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方法文章

四重棋盘法：一种用于药物组合研究的三维棋盘法改良技术

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DOI：

10.3791/62311

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2021年7月24日

 ,  , 
1Faculty of Medicine and Medical Sciences, University of Balamand, 2Department of Clinical Microbiology, Michigan Health Clinics, 3College of Medicine, Central Michigan University

本文内容

摘要

本方案描述了如何在一个单一实验中研究四种药物之间所有可能的组合。该方法基于标准的96孔板微量稀释法，并通过计算部分抑制浓度（FICs）来评估结果。

摘要

药物联合治疗的概念正变得越来越重要，主要原因是药物耐药性急剧增加。四联 棋盘法（也称为Q-棋盘法）旨在通过一次实验最大化四种药物之间可能获得的组合数量，从而减少使用其他方案达到相同结果所需的时间和工作量。该方案基于简单的微量稀释技术，将药物在多个96孔板中进行稀释并相互组合。

在第一组96孔板中，加入Muller-Hinton肉汤，随后加入第一种所需药物（例如，此处为头孢噻肟），进行系列稀释。完成第一步后，使用另一组96孔板对第二种药物（例如，阿米卡星）进行稀释，通过移取特定体积的药物2，加入至第一组96孔板中对应含有药物1的孔中。第三步是将第三种药物（例如，左氧氟沙星）所需浓度加入至初始组中已含有药物1和药物2组合的适当孔板中。第四步是将第四种药物（例如，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）所需浓度加入至第一组中的相应孔板中。随后，制备并加入产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（E. coli）菌液接种物。

该方法对于评估所有可能的组合具有重要意义，并为进一步测试提供了更广泛的可能性 体内 检测。尽管该技术较为耗时且需要高度集中注意力，但其结果显著且节省时间，可在单次实验中测试大量组合。

引言

由于抗生素的过度使用和滥用导致耐药性不断增强1,2，开发新型药物和治疗细菌感染的制剂已变得至关重要。开发新药等新策略对于应对耐药性危机具有重要意义。然而，制药行业对开发新型抗菌制剂缺乏兴趣。此外，即使开发出新药，细菌仍将持续进化并对其产生耐药性3,4。因此，耐药性问题无法从根本上解决，必须探索并研究其他替代策略以应对细菌耐药性。

药物联合使用是治疗细菌感染的一个非常重要的概念，尤其是针对由多重耐药病原体引起的感染5,6。它可缩短治疗周期、降低给药剂量，从而减少药物的毒性，有助于降低耐药性的产生速率，并在一定程度上使细菌对给定药物重新敏感，这在共线敏感性（collateral sensitivity）概念中已有描述5,7,8,9。

对一种药物产生耐药性仅需单个突变；然而，针对多条通路的联合用药则需要多个独立突变才能产生耐药性，而这种联合用药可显著延缓耐药性的发生。联合治疗降低耐药性的一个实例是结核分枝杆菌对利福平的耐药率在联合用药时降低10。另一个例子是Gribble等人开展的一项研究，结果显示单独使用哌拉西林的患者中耐药菌株出现的速率高于使用羧苄青霉素与氨基糖苷类药物联合治疗的患者10。研究表明，进化中的细菌对氨基糖苷类药物产生耐药性的同时，会使这些菌株对多种其他药物变得敏感5。β-内酰胺类药物阿莫西林与β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸联用，在治疗耐药性细菌菌株方面已显示出良好疗效8。

缩短治疗时间是药物联合使用带来的一项显著优势。例如，青霉素或头孢曲松与庆大霉素联合治疗2周，其疗效与单独使用青霉素或头孢曲松治疗4周相当11。药物联合使用使得可以采用单独使用时无效的较低剂量药物，例如亚最低抑菌浓度（Sub-MICs）。以磺胺类药物为例，使用三种磺胺类药物联合方案可在较低剂量下减少毒性反应，从而避免在高剂量使用难溶性磺胺类药物时产生的结晶形成或结晶尿等不良反应12。

因此，降低给药剂量和治疗时间最终会减少药物对机体的毒性。建立评估联合用药相互作用的方法具有重要意义。在一项研究中，结果表明联合疗法对耐药性的Acinetobacter和P. aeruginosa8的治疗更为有效。

