整动物位置来调整视野，比重新对准换能器更为简便。
  6. 成像完成后，在深度麻醉下通过颈椎脱位或CO2窒息处死动物。对于慢性颅窗，应在暴露的颅骨上涂抹一层牙科水泥。
    ​注意：对于慢性颅窗，可缝合窗周皮肤，但由于步骤2.8中已去除头皮，因此缝合并非必需。

6. 图像分析

  1. 导出图像序列。
  2. 使用图像分析软件（例如 Olympus Fluoview、ImageJ/FIJI、Bitplane Imaris、ThermoFisher Scientific Amira）和/或编程工具（例如 Python、MATLAB）分析图像。

结果

成功的超声-微泡治疗可通过荧光葡聚糖从血管内空间外渗至血管外空间来检测（图8），表明血脑屏障通透性增加。根据环形换能器的压力场不同，软脑膜血管和/或毛细血管将受到影响。

为了评估超声-微泡处理引起的血管变化，可以在超声-微泡处理前、处理期间和处理后测量目标血管的直径（图9）。该测量可在商用软件中手动完成（例如 Olympus Fluoview 软件）。在图像采集过程中，还可通过团注葡聚糖和线扫描来评估血流30,41。为了评估葡聚糖渗漏动力学（作为药物递送的代表性模型），可使用 MATLAB26,27,29,41 等工具分析血管内外空间之间的信号强度（图10）。

可以使用 ImageJ/FIJI 进行进一步的图像处理。ImageJ/FIJI 是一款开源软件，兼容 MATLAB，非常适合开展生物学图像分析中的常见分析，例如测量血管变化，或荧光物体的长度及物体间的距离（如 β-淀粉样斑块与血管之间的距离）。通过编写自定义宏，可实现 ImageJ/FIJI 中图像处理流程的自动化。

使用更高级的半自动化软件可以实现更复杂的分析，例如血管的三维分割和细胞追踪（图11）。在完成分割后，可进一步开展更具体的分析，例如根据血管直径、分支模式、扭曲程度以及血流方向，将血管分类为小动脉、小静脉或毛细血管42,43。此外，已有研究开发了机器学习算法以实现血管分割的自动化22,44。

小鼠和大鼠的动物准备及成像过程，包括右旋糖酐和微泡注射。
图1：活体多光子超声-微泡脑实验的总体工作流程。 本方案所述的活体多光子超声-微泡脑实验的总体工作流程如图所示。共包含6个步骤：（A）动物准备，包括（A1）小鼠和（A2）大鼠；（B）右旋糖酐注射；（C）微泡注射；（D）治疗前成像；（E）治疗及成像；（F）治疗后成像与数据分析。请点击此处查看该图的放大版本。

带有3D打印模具、环形换能器、盖玻片和胶水组件的超声传感装置示意图。
图2：3D打印模具的横截面与俯视图。（A）模具的横截面。在环形换能器的顶面涂上一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，并在其上方放置一片盖玻片。可使用压模对盖玻片和环形换能器施加稳固且均匀的压力。（B）模具的俯视图。可在模具上设计一个凹槽，以便于取出制备好的换能器。请点击此处查看该图的放大版本。

超声调控装置示意图；环形换能器、信号发生器、放大器、小鼠模型。
图 3：超声装置示意图。 图中展示了超声实验常用的硬件设备。超声参数由信号发生器设定并触发，经放大器放大后输出。在将信号送至匹配箱之前，可使用功率计记录正向和反射功率，匹配箱需与换能器匹配。所有连接均使用 BNC 电缆，除非另有说明。 请点击此处查看此图的放大版本。

手术方法中组织暴露的实验比较，术前与术后结果。
图 4：脱毛区域与头皮切除范围。（A）脱毛区域应从两眼之间开始，延伸至颈部前半部分。（B）头皮切除范围应充分暴露顶骨。操作前必须止血。请点击此处查看该图的放大版本。

