本文介绍了一种用于保存小鼠肺切片（PCLS）组织血管收缩功能的方案，可获得肺血管系统和气道的复杂三维图像，且该组织样本的活性可维持长达10天，适用于多种实验操作。
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本文内容
摘要
摘要
小鼠肺组织的可视化可提供有关气道和血管系统的宝贵结构与细胞信息。然而，如何保存真正反映生理状态的肺血管仍面临挑战。此外，小鼠肺组织结构精细，导致在制备高质量图像样本时存在技术难题，难以同时保留细胞组成和组织架构。类似地，可通过细胞收缩力检测来研究细胞对血管收缩剂的反应潜能。 体外，但这些检测方法无法重现完整肺部的复杂环境。与这些技术问题相比，精密切割肺组织切片（PCLS）方法可作为一种高效替代方案，用于无区域偏差地三维可视化肺组织，并可作为活体替代性收缩功能模型持续使用长达10天。采用PCLS制备的组织可保持原有的结构和空间取向，非常适合用于疾病过程的研究 离体通过共聚焦显微镜可成功观察从可诱导型tdTomato报告小鼠模型获取的肺切片（PCLS）中内源性tdTomato标记细胞的定位。在暴露于血管收缩剂后，PCLS能够保持血管收缩功能和肺组织结构的完整性，并可通过延时成像模块进行记录。结合其他实验方法（如蛋白质印迹和RNA分析），PCLS有助于全面理解多种疾病背后的信号转导通路，从而加深对肺血管疾病病理生理机制的认识。
引言
在肺组织制备和成像技术方面的进展，能够在不破坏解剖结构的前提下保存细胞组分，从而深入理解肺部疾病。在维持生理结构的同时识别蛋白质、RNA 及其他生物分子的能力，为细胞空间排列提供了关键信息，有助于拓展对多种肺部疾病病理生理机制的认识。当这些精细成像技术应用于动物模型时，可增进对肺血管疾病（如肺动脉高压）的理解，进而有望推动更优治疗策略的开发。
尽管技术不断进步，获取高质量的小鼠肺组织图像仍然是一项挑战。呼吸周期由吸气过程中产生的胸腔内负压驱动1。在传统方法中获取活检样本并制备用于成像的肺组织时，这种负压梯度会丧失，导致气道和血管系统塌陷，无法再反映其真实状态。为了获得能够真实反映当前生理条件的图像，必须重新扩张肺部气道，并灌注血管系统，将动态的肺组织转变为静态的固定结构。应用这些特定技术可保持肺组织的结构完整性、肺血管系统以及包括巨噬细胞在内的各种细胞成分，使肺组织尽可能接近其生理状态地呈现出来。
精密肺切片（PCLS）是研究肺血管解剖学与生理学的理想工具2PCLS 能在保留肺组织结构和细胞成分的同时，提供三维的详细成像。PCLS 已被用于动物和人类模型，以实现对细胞功能的三维活体高分辨率成像，是研究潜在治疗靶点、测量小气道收缩以及探究慢性肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病和肺癌）病理生理机制的理想工具。
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方案
所有动物护理均遵循波士顿儿童医院及机构动物护理与使用委员会批准的指南。本研究使用的小鼠为野生型 C57/B6 小鼠以及 Cdh5-CreERT2 与 Ai14 tdTomato 杂交的小鼠。
1. 溶液的配制
- 提前准备好实验过程中所需的磷酸盐缓冲液（1× PBS）和 2% 琼脂糖溶液。
- 将 2 g 琼脂糖粉末加入 100 mL 经高压灭菌的水中。每次用微波炉加热数秒，直至溶液变澄清。
- 将溶液置于 42 °C 水浴中，待用。
注意：PBS 和 2% 琼脂糖溶液均可在室温下保存数周。
2. 小鼠肺组织的提取
- 通过过量异氟烷处死小鼠。在干燥器下层的滤纸上放置少量异氟烷，并将小鼠置于上层，使其暴露于异氟烷中直至失去意识。
- 通过在颈部施加向下的压力并同时向尾部方向牵拉尾巴，确认小鼠死亡。将小鼠转移至解剖台面。
- 将小鼠置于仰卧位，并使用胶带将其足爪和鼻部固定在台面上。
- 用70%乙醇喷洒小鼠腹侧表面，并擦去多余乙醇。
- 用镊子在膀胱位置提起腹部皮肤，沿中线使用手术剪向上剪开至颈部区域，暴露气管。
- 用镊子提起下方的筋膜层，并沿中线由下向上剪开，暴露内脏器官和纵隔腔。 ....
