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方法文章

精准切割肺组织切片作为一种高效工具用于 离体 肺血管结构与收缩性研究

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DOI：

10.3791/62392

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2021年5月24日

 ,  ,  ,  , 
1Divisions of Pulmonary Medicine, Boston Children's Hospital

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于保存小鼠肺切片（PCLS）组织血管收缩功能的方案，可获得肺血管系统和气道的复杂三维图像，且该组织样本的活性可维持长达10天，适用于多种实验操作。

摘要

小鼠肺组织的可视化可提供有关气道和血管系统的宝贵结构与细胞信息。然而，如何保存真正反映生理状态的肺血管仍面临挑战。此外，小鼠肺组织结构精细，导致在制备高质量图像样本时存在技术难题，难以同时保留细胞组成和组织架构。类似地，可通过细胞收缩力检测来研究细胞对血管收缩剂的反应潜能。 体外，但这些检测方法无法重现完整肺部的复杂环境。与这些技术问题相比，精密切割肺组织切片（PCLS）方法可作为一种高效替代方案，用于无区域偏差地三维可视化肺组织，并可作为活体替代性收缩功能模型持续使用长达10天。采用PCLS制备的组织可保持原有的结构和空间取向，非常适合用于疾病过程的研究 离体通过共聚焦显微镜可成功观察从可诱导型tdTomato报告小鼠模型获取的肺切片（PCLS）中内源性tdTomato标记细胞的定位。在暴露于血管收缩剂后，PCLS能够保持血管收缩功能和肺组织结构的完整性，并可通过延时成像模块进行记录。结合其他实验方法（如蛋白质印迹和RNA分析），PCLS有助于全面理解多种疾病背后的信号转导通路，从而加深对肺血管疾病病理生理机制的认识。

引言

在肺组织制备和成像技术方面的进展，能够在不破坏解剖结构的前提下保存细胞组分，从而深入理解肺部疾病。在维持生理结构的同时识别蛋白质、RNA 及其他生物分子的能力，为细胞空间排列提供了关键信息，有助于拓展对多种肺部疾病病理生理机制的认识。当这些精细成像技术应用于动物模型时，可增进对肺血管疾病（如肺动脉高压）的理解，进而有望推动更优治疗策略的开发。

尽管技术不断进步，获取高质量的小鼠肺组织图像仍然是一项挑战。呼吸周期由吸气过程中产生的胸腔内负压驱动1。在传统方法中获取活检样本并制备用于成像的肺组织时，这种负压梯度会丧失，导致气道和血管系统塌陷，无法再反映其真实状态。为了获得能够真实反映当前生理条件的图像，必须重新扩张肺部气道，并灌注血管系统，将动态的肺组织转变为静态的固定结构。应用这些特定技术可保持肺组织的结构完整性、肺血管系统以及包括巨噬细胞在内的各种细胞成分，使肺组织尽可能接近其生理状态地呈现出来。

精密肺切片（PCLS）是研究肺血管解剖学与生理学的理想工具2PCLS 能在保留肺组织结构和细胞成分的同时，提供三维的详细成像。PCLS 已被用于动物和人类模型，以实现对细胞功能的三维活体高分辨率成像，是研究潜在治疗靶点、测量小气道收缩以及探究慢性肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病、间质性肺病和肺癌）病理生理机制的理想工具。3采用类似技术，将PCLS样本暴露于血管收缩剂中可维持肺部结构和血管收缩能力，模拟 体外 条件。在保持收缩功能的同时，若制备得当，所得样本还可用于RNA测序、Western印迹和流式细胞术等后续分析。最后，在肺组织收获后，经tdTomato荧光标记的报告细胞可在制备成微切片后仍保留荧光标记，因此非常适合用于细胞示踪研究。这些技术的整合提供了一个高度精细的模型，能够保留细胞的空间排布和血管的收缩功能，有助于更深入地理解肺血管疾病中的信号级联反应及潜在治疗策略。

在本研究中，将小鼠肺组织的肺切片（PCLS）暴露于血管收缩剂中，显示出其结构完整性和血管收缩功能得以保持。研究表明，经过适当制备和处理的组织可维持活性达10天。该研究还证实了具有内源性荧光（tdTomato）的细胞得以保存，使样本能够提供肺血管系统及肺组织结构的高分辨率图像。最后，本文描述了处理和制备组织切片以进行RNA检测和蛋白质印迹（Western blot）分析的方法，用于探究其潜在机制。

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方案

所有动物护理均遵循波士顿儿童医院及机构动物护理与使用委员会批准的指南。本研究使用的小鼠为野生型 C57/B6 小鼠以及 Cdh5-CreERT2 与 Ai14 tdTomato 杂交的小鼠。

1. 溶液的配制

  1. 提前准备好实验过程中所需的磷酸盐缓冲液（1× PBS）和 2% 琼脂糖溶液。
    1. 将 2 g 琼脂糖粉末加入 100 mL 经高压灭菌的水中。每次用微波炉加热数秒，直至溶液变澄清。
    2. 将溶液置于 42 °C 水浴中，待用。
      ​注意：PBS 和 2% 琼脂糖溶液均可在室温下保存数周。