啮齿类动物颅骨手术过程；实验装置，手术方法A与B的比较。
图5：颅窗轮廓示意图。 颅窗位于顶骨上。（A）可在颅骨表面绘制颅窗轮廓，以辅助钻孔过程。（B）钻除密质骨后可见颅窗轮廓。请点击此处查看该图的放大版本。

大鼠颅骨手术示意图，显示脑研究中装置放置步骤。
图6：颅窗与换能器对齐。（A）在顶骨上创建颅窗。骨岛已被移除，暴露出下方脑组织。（B）使用氰基丙烯酸盐胶水将玻璃盖玻片密封至颅骨后，颅窗制作完成。（C）将换能器对准颅窗中心，并用氰基丙烯酸盐胶水粘附固定。请点击此处查看该图的放大版本。

小鼠脑成像；荧光显微镜；光学激发；啮齿类动物模型；实验装置。
图7：物镜与换能器的定位。 （A,B）物镜位于环形换能器的中心。 （C）在落射荧光下，通过目镜可观察到充满荧光葡聚糖的血管。 请点击此处查看该图的放大版本。

显微成像血管造影，A-B对比，明场照明，结构观察。
图8：超声-微泡诱导血脑屏障通透性增加的最大投影多光子图像。 血管系统在超声-微泡处理前（A）和处理后（B）的最大投影图像。通过观察处理后血脑屏障通透性的增加可确认超声-微泡处理的成功，表现为荧光葡聚糖外渗（箭头所示）。比例尺：50 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

超声对纤维网络的影响；强度与直径的截面图；实验结果。
图9：超声-微泡处理诱导的血管调节作用分析。 脑血管在超声-微泡处理前、处理中和处理后的最大投影图像。所有图像中均可见微泡。与（A）处理前状态相比，在（B）超声-微泡处理期间可观察到明显的血管调节作用（红色箭头）。超声-微泡介导的血脑屏障通透性增加也表现为荧光葡聚糖从血管内向血管外空间渗漏（黄色箭头）。当（C）关闭超声后，血管直径恢复至处理前的基础水平。可通过绘制目标血管在超声-微泡处理前、处理中和处理后的直径变化来分析血管变化（D）。比例尺：100 µm。（未发表工作）。请点击此处查看该图的放大版本。

血管显微成像显示外渗动力学；图表显示快速、持续、缓慢的强度变化。
图10：超声-微泡处理后渗漏动力学的分析。 血脑屏障通透性的增加表现为荧光标记葡聚糖从血管内空间渗漏至血管外空间。通过比较超声-微泡处理（A）前和（B）后的图像序列，可明显观察到血脑屏障通透性的变化。（C）可通过追踪血管外区域（黄色矩形）中葡聚糖的强度、体积和扩散速度来分析渗漏动力学。比例尺：50 µm。（未发表工作。） 请点击此处查看该图的放大版本。

比较组织中血管结构的荧光显微图像；示意图显示三维网络。
图11：多光子显微镜XYZ层扫图像的血管分割。 （A）转基因EGFP大鼠体内血管的深度（XYZ）层扫图像。通过静脉注射荧光Texas Red 70 kDa葡聚糖（红色）显示血管结构。绿色通道显示荧光细胞及组织自发荧光。（B）构建血管的三维重建图像，并根据血管类型进行颜色编码，以便进行特定类型的分析。静脉/微静脉为蓝色，动脉/微动脉为红色，毛细血管为青色。比例尺：50 µm。三维重建使用Bitplane Imaris软件完成。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

活体多光子显微镜对大脑的监测是研究超声暴露期间大脑反应的有力工具。据我们所知，本文所述方案是目前唯一能够在超声-微泡治疗过程中对脑实质进行多光子显微成像的方法。颅窗的制备结合环形换能器的使用，可实现对超声-微泡治疗引起的血管、细胞及其他下游反应的高空间和时间分辨率实时监测。其他研究团队仅在超声-微泡治疗结束后进行多光子显微成像，因而错过了脑实质对治疗的实时反应19。本方案提供了更优的时间控制能力，有助于获取数据以揭示超声-微泡治疗背后的急性作用机制。从获取的图像序列中可提取并分析定量与定性数据，例如外渗动力学27,29,30、β-淀粉样斑块体积的变化31以及细胞动态行为32。