联合用药
研究药物组合的方法有多种，例如棋盘法、时间-杀菌曲线法和E-test法13。棋盘法可在一次实验中研究两种目标药物之间的所有可能组合。此外，该方法已被扩展用于研究三种药物的联合应用14。目前，我们进一步将其拓展用于研究四种药物的联合，主要用于多重耐药病原体的治疗。

时间-杀菌曲线实验通常用于检测某种药物的杀菌效果，也可用于评估多种药物在特定浓度下联合使用时的作用效果。本实验方案需要准备多个无菌试管或培养杯，向每个培养杯中加入肉汤培养基、药物组合以及所需的细菌菌株。在不同时间点孵育并记录光密度值后，将所得结果与所用菌株的正常生长速率进行比较，以判断其生长速率是增加、降低还是未发生变化13。

E-test 方法通常用于检测最低抑菌浓度（MIC），该方法将含有待测药物浓度梯度的试条放置于已接种的平板上。该方法也可用于检测两种药物的联合效应，此时将两条试条以相互垂直的方式置于平板上，使其在各自的 MIC 处相交13。

根据文献，目前尚无定义和研究协同作用的金标准；因此，很难评估用于研究药物组合的各种方法中哪一种更优，以及哪一种能产生更好且更可靠的结果13。然而，时间-杀菌试验（Time-kill assay） labor intensive、耗时且成本较高15,16，而E-test法仅适用于研究两种药物之间的组合。棋盘法（Checkerboard）可研究两种受试药物之间的所有可能组合，因此本研究选择该技术进行开发。

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方案

1. 准备步骤

  1. 通过将25 g MH肉汤加入1 L蒸馏水中并混匀来制备穆勒-欣顿肉汤（MHB）。在121 °C下高压灭菌2.5 h。然后将灭菌后的培养基置于室温或冰箱中保存。
  2. 采用四区划线法将待测细菌（产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌，E. coli ESBL）接种至琼脂培养基上，并在37 °C下过夜培养。
    1. 用无菌接种环挑取单个菌落，在麦康凯琼脂平板的前半部分通过密集平行划线方式涂布。
    2. 用接种环从第一区取菌，在第二区进行划线接种。
    3. 从第二区开始，以密集平行划线方式延伸至第三区。
    4. 从第三区取菌，向第四区中心部位划线以接种细菌。

2. 面板制备

  1. 将四个 96 孔板并排放置，组成一个正方形。使用胶带将它们的底部粘在一起。
  2. 重复此步骤，制备四个面板，每个面板包含 4 个板，并将其命名为 A1、A2、A3 和 A4。
  3. 在四个面板共 16 个 96 孔板的第 2 至第 11 列孔中，每孔加入 50 µL MH 肉汤。
  4. 在四个面板共 16 个 96 孔板中，向作为阴性对照孔的 H12 孔每孔加入 200 µL MH 肉汤。
  5. 在四个面板共 16 个 96 孔板中，向作为阳性对照孔的 A1 和 H1 孔每孔加入 150 µL MH 肉汤。

3. 药物1，头孢噻肟，系列稀释

  1. 向一个锥形管中加入 15 mL 无菌 dH2O。
    1. 根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 15 mL) / C1。
      注意：在本实验中，头孢噻肟（Cefotaxime）储备液浓度为 105 μg/mL，C2 为 256 μg/mL；因此，V1 = 38.4 µL。
  2. 从 15 mL 无菌 dH2O 中移除已计算出的体积，然后加入药物。
  3. 将 50 µL 配制好的药物溶液加入每块板第 11 列和第 12 列的每个孔中，但 H12 孔除外。
  4. 开始进行系列稀释：从第 11 列取出 50 µL 加入对应第 10 列的孔中，依次从第 10 列稀释至第 2 列，从第 2 列取出的 50 µL 需弃去。
  5. 对四个面板共 16 块 96 孔板重复步骤 3.4 和 3.5。

