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方法文章

收获与分散：被忽视的生物膜研究方法中的关键步骤

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DOI：

10.3791/62390

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2022年4月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biofilm Engineering, Montana State University

本文内容

摘要

本文详细介绍了在两种表面类型上进行生物膜采集和分散的三种常用方法，采集方法的稳健性测试，以及在选择和优化采集与分散技术时需考虑的最低限度信息，以提高实验的可重复性。

摘要

生物膜实验方法包含四个明确的步骤：在相关模型中培养生物膜、处理成熟的生物膜、从表面收获生物膜并分散聚集体，以及分析样品。在这四个步骤中，收获与分散步骤的研究最少，但在考虑潜在测试偏差时却至关重要。本文展示了在三种不同表面上生长的生物膜常用的收获与分散技术。这三种生物膜收获与分散技术是通过广泛的文献综述获得的，包括涡旋振荡与超声处理、刮取与均质化处理，以及刮取后进行涡旋振荡和超声处理。所考虑的两种表面类型为：非多孔硬质表面（聚碳酸酯和硼硅酸盐玻璃）和多孔表面（硅胶）。此外，我们还提供了在报告所采用的收获技术时应包含的最低限度信息建议，以及一种用于检测偏差的配套方法。

引言

生物膜的定义在过去几十年中不断演变，现涵盖微生物与多种生物性和/或非生物表面的关联，以及包含非细胞成分1的结构，其中微生物在基质内表现出不同的生长特性和基因表达2。生物膜可保护微生物免受干燥等环境压力的影响，并可能降低化学消毒剂的作用效果，从而导致微生物存活。生物膜内的存活微生物可能成为对公共卫生构成威胁的病原微生物来源3。

生物膜实验方法包括四个步骤：培养、处理、取样（收获与分散）以及分析。第一步培养是生物膜文献中最常被考虑和报道的步骤，用户在此阶段确定生物体的生长条件，如温度、培养基等4,5,6,7。第二步处理用于评估抗菌剂（例如消毒剂）对成熟生物膜的效力3,8,9，或者将抗菌剂整合到材料表面，以评估该产品预防或减少生物膜形成的能力10。第三步取样包括从生物膜生长的表面收获生物膜，并对收获的团块进行分散处理3,8,11。第四步分析可能包括活细胞计数、显微镜观察、荧光检测、分子检测结果和/或基质成分的评估8,9。数据分析可提供有关实验结果的信息。在这四个步骤中，取样往往是最容易被忽视的步骤，因为它通常默认所选的生物膜收获和/或分散技术是100%有效的，而常常缺乏验证11。

通常被认为具有均一性的细菌浮游悬液，在分析前仅需进行简单的涡旋振荡处理。然而，生物膜是由微生物（原核生物和/或真核生物）、胞外多糖、蛋白质、脂质、胞外DNA以及宿主细胞组成的复杂群落12。为了充分地从表面收获生物膜并将其解聚成均一的单细胞悬液，需要采用超出传统浮游微生物培养方法的步骤。一项广泛的文献综述（本出版物未包含相关信息）表明，选择何种去除和解聚技术取决于多种因素，包括生物膜中存在的物种、生物膜附着的表面类型（非多孔或多孔）、对生长表面的可接近性（可轻松移除的试片或需破坏生物膜生长装置本身）、表面几何结构（面积和形状）、生长表面上生物膜的密度，以及实验室可用的设备。

当从表面收获生物膜时，所得的细胞悬液是不均一的。如果需要对这种不均匀的悬液进行准确计数，则必须将其分散为单个细胞。活菌平板计数法假设一个菌落形成单位来源于一个细菌。如果将生物膜的聚集体接种到培养基上，则无法区分单个细胞，从而可能导致计数结果不准确。例如，在消毒剂效力测试中，如果某种处理相比对照组能更有效地从表面去除生物膜，则其对数值降低（log reduction）可能被人为夸大；相反，如果某种化学消毒剂相比对照组更倾向于将生物膜固定在表面，则其对数值降低会显得更低11。这类情况可能导致对实验数据的偏差性解读。