在整个实验方案中强调了若干故障排除步骤。首先，特别容易因操作者失误而出现问题的手术步骤被重点指出，例如在颅窗手术过程中使用琼脂糖以及换能器的放置。同时还提供了防止动物不适和死亡的步骤，包括在手术期间监测动物的生理状态，以及在注射前将葡聚糖充分涡旋混匀。其次，换能器的物理参数，以及物镜、换能器与颅窗之间的对齐方式也被着重强调。环形换能器的规格及其声学特性必须根据所使用的物镜和动物模型进行综合考虑。具体而言，环形换能器的内径必须足够大以包围物镜，但又需足够小以确保能够牢固地安装在动物颅骨上。此外，换能器的焦区必须与所用物镜的工作范围相一致。

一个常见的挑战是颅窗和环形换能器相对于物镜存在角度偏差。正确地对物镜与颅窗及换能器进行中心定位（XY方向）和对齐（Z方向），可确保换能器的焦点区域（即脑组织治疗区域）与成像视野相一致，并降低成像过程中物镜与换能器发生碰撞的风险。可通过调整动物头部位置和/或旋转其固定的立体定位架来实现对齐。

显微镜的组件（例如检测器、分光镜）和图像采集参数应根据研究目的进行选择。此处使用长焦距物镜（> 2 mm），因为物镜与脑组织之间存在盖玻片和环形换能器。建议使用直立式显微镜，因为它可为动物操作提供更大的空间，尤其适用于脑部实验。为了捕捉超声-微泡诱导血管内染料渗漏的动力学过程，宜采用高时间分辨率，可通过使用共振扫描系统实现。结合高灵敏度检测系统（如砷化镓磷化物（GaAsP）检测器），还可获得更理想的图像。

本实验方案存在若干局限性。首先，手术过程具有较强的侵入性，已有报道指出其可能引发炎症反应45，尽管可通过适当操作将炎症程度降至最低46。此外，颅窗手术所诱发的免疫反应通常在术后2至4周内逐渐消退23,24,25。另外，在钻孔过程中，若施加过大的力量或速度，可能因产热、振动及压力作用而对下方组织造成损伤。已有研究观察到，颅窗手术与双光子成像还可能影响脑组织温度47。这些局限性在一定程度上可通过精细制备高质量的颅窗、确保携带慢性颅窗的动物充分恢复，以及使用带反馈控制的加热装置维持动物正常体温来减轻。其次，成像深度受限于所使用的显微镜和物镜。例如，若无更侵入性的干预措施，如去除覆盖的皮层组织48，或结合皮层穿透与微透镜技术49，则难以研究超声-微泡治疗对海马等深层脑区的作用。使用工作距离较长的物镜可在一定程度上缓解该问题，但在更大深度下，光的穿透能力本身也受到限制。

尽管本方案的代表性图像来自野生型啮齿类动物，但所介绍的实验流程也可应用于转基因动物和疾病模型，例如阿尔茨海默病31。与血脑屏障调控无关的超声实验，例如超声诱导的神经调控，也可使用本方案进行监测33,34。通过采用不同的显微镜或探测器配置，还可实现其他潜在应用，例如将共聚焦显微镜与超高速相机联用50。尽管由于较大的激发体积，共聚焦显微镜中的光漂白和光毒性问题相对更严重，但超高速成像可能实现对脑毛细血管内皮细胞与微泡相互作用的高时间分辨率可视化，从而进一步阐明超声-微泡血脑屏障治疗背后的机制。总之，本文所述方案提供了一种实时监测超声-微泡血脑屏障实验所诱导的血管和细胞效应的方法，为深入揭示此类治疗的驱动机制以及脑实质对超声-微泡治疗的下游响应提供了有力工具。