4. 药物2，阿米卡星，系列稀释

  1. 取一个锥形管，加入 10 mL 无菌 dH2O。
  2. 根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 10 mL) / C1。
    注意：本实验中，阿米卡星储备液浓度为 103 μg/mL，C2 为 64 μg/mL，因此 V1 = 64 µL。
  3. 从 10 mL 无菌 dH2O 中移除计算所得体积，然后加入药物。
  4. 取八个独立的 96 孔板。
  5. 向每个孔板中 G 至 B 行的各孔加入 100 µL MHB。
  6. 向每块板 G 行各孔中加入 100 µL 前述配制的药物 2 溶液。
  7. 从 G 行到 B 行进行连续梯度稀释，每次从孔中移取 100 µL，最后将 B 行各孔中的 100 µL 弃去。
  8. 重复步骤 4.5、4.6 和 4.7，制备八块板。

5. 将药物2转移至四个面板

  1. 从G行至B行的孔中吸取50 µL药物2，加入四个面板中每块板的相应孔内。一块制备好的96孔板中含有100 µL药物2，足以供应一个面板中的两块板。

6. 加入药物3，左氧氟沙星

  1. 向四个不同的锥形管中，各加入 14 mL 无菌去离子水（dH2O）。
  2. 根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物原液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 14 mL) / C1。
    注意：在本实验中，左氧氟沙星由浓度为 5 × 103 μg/mL 的原液配制四种不同浓度：
    C1 = 2 μg/mL，V1 = 5.6 µL
    C2 = 4 μg/mL，V1 = 11.2 µL
    C3 = 8 μg/mL，V1 = 22.4 µL
    C4 = 16 μg/mL，V1 = 44.8 µL
  3. 从每根含 14 mL 无菌 dH2O 的锥形管中移除已计算出的体积，然后加入相应药物。
  4. 在配制好第三种药物所需浓度后，取 50 µL 加入各面板中对应板的 B 至 G 行、2 至 12 列之间的孔中，其中 C1 对应四个面板中的四个 P1 板，C2 对应四个面板中的四个 P2 板，C3 对应四个面板中的四个 P3 板，C4 对应四个面板中的四个 P4 板。

7. 添加药物4，甲氧苄啶-磺胺甲噁唑

  1. 向一个锥形管中加入 14 mL 无菌去离子水（dH2O）。
  2. 根据公式 C1V1 = C2V2 计算需从药物储备液中取出的体积，即 V1 = (C2 × 14 mL) / C1。
    注：在本实验中，复方新诺明（trimethoprim-sulfamethoxazole）从浓度为 48 × 103 μg/mL 的储备液中配制四种不同浓度：
    C1 = 512 μg/mL，V1 = 149.33 µL
    C2 = 1024 μg/mL，V1 = 298.66 µL
    C3 = 2048 μg/mL，V1 = 597.33 µL
    C4 = 4096 μg/mL，V1 = 1 194.66 µL
  3. 从每根含 14 mL 无菌 dH2O 的试管中移除已计算出的体积，然后加入相应药物。
  4. 在配制好第四种药物所需的四种浓度后，取 50 µL 加入四块微孔板中对应区域的孔内，加样范围为 B 至 G 行、2 至 12 列。其中，C1 对应第 1 区域，C2 对应第 2 区域，C3 对应第 3 区域，C4 对应第 4 区域。

8. 耐超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（E. coli ESBL）菌液的制备与接种

  1. 使用无菌接种环，将先前在平板上培养的细菌分离株 E. coli ESBL 的一个菌落转移至 2 mL 无菌 MHB 中，并涡旋混匀。
  2. 使用比浊仪检测浊度，应达到 0.5 麦氏单位。
  3. 向无菌尿杯中加入 80 mL 无菌 MH 肉汤。
  4. 根据公式 C1V1 = C2V2，将 0.5 麦氏浓度的细菌接种液加入尿杯中，其中 V1 = (106 × 80 mL) / 108 = 800 µL。
  5. 除 H12 孔（作为无菌对照孔）外，向其余每孔加入 50 µL 接种液（浓度为 106 CFU/mL）。
  6. 将板条于 37 °C 培养过夜。
  7. 培养结束后，向各孔加入 50 µL 碘硝基四氮唑（Iodotetrazolium）以记录孔内细菌生长情况。