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结果
当加入细胞或组织后，活力检测试剂会被活体组织的还原性环境修饰，颜色变为粉红色/红色，并产生强烈的荧光。第0-1天和第9-10天检测到的典型颜色变化如图3所示。如图所示，溶液初始为蓝色，过夜后转变为粉红色，表明组织具有活力。颜色变化通常在1–4小时内发生；但有时可能需要更长时间。为检测组织活力，使用酶标仪测定振动切片机制备的样本以及4%多聚甲醛（PFA）固定的肺组织切片（作为对照）的吸光度。按照试剂生产商的建议，读取样本孵育溶液在562 nm和630 nm波长处的吸光度值。振动切片机制备的组织在每日562 nm与630 nm波长下的吸光度差值及其与对照组织的比较结果如图3所示。
为展示振动切片机制备的肺组织的收缩性，将一块新鲜组织置于400倍明场显微镜下，并用KCl或内皮素-1处理，直至组织完全浸没。对组织进行30-60秒的录像，可观察到血管结构的收缩（视频1）。
为了验证在注.......
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讨论
本文描述了一种改进的方法，用于制备可保留血管结构并优化实验灵活性的小鼠肺组织高分辨率图像，特别是通过应用肺切片（PCLS）技术获取可在三维视野下观察且保留血管收缩功能的肺组织微切片。利用细胞活力检测试剂，本方案证明了经过仔细制备和保存的组织切片其活力可维持超过一周。微切片活力的保留使得可在同一组织样本上对血管和气道结构进行多次及长期的实验，使其成为测试多种药物离体（ex vivo）反应、评估潜在分子机制以及筛选试剂的理想样本4。该样本因此成为在活体（in vivo）试验前研究潜在治疗手段对血管张力影响的理想平台。由于肺气道和血管结构得以完整保存，制备好的样本可进一步应用于其他技术，例如本文所述及表1中总结的收缩功能检测。这为获取详细描绘肺血管空间排列结构及信号转导级联反应的高分辨率图像提供了可能，有助于阐明肺血管疾病的发病机制。
用于实验的组织微切片制备技术利用振动切片机（vibratome）或振动刀片来制备精确切割的器官型切片，与传统技术相比，该方法可提高准确性和.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者谨此感谢袁浩博士和刘凯峰博士提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）1R01 HL150106-01A1项目、Parker B. Francis 奖学金以及肺动脉高压协会Aldrighetti研究奖对袁克博士的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 注射器中的0.5 cc分离肝素 | BD | 每毫升100 USP单位 | |
| 1X PBS | 康宁 | 21-040-CM | |
| 用于气管插管的20½英寸钝端套管针 | Cml 供应 | 90120050D | |
| 30 cc 注射器 | BD | 309650 | |
| 抗抗溶液 | Gibco | 15240096 | |
| 自动振动切片机 | Leica | VT1200S | |
| 细胞活力检测试剂（alamarBlue） | 赛默飞世尔科技 | DAL1025 | |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss | 880 | |
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基（Modified Eagle Medium）和谷氨酰胺最大补充剂（GLutaMAX），添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep） | Gibco | 10569-010 | |
| 内皮素-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| 研钵和研杵 | 亚马逊 | ||
| RIPA 裂解和提取缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | 89900 | |
| 6/0 外科缝合线 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen，Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| 带翼采血针套件（蝴蝶针）25-30G | BD | 25-30G |
参考文献
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experimen....
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重印与许可