在准备过程中 发表文献中对现有研究的综述表明，常见的生物膜采集与分散方法包括刮取、拭子取样、超声处理、涡旋振荡，或上述方法的组合。刮取是指使用无菌棒、刮刀或其他工具从表面物理刮除生物膜。拭子取样是指使用棉签或其他固定吸水材料从表面去除生物膜。超声处理是指通过水中传播的超声波将生物膜从表面破坏并脱离。涡旋振荡是指利用混匀仪在试管内使样品形成液体漩涡。均质化则是利用旋转刀片将采集到的生物膜团块剪切为单细胞悬液。本文中，我们介绍了针对两种不同类型表面（硬质/非多孔表面与多孔表面）的三种生物膜采集与分散方法。

本文提供了一份建议性的最低限度信息清单，研究人员应在发表文章的方法部分包含这些信息。我们希望包含这些信息能够使其他研究人员得以重复相关研究工作。目前尚无完美的收获与解离方法，因此本文还提供了如何验证该技术的建议。

本文展示了从常见生长表面收获和分散生物膜的三种常用方法。这些信息将帮助研究人员更好地理解生物膜检测方法的整体精确度和偏差。所描述的方法如下：（1）在CDC生物膜反应器中，于高流体剪切条件下在聚碳酸酯试片（坚硬非多孔表面）上培养的Pseudomonas aeruginosa生物膜，通过涡旋振荡与超声处理相结合的五步法进行收获和分散，以实现生物膜的有效解聚；（2）在滴流反应器中，于低流体剪切条件下在硼硅酸盐玻璃试片（坚硬非多孔表面）上培养的P. aeruginosa生物膜，采用刮取结合均质化的方法进行收获和分散；（3）在硅胶管（多孔表面）内培养的Escherichia coli生物膜，通过刮取后继以超声处理和涡旋振荡的方式进行收获和分散。

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方案

1. 涡旋振荡与超声处理

  1. 根据 ASTM 标准 E25622 培养成熟的 P. aeruginosa ATCC 15442 生物膜。
  2. 在 48 小时培养期结束后，按照 ASTM 标准 E28718 准备对生物膜和样本载片进行处理和取样。
  3. 使用经火焰灭菌的镊子，将已高压灭菌的防溅罩无菌地插入无菌的 50 mL 锥形管中。对所有需要接受处理的试管重复此操作。对照组载片所用的试管无需防溅罩。
  4. 从 CDC 生物膜反应器中无菌取出一根随机选择的转轴，将载片通过轻轻浸入 30 mL 无菌缓冲水中的方式冲洗，以去除松散附着的细胞。
  5. 将转轴平行持于台面之上，置于一个空的无菌 50 mL 锥形管上方，使用经火焰灭菌的内六角扳手松开固定螺钉，使带有生物膜的载片落入管中。根据所需数量重复此步骤。取下防溅罩并放入单独容器中待灭菌。
  6. 使用 5 mL 移液管，缓慢将 4 mL 处理液或对照液沿管壁加入试管中，使液体沿管内壁流下。
  7. 轻轻敲击试管底部，以排除载片下方的任何气泡。每次加样后间隔 30–60 秒。
  8. 在规定的接触时间结束时，按照之前施加处理液（或对照液）的相同顺序，向各试管中加入 36 mL 中和剂。
    注意：处理液与中和剂的最终总体积对于准确测定生物膜对数密度至关重要。
  9. 将每支试管在最大转速下涡旋振荡 30 ± 5 秒，确保形成完整的涡流。
    注意：在对不锈钢等较重载片于玻璃离心管中进行涡旋时，应小心操作，以防破裂。
  10. 在处理实际样品前，应预先确定每个水浴中试管的最佳数量及在试管架中的放置位置。若需处理多个样品，需确认超声水浴中的水温为 21 ± 2 oC。
  11. 将试管置于试管架中，并悬于已脱气的超声仪内，使水浴液面与试管内液面齐平。在 45 kHz、100% 功率和“Normal”模式下超声处理 30 ± 5 秒。重复涡旋和超声循环，最后以一次涡旋结束（共完成 5 个循环）。
    注意：这些含有收获并分散的生物膜的试管即为 100  或 0 稀释度样品。
  12. 用缓冲水对样品进行系列稀释，采用合适的涂布方法接种于 R2A 琼脂平板上。在 36 ± 2 oC 下培养 24 小时。根据所用涂布方法计数菌落，并记录数据。