9. FIC 模板操作步骤（补充文件）

  1. 在面板 A 的黄色单元格中填写药物 1（头孢噻肟）的最高浓度。
  2. 在面板 B 的黄色单元格中填写药物 2（阿米卡星）的最高浓度。
  3. 在面板 C 的黄色单元格中填写药物 3（左氧氟沙星）的最高浓度。
  4. 在面板 D 中填写药物 4（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）的最高浓度。
  5. 通过将有细菌生长的孔用红色高亮标记，描绘出红线（生长/无生长界面）。
  6. 将药物 1 的 MIC 值填入药物 1 的表格中（ATB1）。
  7. 将药物 2 的 MIC 值填入药物 2 的表格中（ATB2）。
  8. 将药物 3 的 MIC 值填入药物 3 的表格中（ATB3）。
  9. 将药物 4 的 MIC 值填入药物 4 的表格中（ATB4）。
  10. 计算 ATB1 的 FIC 值
    1. 确定位于生长/无生长界面上的孔。
    2. 在 ATB1 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 A 左侧的黄色单元格拖动到第一个选定的孔上。
    3. 对每一个选定的孔重复步骤 9.10.2，其中第一个孔对应 FIC1，第二个孔对应 FIC2，依此类推。
  11. 计算 ATB2 的 FIC 值
    1. 在 ATB2 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 B 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。
    2. 对每一个预选孔重复步骤 9.11.1。
  12. 计算 ATB3 的 FIC 值
    1. 在 ATB3 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 C 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。
    2. 对每一个预选孔重复步骤 9.12.1。
  13. 计算 ATB4 的 FIC 值
    1. 在 ATB4 表格中，双击 FIC1 旁边的单元格，并将面板 D 左侧的黄色单元格拖动到第一个预选孔上。
    2. 对每一个预选孔重复步骤 9.13.1。
  14. 在标注为 ATB1+2+3+4 的表格中，自动计算每种抗生素的 FIC1 总和。其他 FIC 值（FIC2、FIC3 等）也将以相同方式求和。
    1. 在包含 FIC 且以黄色高亮显示的单元格中，双击该单元格并从 ATB1+2+3+4 表格中选择总和 ΣFICs。
  15. 对代表九块板的九个工作表重复上述步骤。
    ​注意：在 FIC all 工作表中，表格将显示最终的总和 FIC 值及其对应的解释。

10. 采用微量稀释法测定四种药物的最小抑菌浓度

  1. 用每种待测药物的缩写标记四行。例如，CTX 代表头孢噻肟（Cefotaxime），AMK 代表阿米卡星（Amikacin），LEVO 代表左氧氟沙星（Levofloxacin），SXT 代表甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-sulfamethoxazole）。
  2. 向每行使用的第1孔和第12孔中各加入200 µL无菌的穆勒-欣顿肉汤（Muller Hinton broth）。第12孔将作为阴性对照孔。
  3. 向每行使用的第2至第11孔中各加入100 µL无菌的穆勒-欣顿肉汤。
  4. 使用公式 C1V1 = C2V2 计算每种药物需要添加的体积，即 V1 = (C2 × 4 × V2) / C1。其中 V2 为孔中的终体积（200 µL），C1 为母液浓度，C2 为第一孔中所需初始浓度。
    注意：本实验中使用以下参数：
    头孢噻肟（Cefotaxime）：C1 = 105 μg/mL，稀释至104 μg/mL，C2 = 256 μg/mL；因此 V1 = 20.48 µL
    阿米卡星（Amikacin）：C1 = 103 μg/mL，C2 = 64 μg/mL；因此 V1 = 51.2 µL
    左氧氟沙星（Levofloxacin）：C1 = 5 × 103 μg/mL，稀释至5 × 102 μg/mL，C2 = 16 μg/mL；因此 V1 = 25.6 µL
    甲氧苄啶-磺胺甲噁唑（Trimethoprim-Sulfamethoxazole）：C1 = 48 × 103 μg/mL，C2 = 4096 μg/mL；因此 V1 = 68.26 µL
  5. 从每行对应的第1孔中移除与药物体积相等的肉汤后，加入计算所得的每种药物体积，确保加药后总体积为200 µL。
  6. 进行连续梯度稀释：从第1孔中取出100 µL加入第2孔，依次操作至第10孔，从第10孔中取出的100 µL应弃去。注意第11孔作为阳性对照孔。
  7. 除作为阴性对照的第12孔外，向每行使用的各孔中加入100 µL浓度为106 CFU/mL的细菌接种液。
  8. 在37 °C条件下孵育过夜。