披露

Charissa Poon、Melina Mühlenpfordt、Marieke Olsman 和 Catharina de Lange Davies 宣布不存在任何财务或非财务的利益冲突。Spiros Kotopoulis 是 EXACT Therapeutics AS 公司的全职员工，并持有该公司股份，该公司致力于开发超声波与微泡/簇增强药物递送技术。Kullervo Hynynen 是 FUS Instruments 的创始人，他从该公司获得与非研究相关的支持。

致谢

动物饲养由挪威科技大学（NTNU）比较医学核心设施（CoMed）提供。图3使用BioRender.com制作。视频录制与编辑由挪威科技大学自然科学学院网站管理员Per Henning完成。本项目由挪威科技大学（NTNU，挪威特隆赫姆）、挪威研究理事会（RCN 262228）、加拿大卫生研究院（FDN 154272）、美国国立卫生研究院（R01 EB003268）以及Sunnybrook健康科学中心聚焦超声研究Temerty讲席资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
环形换能器放置
琼脂糖（粉末）Sigma-AldrichA9539
烧杯或锥形瓶（50 ml）VWR213-0462 或 214-1130
氰基丙烯酸酯胶（凝胶型）Loctite1363589
玻璃盖玻片（13 mm）Thermo Fisher ScientificCB00130RA120MNT0环形换能器用盖玻片。
加热板或微波炉CorningPC-400D用于加热琼脂糖溶液。
PBS（1×）Sigma-AldrichP4417
环形换能器定制定制定制。例如：https://doi.org/10.1109/ULTSYM.2014.0518
橡胶塞VWR217-0867
动物准备与药物
布比卡因*AAspen169912剂量：1 mg/kg，皮下注射，于切口部位注射局部麻醉药。
丁丙诺啡*AIndivior521634小鼠剂量：0.05–0.1 mg/kg，皮下注射，阿片类药物，术前给药。
丁丙诺啡*AIndivior521634大鼠剂量：0.01–0.05 mg/kg，皮下注射。
卡洛芬*CPfizerDIN 02255693剂量：5 mg/kg，皮下注射，非甾体抗炎药（NSAID），术后给药。
脱毛膏VeetN/A修剪毛发后用于彻底去除残余毛发。
地塞米松*CSandozDIN 00664227, 2301剂量：3 mg/kg，肌内注射，皮质类固醇，减轻脑水肿，术前给药。
恩诺沙星*CBayerDIN: 02249243剂量：5 mg/kg，腹腔注射，抗生素，术后给药。
毛发剪Aesculap90200714Exacta/Isis。
加热垫Physitemp Instruments INCHP-1M
异氟烷BaxterESDG9623C剂量：3% 诱导，1% 维持；麻醉剂。
美洛昔康*ABoehringer Ingelheim Vetmedica GmbH25388小鼠剂量：2–3 mg/kg，皮下注射，非甾体抗炎药（NSAID），术前给药。
美洛昔康*ABoehringer Ingelheim Vetmedica GmbH25388大鼠剂量：1 mg/kg，皮下注射。
脉搏血氧仪STARR Life Sciences CorpN/AMouseOx。
立体定位仪KopfKopf 900
无菌眼用软膏Théa597562Viscotears。
尾静脉导管（24 G）BD Neoflon391350
* 使用前请与兽医讨论给药剂量和给药方式。A 用于急性窗手术，C用于慢性窗手术。除非另有说明，小鼠和大鼠的剂量相同。
颅窗放置所需材料与设备
酒精棉片BD326895
弯头精细手术剪Fine Science Tools14002-12
棉签或无纤维擦拭棒ChemtronicsCX50
氰基丙烯酸酯胶（凝胶型）Loctite1594457（凝胶型），230992（液体型）若无凝胶型，可用液体型氰基丙烯酸酯胶与超细丙烯酸粉末混合替代。
牙科水泥Lang DentalJet Set-4 Denture Repair Package
牙科微型电机手钻FOREDOMK.1070-2高速旋转微型电机套件，配备 2.35 mm 夹头。
镊子Fine Science Tools11152-10, 11370-40
玻璃盖玻片Thermo Fisher ScientificCB00050RA120MNT0（5 mm）用于小鼠颅窗。
玻璃盖玻片Thermo Fisher ScientificCB00080RA120MNT0（8 mm）用于大鼠颅窗。
微型钻头（0.5 mm）MeisingerHM71005（0.5 mm）
微型钻头（0.7 mm）MeisingerHM71007（0.7 mm）
体视显微镜NikonSMZ645
外科明胶海绵EthiconMS0005
Vetbond 组织粘合剂3M1469SB
称量舟/托盘VWR10803-148
* 慢性颅窗手术中，所有手术巾、器械、材料和手术服均需高压灭菌，并使用无菌外科手套。
双光子显微镜
20倍水浸物镜OlympusXLUMPLFLN20 XW数值孔径 1.0，工作距离 2.0 mm。
荧光葡聚糖（例如 FITC 70 kDa）Sigma Aldrich46945推荐使用 10 kDa–2 MDa 范围。
MaiTai DeepSee 钛宝石激光振荡器Spectra-PhysicsN/A
SliceScope 显微镜ScientificaN/A
超声治疗
50 dB 射频放大器E&I2100L
匹配电路定制定制定制。
微泡Bracco ImagingN/ASonoVue（Bracco Imaging，欧洲）。剂量：1 ml/kg。
微泡LantheusN/ADefinity（Lantheus Medical Imaging，北美）。剂量：0.02–0.04 ml/kg。
信号发生器Agilent Technologies33500B