2. 刮取与匀浆化

  1. 根据 ASTM 标准 E264713 培养成熟的 P. aeruginosa ATCC 15442 生物膜。
  2. 设置取样站，包括取样板、盛有95%乙醇的烧杯、酒精灯、止血钳、试片取出工具、装有无菌稀释水的烧杯以及用于冲洗试片的稀释管。
  3. 关闭泵。取下通道盖，使用无菌试片取出工具和止血钳小心取出试片，注意不要扰动生物膜。
  4. 将试片轻轻浸入装有45 mL无菌稀释水（置于50 mL离心管中）的液体中，动作要流畅。立即反向动作将试片取出。
  5. 将试片放入含有45 mL无菌稀释水的烧杯中。使用无菌刮勺或刮刀，沿向下方向刮取覆盖生物膜的试片表面约15秒。通过在烧杯中搅拌刮勺或刮刀进行冲洗。重复刮取和冲洗过程3–4次，确保试片表面完全覆盖。
  6. 将试片置于无菌烧杯上方，保持60°倾斜角，用移液器将1 mL无菌稀释水冲洗试片表面。重复共5次冲洗。烧杯中最终体积为50 mL。
    注意：处理液与中和剂的最终总体积对于准确测定生物膜对数密度至关重要。
  7. 每取出一个试片后，立即更换相应的通道盖。
  8. 在生物安全柜中操作，对刮取的生物膜样品进行均质处理。将无菌均质探头连接至均质仪，将探头顶端插入液体中，开启均质仪并逐步加速至20,500 rpm。
  9. 均质处理30秒后，逐步降低转速并关闭均质仪。
  10. 在不同生物膜样品之间对探头进行消毒：如上所述，在20,500 rpm下对9 mL无菌稀释空白样进行30秒均质处理；再对9 mL 70%乙醇管进行30秒均质处理，取下探头并静置于乙醇管中1分钟；随后再对两个额外的稀释空白样进行均质处理。
    注意：每个样品可使用一次性均质探头。
  11. 将样品在缓冲水中进行连续稀释。采用合适的涂布方法接种于R2A琼脂平板上。在36 ± 2oC条件下培养24小时，根据所用涂布方法计数菌落并记录数据。

3. 刮取、涡旋和超声处理

  1. 在硅胶导管管路中培养成熟的 Escherichia coli ATCC 53498 生物膜10。
  2. 准备取样材料：冲洗管、无菌离心管、无菌空培养皿、经火焰灭菌的不锈钢止血钳和剪刀、计时器和尺子。
  3. 暂停泵运行，用70%乙醇清洁管路外表面。从管路末端量取2 cm，避开连接接头的区域，并在管路上做标记以确定切割位置。
  4. 使用经火焰灭菌的剪刀在2 cm标记处切断管路，并将该管段放入无菌空培养皿中。用70%乙醇擦拭管路，然后将远端重新连接至废液管路。
  5. 冲洗管段以去除浮游细胞。用经火焰灭菌的镊子将管段轻轻浸入20 mL无菌稀释水中，随即取出。将管段放入10 mL中和剂中。
  6. 用经火焰灭菌的镊子夹住管段，用无菌木制涂布棒刮取管段内壁，直至所有内表面均被刮取。偶尔将涂布棒在10 mL中和剂中冲洗，并将管段放回样品管中。刮取后的管段即为100或0倍稀释样品。
    注意：处理液与中和剂的最终总体积对于准确测定生物膜对数密度至关重要。
  7. 将每支试管在最大转速下涡旋振荡30 ± 5秒。将试管置于试管架中并悬于超声仪水槽内，使水槽中的水位与试管内液面高度一致。在45 kHz、100%功率、正常模式下超声处理30 ± 5秒。重复涡旋和超声步骤，最后以一次涡旋结束。
    注意：此管中收集并分散的生物膜即为100稀释样品。
  8. 用缓冲水对样品进行系列稀释。根据所选的涂布方法，将稀释液接种至胰蛋白胨大豆琼脂平板上。
  9. 将平板置于36 ± 2 oC条件下培养24小时。根据所用涂布方法计数菌落，记录数据并计算算术平均值。