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结果

图2A展示了头孢噻肟与阿米卡星联合特定浓度的左氧氟沙星及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑所得的实验结果。图中左侧显示了四个平板，右侧以示意图形式标出了各药物的浓度。箭头指示的是生长/无生长界面处的孔位。有颜色的孔表示含有细菌生长的孔。我们注意到，第四个平板中包含药物组合的象限内无细菌生长，这是因为在该平板中，左氧氟沙星的浓度达到了其最低抑菌浓度（MIC），从而抑制了细菌生长。从本图可见，头孢噻肟的MIC出现在A8孔，为32 μg/mL；阿米卡星的MIC出现在E1孔，为16 μg/mL。此外，在含有1/2 MIC阿米卡星（D行）以及多种亚抑菌浓度（subMIC）的头孢噻肟和左氧氟沙星，同时联合1/8 MIC甲氧苄啶-磺胺甲噁唑的孔中，也观察到了抑制效应。这些含有亚抑菌浓度药物的孔中出现的细菌生长抑制现象，可能提示这四种药物在相应浓度下存在某种协同作用。

图2B展示了将头孢噻肟和阿米卡星与特定浓度的左氧氟沙星及甲氧苄啶-磺胺甲噁唑联合使用所获得的结果。在图的左侧部分，可以看到四个平板，其...

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讨论

四重 棋盘法在实验步骤上类似于棋盘法和三维棋盘法。然而，必须考虑某些关键步骤，以避免实验过程中出现错误。

在开始实验方案之前，务必检测每种药物对受试菌株的最低抑菌浓度（MIC），以确定药物1和药物2在进行系列稀释时所需的起始浓度。对于药物3和药物4，也应已知其MIC，以便计算需要测试的浓度（即1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC和MIC）。测定MIC的方法有多种，但最佳方法是采用微量稀释法，因为Q棋盘法实验方案同样使用微量稀释法进行系列稀释。

第一步，在粘贴培养板时，确保实验台面清洁，并用无菌盖覆盖培养板以避免污染。需要注意的是，本实验方案可使用四块96孔板来完成，分别代表四个面板，每块板分为四个较小的象限。然而，第一种和第二种药物的稀释次数将减少。此外，也可使用深孔384孔板代替将四块板粘合在一起的方式。但在我们进行实验时，该类板不可用。请注意，在选择所用培养板时，务必确认每个孔的容量，因为孔内的最终体积为250 µL。

此外，每个面板中的平板数量以...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1000 µL 吸头Citotest4330000402
200 µL 吸头Citotest4330-0013-17
50 mL 离心管corning430828用于药物 3 和 4 的配制
5 mL 聚苯乙烯圆底管Falcon352058用于制备 0.5 麦氏浓度的细菌接种液
90 mm 培养皿JRZ Plastilab作为多通道移液器加液时的承载平台
96 孔板corning3596用于系列稀释及药物组合
Bactrim 200, 40 mg（甲氧苄啶-磺胺甲噁唑）法国 Fontenay-sous-Bois CRNEXI SAS 公司10177403药物 4
Ceforane, 1 g（头孢噻肟）PHARCO 制药公司24750/2006药物 1
比浊仪
产超广谱β-内酰胺酶的大肠杆菌（E. Coli ESBL 菌株）来自黎巴嫩圣乔治医院的临床菌株细菌菌株
麦康凯琼脂加结晶紫BIO-RAD64169508用于制备亚培养所用的琼脂平板
Miacin 500 mg/2 mL（阿米卡星）HIKMA 制药公司2BXMIA56N-AEF药物 2
穆勒-欣顿肉汤（Muller-Hinton Broth）BIO-RAD69444用于制备细菌培养基
多通道移液器Thermo ScientificGJ54761用于系列稀释以及培养基、细菌和药物的添加
封口膜
单通道移液器Thermo ScientificOH19855 HH40868用于添加培养基、细菌和药物
Tavanic, 500 mg（左氧氟沙星）赛诺菲安万特（sanofi aventis）221937/2009药物 3

参考文献

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