参考文献

  1. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  2. Kalladka, D., et al. Human neural stem cells in patients with chronic ischaemic stroke (PISCES): a phase 1, first-in-man study. Lancet. 388 (10046), London, England. 787-796 (2016).
  3. Pardridge, W. M. The blood-brain barrier: Bottleneck in brain drug development. the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (1), 12(2005).
  4. Lochhead, J. J., Thorne, R. G. Intranasal delivery of biologics to the central nervous system. Advanced Drug Delivery Reviews. 64 (7), 614-628 (2012).
  5. Nagy, Z., Pappius, H. M., Mathieson, G., Hüttner, I. Opening of tight junctions in cerebral endothelium. I. Effect of hyperosmolar mannitol infused through the internal carotid artery. The Journal of Comparative Neurology. 185 (3), 569-578 (1979).
  6. Hynynen, K., McDannold, N., Vykhodtseva, N., Jolesz, F. A. Noninvasive MR imaging-guided focal opening of the blood-brain barrier in rabbits. Radiology. 220 (3), 640-646 (2001).
  7. Burgess, A., et al. Alzheimer disease in a mouse model: MR imaging-guided focused ultrasound targeted to the hippocampus opens the blood-brain barrier and improves pathologic abnormalities and behavior. Radiology. 273 (3), 736-745 (2014).
  8. Abrahao, A., et al. First-in-human trial of blood-brain barrier opening in amyotrophic lateral sclerosis using MR-guided focused ultrasound. Nature Communications. 10 (1), 4373(2019).
  9. Hynynen, K., Jones, R. M. Image-guided ultrasound phased arrays are a disruptive technology for non-invasive therapy. Physics in Medicine and Biology. 61 (17), 206-248 (2016).
  10. Burgess, A., et al. Targeted delivery of neural stem cells to the brain using MRI-guided focused ultrasound to disrupt the blood-brain barrier. PLoS One. 6 (11), 27877(2011).
  11. McDannold, N., Arvanitis, C. D., Vykhodtseva, N., Livingstone, M. S. Temporary disruption of the blood-brain barrier by use of ultrasound and microbubbles: Safety and efficacy evaluation in rhesus macaques. Cancer Research. 72 (14), 3652-3663 (2012).
  12. Downs, M. E., et al. Long-term safety of repeated blood-brain barrier opening via focused ultrasound with microbubbles in non-human primates performing a cognitive task. PLOS One. 10 (5), 0125911(2015).
  13. Baghirov, H., et al. Ultrasound-mediated delivery and distribution of polymeric nanoparticles in the normal brain parenchyma of a metastatic brain tumour model. PloS One. 13 (1), 0191102(2018).
  14. Sulheim, E., et al. Therapeutic effect of cabazitaxel and blood-brain barrier opening in a patient-derived glioblastoma model. Nanotheranostics. 3 (1), 103-112 (2019).
  15. Bing, C., et al. Transcranial opening of the blood-brain barrier in targeted regions using a stereotaxic brain atlas and focused ultrasound energy. Journal of Therapeutic Ultrasound. 2, 13(2014).
  16. O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Blood-brain barrier: Real-time feedback-controlled focused ultrasound disruption by using an acoustic emissions-based controller. Radiology. 263 (1), 96-106 (2012).
