方法文章

研究细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9活性的定量方法

DOI：

10.3791/62418

⸱

2021年8月7日

 ,  , 
1Structural Genomics Consortium, University of Toronto, 2Department of Pharmacology and Toxicology, University of Toronto

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些方案提供了在细胞中评估蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMT）家族各个成员酶活性的方法学。文中详细描述了利用内源性和外源性生物标志物、识别甲基化精氨酸的抗体以及抑制剂工具化合物来评估PRMT活性的具体操作指南。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质甲基转移酶（PRMTs）催化甲基基团转移到底物蛋白的精氨酸残基上。PRMT家族包含九个成员，能够对精氨酸残基进行单甲基化或对称性/非对称性二甲基化。目前已有多种可识别不同蛋白精氨酸甲基化类型的抗体，为开发PRMT活性生物标志物检测方法提供了工具。由于底物存在重叠以及抗体识别具有序列基序特异性，基于PRMT抗体的检测方法面临挑战。本文讨论了这些技术难题以及用于研究各单个PRMT所介导精氨酸甲基化的实验设计。通过精心选择可作为九种PRMT中八种代表性生物标志物的底物，设计出一套PRMT活性检测 panel。本文报道了在细胞中定量测定PRMT家族各成员酶活性的细胞检测方案。所述方法的优势在于，任何具备细胞培养和荧光Western印迹能力的实验室均可简便地开展这些实验。通过基因敲低和过表达策略，已充分验证了所选底物的特异性和抗体的可靠性。除详细说明检测所用生物标志物和抗体外，本文还提供了PRMT抑制剂工具化合物库的使用信息。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

精氨酸甲基化是一种重要的翻译后修饰，可调控蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA相互作用，因此在多种细胞过程中发挥关键作用，如前体mRNA剪接、DNA损伤、转录应答以及生长因子介导的信号转导1,2。精氨酸由蛋白质精氨酸甲基转移酶（PRMTs）催化发生甲基化，生成单甲基精氨酸（Rme1）、不对称二甲基精氨酸（Rme2a）或对称二甲基精氨酸（Rme2s）3。根据甲基化类型的不同，PRMTs可分为三类：I型（PRMT1、2、3、4、6和8），催化单甲基化和不对称二甲基化；II型（PRMT5和PRMT9），催化单甲基化和对称二甲基化；III型（PRMT7），仅能催化精氨酸的单甲基化3。

由于市面上可获得的精氨酸甲基化特异性抗体数量不断增加，因此可以通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测PRMT活性。与化学发光检测相比，基于荧光的蛋白质印迹技术具有更宽的动态范围和更好的线性、更高的灵敏度，并支持多重检测，因此更受青睐4。为了定量蛋白质甲基化水平，需要将甲基化信号归一化至总蛋白水平。通过选择针对总蛋白和甲基化蛋白、且由不同宿主物种产生的抗体（例如小鼠源和兔源抗体），可使用不同荧光标记的二抗，从而在同一蛋白条带中同时检测两种抗体的信号。开发甲基化精氨酸抗体的目的是识别和表征单甲基化、不对称二甲基化或对称二甲基化的蛋白质，其中甲基化精氨酸出现在特定序列背景下。由于大多数PRMTs在其底物中甲基化富含甘氨酸和精氨酸的基序5，因此已研制出多种针对含有单甲基精氨酸或不对称、对称二甲基精氨酸-甘氨酸重复序列的多肽的抗体，例如D5A12、ASYM24或ASYM25以及SYM11。此外，还有一些甲基化精氨酸抗体是基于包含在重复序列背景下的不对称二甲基、对称二甲基及单甲基精氨酸的多肽文库而制备的，有助于在特定序列环境中检测甲基化精氨酸6。目前还出现了越来越多能够识别单一蛋白质上特定精氨酸修饰位点的抗体，从而实现对特定甲基化事件的选择性检测，例如组蛋白H4R3me2a或BAF155-R1064me2a。

目前有多种市售的PRMT抑制剂，可作为PRMT细胞实验的工具。然而，并非所有抑制剂的选择性和脱靶效应都经过充分表征，部分抑制剂应谨慎使用。结构基因组联盟（Structural Genomic Consortium）与学术实验室及制药合作伙伴共同开发了一系列特性明确、高效、具有选择性且可穿透细胞膜的PRMT抑制剂（化学探针），可供科学界无限制地使用。有关这些抑制剂的信息可参见 https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics 和 https://www.chemicalprobes.org/。 化学探针是一类小分子抑制剂，其 体外 IC50 或 Kd < 100 nM，对同一家族蛋白具有30倍以上的选择性，并在1 µM浓度下表现出显著的细胞活性。此外，每种化学探针均配有一个结构相近但对目标蛋白无活性的化学类似物7,8,9,10,11,12。

本实验方案的目的是利用荧光 Western blot 方法测定各个 PRMT 家族成员的细胞活性。本文提供了经过验证的检测生物标志物、抗体、强效细胞活性抑制剂的详细信息，以及成功实施该检测的宝贵策略。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 细胞培养与接种

注意：使用推荐的培养基培养细胞，并定期检测支原体污染。选择 HEK293T、MCF7 和 C2C12 细胞作为示例，因为这些细胞系已在 PRMT 检测中成功应用。