2. 小鼠肺组织的提取

  1. 通过过量异氟烷处死小鼠。在干燥器下层的滤纸上放置少量异氟烷，并将小鼠置于上层，使其暴露于异氟烷中直至失去意识。
  2. 通过在颈部施加向下的压力并同时向尾部方向牵拉尾巴，确认小鼠死亡。将小鼠转移至解剖台面。
  3. 将小鼠置于仰卧位，并使用胶带将其足爪和鼻部固定在台面上。
  4. 用70%乙醇喷洒小鼠腹侧表面，并擦去多余乙醇。
  5. 用镊子在膀胱位置提起腹部皮肤，沿中线使用手术剪向上剪开至颈部区域，暴露气管。
  6. 用镊子提起下方的筋膜层，并沿中线由下向上剪开，暴露内脏器官和纵隔腔。
  7. 沿中线剪开胸骨，暴露心脏和肺组织。
  8. 使用钝性解剖法将膈肌从肝脏和腹腔中分离。
  9. 在肠道下方定位下腔静脉（IVC），并将其剪断。
  10. 定位右心室。
    注意：右心室颜色较左心室浅，应可见室间隔，将右心室与左心室分隔开。
  11. 使用25–30 G蝶形针向右心室注射0.5 mL 1%低分子肝素，随后以10–15 mL 1× PBS缓慢而稳定地灌注（图1A）。
    1. 注意避免将针头穿透心脏，导致肝素注入纵隔腔。
      注意：1× PBS灌注后，肺组织会变为白色。腹主动脉流出的液体应清澈无色，成功灌注后肝脏外观可能变白。
  12. 定位喉部，使用钝头镊子剥离周围筋膜和组织。
  13. 将手术缝线穿过气管下方，并松散地打一个外科结。
  14. 在缝线头端上方的气管壁上刺一小孔，插入20 G钝头针进行插管。
  15. 使用外科结将缝线在针头和气管周围扎紧。
  16. 向气管内注入2.5–4 mL琼脂糖，并观察肺组织膨胀情况。
  17. 注入琼脂糖后，将冷的、预冷的1× PBS倒在肺组织上，以促进琼脂糖凝固。
  18. 在手术缝线上方剪断气管，通过去除所有粘连和筋膜组织，将肺和心脏从纵隔中完整解剖下来。
  19. 琼脂糖完全凝固后，将组织置于盛有1× DMEM（足以浸没组织）的培养皿中并保持在冰上。立即使用振动切片机切取一个肺叶进行切片（图1B）。

3. 精密切割肺组织片

  1. 使用超级胶水将样本固定在平台上，确保样本的内侧朝上。
  2. 用1×PBS填充样本容器，确保样本完全浸没。
  3. 在样本容器周围的容器中加入冰块，以保持周围PBS和样本处于低温状态。
  4. 打开振动切片机，并调整至以下所需设置：
    1. 设置切片厚度为300 µm。
    2. 设置频率为100 Hz。
    3. 设置振幅为0.6 mm。
    4. 设置切片速度为5 µm/s。
  5. 使用内六角扳手将刀片架转至安全位置，并打开夹爪以插入刀片。
  6. 用内六角扳手拧紧夹爪，并将刀片架转至适合切片的位置。
  7. 将样本及平台放入切片盒中，并滑动至刀片前方。
  8. 在样本平台周围的切片盒中加入1×PBS，直至样本完全浸没。
  9. 将振动切片机的刀片移至组织块边缘，并手动降低刀片，使其与样本顶部齐平。
  10. 确认设置无误后，启动振动切片机（图2）。
  11. 每当切出新片时，将切片从PBS中取出，并转移至含有10 mL含1×抗生素-抗真菌剂的1×DMEM的无菌培养皿中。
  12. 操作完成后，先将刀片完全缩回，再使用内六角扳手将刀片升至安全位置。
  13. 将样本保存在1×DMEM中，置于37 °C培养箱内，可维持活性长达10天（见下文活性实验）。

4. 血管收缩剂实验示例

  1. 将振动切片机切片放置在显微镜载玻片上。
  2. 在将切片置于载玻片之前，使用清洁擦拭纸去除多余的培养基（PBS）。
  3. 将样品置于相差显微镜下，使用10–20倍放大倍数识别血管。
  4. 加入500 µL血管收缩剂（如60 mM KCl或1 µM Endothelin-1），完全浸没载玻片。
  5. 观察并录制30秒至60秒的视频（视频 1）。

5. 在PCLS上进行RNA或蛋白质裂解的组织准备

  1. 实验开始前，用1升液氮填充一个小型聚苯乙烯泡沫箱。
  2. 开始实验前，将两个小型微量离心管（1.5 mL）放入盛有液氮的容器中。
    注意：液氮应冷却管外壁，但不可进入管内。操作液氮时务必小心，避免皮肤接触液氮。使用镊子和手套将离心管放入或取出容器。
  3. 将4–5片新鲜的振动切片放入研钵中。
  4. 向研钵中的切片上倒入5–10 mL液氮。
  5. 在液氮蒸发前，迅速用研杵将瞬间冷冻的组织研磨成粉末。
    注意：组织应被研磨成细粉。若未达到该状态，可继续添加液氮直至实现。
  6. 使用经液氮预冷的不锈钢实验铲，将粉末转移至两个已预冷的微量离心管中。
  7. 通过加入500 µL RNA提取试剂以进行RNA提取，或加入500 µL RIPA裂解缓冲液（含1x蛋白酶抑制剂）以进行蛋白裂解，从而裂解粉末样品。
  8. 将样品储存于-80 °C，待后续进行RNA提取、BCA蛋白浓度测定及蛋白质印迹（Western blot）分析。