  17. Jones, R. M., Deng, L., Leung, K., McMahon, D., O'Reilly, M. A., Hynynen, K. Three-dimensional transcranial microbubble imaging for guiding volumetric ultrasound-mediated blood-brain barrier opening. Theranostics. 8 (11), 2909-2926 (2018).
  18. Jones, R. M., McMahon, D., Hynynen, K. Ultrafast three-dimensional microbubble imaging in vivo predicts tissue damage volume distributions during nonthermal brain ablation. Theranostics. 10 (16), 7211-7230 (2020).
  19. Arvanitis, C. D., et al. Mechanisms of enhanced drug delivery in brain metastases with focused ultrasound-induced blood-tumor barrier disruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (37), 8717-8726 (2018).
  20. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 33, (2012).
  21. McCarter, J. F., et al. Clustering of plaques contributes to plaque growth in a mouse model of Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica. 126 (2), 179-188 (2013).
  22. Cruz Hernández, J. C., et al. Neutrophil adhesion in brain capillaries reduces cortical blood flow and impairs memory function in Alzheimer's disease mouse models. Nature Neuroscience. 22 (3), 413-420 (2019).
  23. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  24. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  25. Cao, V. Y., et al. In vivo two-photon imaging of experience-dependent molecular changes in cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (71), e50148(2013).
  26. Nhan, T., Burgess, A., Hynynen, K. Transducer design and characterization for dorsal-based ultrasound exposure and two-photon imaging of in vivo blood-brain barrier disruption in a rat model. IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 60 (7), 1376-1385 (2013).
  27. Cho, E. E., Drazic, J., Ganguly, M., Stefanovic, B., Hynynen, K. Two-photon fluorescence microscopy study of cerebrovascular dynamics in ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 31 (9), 1852-1862 (2011).
  28. Burgess, A., Nhan, T., Moffatt, C., Klibanov, A. L., Hynynen, K. Analysis of focused ultrasound-induced blood-brain barrier permeability in a mouse model of Alzheimer's disease using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 192, 243-248 (2014).
  29. Nhan, T., et al. Drug delivery to the brain by focused ultrasound induced blood-brain barrier disruption: Quantitative evaluation of enhanced permeability of cerebral vasculature using two-photon microscopy. Journal of Controlled Release. 172 (1), 274-280 (2013).
  30. Nhan, T., Burgess, A., Lilge, L., Hynynen, K. Modeling localized delivery of Doxorubicin to the brain following focused ultrasound enhanced blood-brain barrier permeability. Physics in Medicine and Biology. 59 (20), 5987-6004 (2014).
  31. Poon, C. T., et al. Time course of focused ultrasound effects on β-amyloid plaque pathology in the TgCRND8 mouse model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 8 (1), 14061(2018).
  32. Poon, C., Pellow, C., Hynynen, K. Neutrophil recruitment and leukocyte response following focused ultrasound and microbubble mediated blood-brain barrier treatments. Theranostics. 11 (4), 1655-1671 (2021).
  33. Tufail, Y., et al. Transcranial pulsed ultrasound stimulates intact brain circuits. Neuron. 66 (5), 681-694 (2010).
