四重检查板:研究药物组合的三维棋盘的修改

摘要

该协议描述了如何研究在一个实验中四种药物之间可以获得的所有可能的组合。该方法基于标准的96井板微稀释检测和分数抑制浓度（FICs）的计算来评估结果。

摘要

药物组合疗法的概念正变得非常重要，主要是随着对药物的抵抗力的急剧增加。四重棋盘也称为 Q-棋盘，旨在最大限度地增加一个实验中四种药物之间可能获得的组合数量，以最大限度地减少与其他协议实现相同结果所需的时间和工作。此协议基于简单的微稀释技术，其中药物被稀释并组合在几个 96 井板中。

在第一组96井板，穆勒-欣顿汤被添加，其次是第一个所需的药物（如Cefotaxime这里）连续稀释它。第一步完成后，另一组96井板用于稀释第二种药物（例如阿米卡奇），通过去除特定量的药物2进行转移，并在第一组含有药物的96井板中放入相应的井中。第三步是将第三种药物（如利沃弗洛沙辛）的所需浓度添加到包含药物1和2组合的初始组的适当板中。第四步是在第一组中将第四种药物（如三聚丙酮-磺酰硫磺醇）的所需浓度添加到适当的盘子中。然后，将准备和添加 大肠杆菌 ESBL细菌。

此方法对于评估所有可能的组合非常重要，并且具有更广泛的可能性，可进一步进行 体内 测试。尽管是一项需要大量关注的累人技术，但结果非常出色，而且节省了时间，许多组合可以在一个实验中进行测试。

引言

由于过度使用和滥用抗生素^1，2，耐药性增加，开发治疗细菌感染的新药和制剂的必要性变得至关重要。开发新药等新方法对于克服耐药性危机非常重要。然而，制药业对开发新的抗菌剂不感兴趣。此外，如果开发新药，细菌将继续进化和发展对这些新药的耐药性^3，4。因此，耐药性问题将无法解决，因此需要另一种方法，必须考虑和研究，以克服细菌耐药性。

药物组合是治疗细菌感染的一个非常重要的概念，主要是那些由耐多药病原体^5，6引起的。它减少了治疗过程，减少了给予的剂量:因此，降低给定药物的毒性，有助于降低耐药性发展速度，并在某种程度上使细菌对附带敏感性^{5、7、8、9}概念中描述的给定药物敏感。

一种药物的耐药性发展需要单一的突变:然而，针对多种途径的药....

方案

1. 准备步骤

1. 准备穆勒-欣顿汤（MHB），将25克MH汤加入1升蒸馏水中混合。高压灭菌在121°C为2.5小时。然后，在室温下或冰箱中存储自动切割的介质。
2. 使用四象限条纹法在阿加介质上对有关细菌（大肠杆菌 ESBL）进行亚培养，并在37°C处过夜孵化。
   1. 使用无菌循环，采取一个殖民地，并通过做密切的平行条纹在麦康基阿加板的上半部分传播它。
   2. 使用循环，通过从第一个象限中条纹来传播第二个象限中的细菌。
   3. 从第二个象限，使用紧密的平行条纹延长第三个象限中的条纹。
   4. 通过从第三象限中条纹细菌，在第四象限的中心传播细菌。

2. 面板准备

1. 将四个 96 井板放在一起，形成一个正方形。使用磁带，将底部粘合在一起。
2. 重复此步骤以获取四个面板，每个面板包含 4 个板，并命名为 A1、A2、A3 和 A4。
3. 在四个面板的 16 96 井板中，将 50μL 的 MH 汤添加到第 2 列和第 11 列之间的井中。
4. 在四个面板的 16 96 井板中，将 200 μL 的 MH 汤添加到井 H12 中，作为负控制井。
5. 在四个面板的 16 96 井板中，在井 A1 和 H1 中加入 150 μL 的 MH 汤作为正控制井。
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结果

图2A 表示通过将塞福塔西姆和阿米卡辛与特定浓度的利沃福沙辛和三氯环己烷-磺胺佐尔结合而获得的结果。我们可以在图的左侧看到图右侧显示药物浓度的四个板。箭头表示增长/无增长界面上的井。彩色油井是包含生长的井。我们注意到，第四板不包含包含组合的象限中的生长。这是因为在这个板块中，我们有利沃弗洛沙辛的MIC，将抑制增长。在这个数字中，我们可以看到，Cefotaxime 的 MIC 是在油井 A8 中获得的，该井相当于 32 微克/mL。阿米卡辛的MIC是在油井E1中获得的，相当于16微克/mL。除了塞福塔西梅和利沃弗洛沙辛的几个亚密克外，在含有 1/2 MIC 的三甲基苯丙胺 （D 行） 的行中还可以看到抑制效应。这种抑制含有亚MIC浓度的井中的细菌生长可能是这四种药物浓度之间的协同作用的一种形式。

图2B 表示通过将Cefotaxime和阿米卡辛与特定浓度的利沃福沙辛和三氯胺酮-磺胺佐尔结合而获得的结果。我们可以在图的左侧看到图右侧显示药物浓度的四个板。箭头表示增长/.......

讨论

四重棋盘方法类似于棋盘和协议中的三维棋盘。但是，应考虑某些关键步骤，以避免在实验过程中出现错误。

在启动协议之前，请务必对每种药物的MIC进行针对测试分离物的测试，以了解使用药物 1 和药物 2 开始稀释所需的浓度，这些浓度需要在盘子中连续稀释。关于药物 3 和药物 4，还应知道 MIC 计算需要测试的浓度（1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC 和 MIC）。有很多方法可以确定MIC，但最好的方法是使用微分液技术来确定它，因为 Q-棋盘协议也使用微分液检测进行串行稀释。

在第一步中，在录下板材时，确保长凳清洁，用无菌盖盖住板，以避免污染。需要注意的是，此协议可以使用代表四个面板的四个 96 井板完成，其中每个板被分成四个较小的象限。然而，稀释的数量将尽量减少第一和第二药物。此外，人们还可以使用深井384井板，而不是将四个板贴在一起。然而，当我们做实验时，它不可用。请注意，在选择要使用的板时，请务必检查每个油井的容量，因为油井的最终体积为 250 μL。

此外，每.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1000 和微;L 吸头	Citotest	4330000402
200 µL 吸头	Citotest	4330-0013-17
50 mL 离心管	康宁	430828	用于药物 3 和 4 制备
5 mL 聚苯乙烯圆底管	Falcon	352058	用于 0.5 MacFarland 细菌接种物制备
90 mm 培养皿	JRZ Plastilab		作为使用多通道移液器添加溶液的床
96 孔板	康宁	3596	用于连续扩张和联合药物
Bactrim 200,40 毫克（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑	CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois，法国	10177403	药物 4
头孢福烷，1 克（头孢噻肟）	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	药物 1
密度计
肠杆菌 ESBL 菌株 作为	医学菌株从圣乔治检索医院 黎巴嫩		细菌菌株
Mac Conkey + 结晶紫琼脂	BIO-RAD	64169508	用于制作用于传代培养的琼脂平板
Miacin 500 mg/2 mL（阿米卡星）	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	药物 2
Muller-Hinton 肉汤	BIO-RAD	69444	用于制备细菌培养基
多通道移液器	Thermo Scientific	GJ54761	用于连续稀释和添加培养基、细菌和药物
纸带
单通道移液器	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	用于添加培养基、细菌和药物
Tavanic，500 毫克（左氧氟沙星）	赛诺菲 Aventis	221937/2009	药物 3