6. 确定细胞活力

  1. 使用振动切片机制备后，将两片肺组织放入24孔培养板中，加入450 µL DMEM培养基和50 µL细胞活力试剂（确保组织完全浸没）。
  2. 将样品放回37 °C、5% CO2培养箱中过夜，尽量避免光照。
  3. 次日早晨，观察溶液颜色变化。当组织具有活性时，蓝色溶液会变为粉红色。

7. 细胞标记的保存

  1. 对转基因 Cdh5-CreERT2 与 Ai14 tdTomato 小鼠进行腹腔注射他莫昔芬（2 mg/天），连续注射 5 天（总剂量为 10 mg 他莫昔芬），以诱导 tdTomato 标记 Cre 阳性细胞。
  2. 注射后一周，按照上述步骤 1 至 3 制备肺组织。
  3. 制备好精密切割肺切片后，将组织置于显微镜载玻片上，并在组织上覆盖盖玻片。
  4. 使用共聚焦显微镜检测 tdTomato 荧光信号（激发波长 555 nm）。

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结果

当加入细胞或组织后，活力检测试剂会被活体组织的还原性环境修饰，颜色变为粉红色/红色，并产生强烈的荧光。第0-1天和第9-10天检测到的典型颜色变化如图3所示。如图所示，溶液初始为蓝色，过夜后转变为粉红色，表明组织具有活力。颜色变化通常在1–4小时内发生；但有时可能需要更长时间。为检测组织活力，使用酶标仪测定振动切片机制备的样本以及4%多聚甲醛（PFA）固定的肺组织切片（作为对照）的吸光度。按照试剂生产商的建议，读取样本孵育溶液在562 nm和630 nm波长处的吸光度值。振动切片机制备的组织在每日562 nm与630 nm波长下的吸光度差值及其与对照组织的比较结果如图3所示。

为展示振动切片机制备的肺组织的收缩性，将一块新鲜组织置于400倍明场显微镜下，并用KCl或内皮素-1处理，直至组织完全浸没。对组织进行30-60秒的录像，可观察到血管结构的收缩（视频1）。

为了验证在注...

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讨论

本文描述了一种改进的方法，用于制备可保留血管结构并优化实验灵活性的小鼠肺组织高分辨率图像，特别是通过应用肺切片（PCLS）技术获取可在三维视野下观察且保留血管收缩功能的肺组织微切片。利用细胞活力检测试剂，本方案证明了经过仔细制备和保存的组织切片其活力可维持超过一周。微切片活力的保留使得可在同一组织样本上对血管和气道结构进行多次及长期的实验，使其成为测试多种药物离体（ex vivo）反应、评估潜在分子机制以及筛选试剂的理想样本4。该样本因此成为在活体（in vivo）试验前研究潜在治疗手段对血管张力影响的理想平台。由于肺气道和血管结构得以完整保存，制备好的样本可进一步应用于其他技术，例如本文所述及表1中总结的收缩功能检测。这为获取详细描绘肺血管空间排列结构及信号转导级联反应的高分辨率图像提供了可能，有助于阐明肺血管疾病的发病机制。

用于实验的组织微切片制备技术利用振动切片机（vibratome）或振动刀片来制备精确切割的器官型切片，与传统技术相比，该方法可提高准确性和...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨此感谢袁浩博士和刘凯峰博士提供的技术支持。本研究工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）1R01 HL150106-01A1项目、Parker B. Francis 奖学金以及肺动脉高压协会Aldrighetti研究奖对袁克博士的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
注射器中的0.5 cc分离肝素BD每毫升100 USP单位
1X PBS康宁 21-040-CM
用于气管插管的20½英寸钝端套管针Cml 供应90120050D
30 cc 注射器BD309650
抗抗溶液Gibco15240096
自动振动切片机LeicaVT1200S
细胞活力检测试剂（alamarBlue）赛默飞世尔科技DAL1025
共聚焦显微镜Zeiss880
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基（Modified Eagle Medium）和谷氨酰胺最大补充剂（GLutaMAX），添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep）Gibco10569-010
内皮素-1SigmaE7764
KClSigma7447-40-7
研钵和研杵亚马逊
RIPA 裂解和提取缓冲液赛默飞世尔科技89900
6/0 外科缝合线FST18020-60
TRIzol试剂Invitrogen，Thermofisher15596026
UltraPure 低熔点琼脂糖Invitrogen16520050
VibratomeLeica BiosystemsVT1200 S
带翼采血针套件（蝴蝶针）25-30GBD25-30G

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