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结果

收获方法的验证/确认
我们实验室开展的多项研究考察了涡旋振荡和超声处理在生物膜反应器（ASTM E2562）中利用单管法（ASTM E2871）有效收获生物膜的能力28。

根据 ASTM E25622 标准，在硼硅酸盐玻璃片上培养 P. aeruginosa ATCC 15442 生物膜。培养 48 小时后，将四片玻璃片放入试管中，用 4 mL 无菌缓冲水“处理”，并加入 36 mL 2×D/E 中和肉汤进行中和。采用初始超声参数：45 kHz、10% 功率、扫描模式（Sweep setting），超声时间 30 ± 5 秒，用于从四片玻璃片中的三片上回收并分散生物膜。完成涡旋和超声处理后，对每片玻璃片进行结晶紫染色并拍照。图 1 展示了经涡旋和超声处理后，三片玻璃片上残留生物膜的量，与对照组相比的结果。

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讨论

生物膜收获与分散方法的最低信息要求
为了在科学界范围内获得可重复的生物膜数据，作者必须尽可能详细地描述生物膜实验方法中的每一个生长、处理、取样和分析步骤。生物膜方法的标准化有助于实现这一目标，因为它允许研究人员引用特定方法以及任何相关的修改。然而，许多论文仅用一两句话来描述生物膜的收获和分散过程。为了提高实验的可重复性，我们建议在发表文献中包含生物膜收获的最低信息要求。这一建议基于Lourenco等人提出的“生物膜实验最低信息标准”（Minimum Information About a Biofilm Experiment, MIABiE）倡议17。若采用超声处理进行生物膜的收获与分散，应报告以下参数信息：试管在水浴中的位置（应遵循制造商建议，以避免损坏换能器）、同时超声处理的试管数量、试管材质、管内液体的体积和类型、是否含有表面活性剂、管内液面相对于超声水浴液面的位置、用于固定试管的装置（如玻璃烧杯或试管架）、超声前是否对水浴进行脱气处理（若设备无自动脱气功能，可在放入样品前先运行水浴一段时间，以去除部分溶解气体）、水浴温度（长时间超声可能...

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致谢

我们谨向 Danielle Orr Goveia、Blaine Fritz、Jennifer Summers 和 Fei San Lee 致以谢意，感谢他们对本文的贡献。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
50 mL 锥形瓶Thermo Scientific339652
100 mL 玻璃烧杯Fisher ScientificFB102100
5 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-12D用于向含有试片的瓶中添加处理液。
50 mL 血清移液管Fisher Scientific13-678-14C在处理接触时间结束时，用于向瓶中添加中和剂。
涂布棒Puritan807
止血钳Fisher Scientific16-100-115
金属刮刀Fisher Scientific14-373
PTFE 刮棒Saint-Gobain06369-04
S 10 N - 10 G - ST 分散工具IKA4446700用于生物膜样品的均质化。
剪刀Fisher Scientific08-951-20
硅胶导尿管，16 法国号Medline IndustriesDYND11502
硅胶管，16 号Cole-ParmerEW96400-16
防溅罩BioSurface Technologies, Inc.CBR 2232
T 10 basic ULTRA-TURRAX 分散器IKA3737001用于生物膜样品的均质化。
管路连接器Cole-ParmerEW02023-86
超声波清洗机ElmaTI-H15
Vortex-Genie 2 漩涡振荡器Scientific IndustriesSI-0236
Vortex-Genie 2 垂直 50 mL 试管架Scientific IndustriesSI-V506

参考文献

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