  34. Chu, P. -C., et al. Neuromodulation accompanying focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Scientific Reports. 5 (1), 15477(2015).
  35. Yddal, T., Kotopoulis, S., Gilja, O. H., Cochran, S., Postema, M. Transparent glass-windowed ultrasound transducers. , at http://eprints.gla.ac.uk/158176/ 2079-2082 (2014).
  36. Santos, M. A., Goertz, D. E., Hynynen, K. Focused ultrasound hyperthermia mediated drug delivery using thermosensitive liposomes and visualized with in vivo two-photon microscopy. Theranostics. 7 (10), 2718-2731 (2017).
  37. Mullin, L., et al. Effect of anesthesia carrier gas on in vivo circulation times of ultrasound microbubble contrast agents in rats. Contrast Media & Molecular Imaging. 6 (3), 126-131 (2011).
  38. Itani, M., Mattrey, R. F. The effect of inhaled gases on ultrasound contrast agent longevity in vivo. Molecular Imaging and Biology. 14 (1), 40-46 (2012).
  39. Baum, J. A. The carrier gas in anaesthesia: Nitrous oxide/oxygen, medical air/oxygen and pure oxygen. Current Opinion in Anaesthesiology. 17 (6), 513-516 (2004).
  40. Poon, C., McMahon, D., Hynynen, K. Noninvasive and targeted delivery of therapeutics to the brain using focused ultrasound. Neuropharmacology. , 20-37 (2017).
  41. Joo, I. L., et al. Early neurovascular dysfunction in a transgenic rat model of Alzheimer's disease. Scientific Reports. 7, 46427(2017).
  42. Dorr, A., et al. Amyloid-β-dependent compromise of microvascular structure and function in a model of Alzheimer's disease. Brain: A Journal of Neurology. 135, Pt 10 3039-3050 (2012).
  43. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: An optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLOS One. 7 (6), 38590(2012).
  44. Teikari, P., Santos, M., Poon, C., Hynynen, K. Deep learning convolutional networks for multiphoton microscopy vasculature segmentation. arXiv. , at http://arxiv.org/abs/1606.02382 (2016).
  45. Denes, A., et al. Surgical manipulation compromises leukocyte mobilization responses and inflammation after experimental cerebral ischemia in mice. Frontiers in Neuroscience. 7, 00271(2014).
  46. Koletar, M. M., Dorr, A., Brown, M. E., McLaurin, J., Stefanovic, B. Refinement of a chronic cranial window implant in the rat for longitudinal in vivo two-photon fluorescence microscopy of neurovascular function. Scientific Reports. 9 (1), 5499(2019).
  47. Podgorski, K., Ranganathan, G. Brain heating induced by near-infrared lasers during multiphoton microscopy. Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1012-1023 (2016).
  48. Ulivi, A. F., et al. Longitudinal two-photon imaging of dorsal hippocampal CA1 in live mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59598(2019).
  49. Levene, M. J., Dombeck, D. A., Kasischke, K. A., Molloy, R. P., Webb, W. W. In vivo multiphoton microscopy of deep brain tissue. Journal of Neurophysiology. 91 (4), 1908-1912 (2004).
  50. Beekers, I., et al. Combined confocal microscope and Brandaris 128 ultra-high-speed camera. Ultrasound in Medicine & Biology. 45 (9), 2575-2582 (2019).

重印与许可

标签

超声微泡颅窗环形换能器血管成像葡聚糖渗漏活体成像血管分割药物递送大脑
利用实时活体多光子显微镜观察聚焦超声联合微泡治疗以增强血脑屏障通透性
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。