  1. 在添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素（100 U mL−1）和链霉素（100 µg mL−1）的DMEM培养基中，于10 cm组织培养处理（TC）培养皿中培养HEK293T、MCF7和C2C12细胞。
  2. 对于PRMT8检测，将可诱导PRMT1敲低的HEK293T细胞在含有强力霉素（2 µg/mL）的培养基中培养3天，然后开始检测。
  3. 接种细胞时，从培养皿中移除并弃去原有培养基。
  4. 加入10 mL不含Ca+2和Mg+2离子的PBS洗涤细胞，随后弃去溶液。
  5. 加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，在室温（RT）孵育1分钟，然后弃去溶液。继续孵育直至细胞变圆并从培养皿表面脱落。如有需要，轻敲培养皿以帮助细胞脱落。对于较难消化的细胞（如C2C12），可在37 °C孵育1–2分钟。
    注意：避免细胞长时间暴露于胰蛋白酶溶液中（>10分钟），以免降低细胞活力。
  6. 向培养皿中加入1 mL预热的培养基，轻轻吹打细胞以分散细胞团块。将细胞转移至15 mL离心管中，并加入3–5 mL培养基。
  7. 为测定细胞数量，取10 µL细胞悬液与10 µL台盼蓝混合，取10 µL混合液加入血细胞计数板，或采用其他细胞计数方法进行计数。
  8. 将细胞稀释至推荐的细胞密度，每孔加入500 µL至24孔组织培养板（表1）。对于内源性检测（PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7和PRMT9），进入步骤3.1。

2. 细胞转染

  1. 对于外源性检测（PRMT3、PRMT6、PRMT8），使用推荐量的DNA（表2）转染HEK293T细胞。HEK293T细胞易于转染，因此可使用任何转染试剂，并遵循制造商的说明进行操作。

3. 化合物处理

注意：培养基中最终二甲基亚砜（DMSO）浓度不得超过0.1%。每个孔中的DMSO浓度应保持一致。选择性PRMT抑制剂（化学探针）及其密切相关的无活性类似物见表3。

  1. 对于内源性检测（PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7 和 PRMT9），移除细胞培养基，并替换为含化合物或仅含 DMSO（对照）的 500 µL 培养基。
    注意：通常需要 2 天时间才能观察到 R 甲基化水平下降超过 80%。
  2. 对于外源性检测（PRMT3、PRMT6、PRMT8），转染后 4 小时移除培养基，加入含化合物或仅含 DMSO（对照）的 500 µL 培养基，并继续培养 20–24 小时。

4. 细胞裂解液的制备

  1. 吸去各孔中的全部培养基，用 100 µL PBS 洗涤以去除残留的培养基，然后每孔加入 60 µL 裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl pH 8，150 mM NaCl，1 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），10 mM MgCl2，0.5% Triton X-100，12.5 U mL−1 苯甲酸酶，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物），进行裂解。
    1. 室温孵育不超过 1 分钟，轻轻摇动培养板使裂解缓冲液均匀覆盖细胞。然后加入 3 µL 20% w/v 十二烷基硫酸钠（SDS），使终浓度为 1%，并通过轻柔振荡混匀。将裂解液转移至微量离心管中，并置于冰上保存。
      注意：苯甲酸酶和蛋白酶抑制剂混合物需在使用前新鲜加入。苯甲酸酶的加入可快速水解核酸，从而降低细胞裂解液的黏度。
  2. 使用 BCA 蛋白定量检测试剂盒或其他可耐受溶液中 1% SDS 的方法测定样品的蛋白浓度。
    1. 取 2 µL 裂解液及蛋白标准品（在裂解缓冲液中配制的 0、1、2、4 和 8 µg/mL BSA）加入 96 孔透明板的各孔中。
    2. 将试剂 A 与试剂 B 按 50:1 的比例混合，每孔加入 200 µL。在 37 °C 孵育 20 分钟后测定吸光度。
  3. 用裂解缓冲液调整各样品的蛋白浓度，使其保持一致。
  4. 向 60 µL 细胞裂解液中加入 20 µL 4x 上样缓冲液，在 95 °C 加热 5 分钟。热变性处理后，裂解液可保存于 -20 °C。

5. 蛋白质印迹分析

  1. 将5-20 µg总细胞裂解液用于组蛋白分析，20-100 µg用于其他蛋白质分析，上样至4-12% Bis-Tris蛋白凝胶中。
  2. 在MOPS SDS电泳缓冲液（50 mM MOPS，50 mM Tris碱，0.1% w/v SDS，1 mM EDTA，pH 7.7）中以100 V电压电泳约2小时，或直至染料前沿迁移至凝胶底部。
  3. 若进行湿转法，需在冰冻的Tris-甘氨酸转膜缓冲液（25 mM Tris，192 mM 甘氨酸，20% v/v 甲醇，0.05% w/v SDS）中组装转膜“三明治”结构。
    1. 按照制造商说明放置海绵、滤纸、PVDF膜和凝胶。使用前将PVDF膜浸入甲醇中活化，并将凝胶在转膜缓冲液中平衡30秒。
      注意：建议使用推荐的PVDF Western印迹膜，因其具有低自发荧光特性，并适用于组蛋白等低分子量蛋白质（材料表）。
  4. 在冰上以70 V电压，在Tris-甘氨酸转膜缓冲液中将蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，持续1.5小时。
  5. 用封闭缓冲液（含5% w/v脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液PBS）封闭膜30分钟。用洗涤缓冲液（PBST：含0.1% v/v Tween-20的PBS）冲洗后，在牛血清白蛋白（BSA）溶液 （含5% BSA的PBST）中加入一抗，4 °C孵育过夜（表3）。
    注意：如需长期保存，应对BSA溶液进行过滤除菌，添加0.02% w/v叠氮化钠，并于4 °C保存。
  6. 用PBST洗涤膜3次，每次5分钟。随后在推荐的封闭缓冲液中加入山羊抗兔（IR800）和驴抗小鼠（IR680）二抗，在室温下孵育30分钟，再用PBST洗涤3次，每次5分钟（材料表，表3）。
  7. 使用荧光Western印迹成像仪在800 nm和700 nm波长下读取信号。建议选用能够以高灵敏度和宽动态范围清晰成像强弱信号条带、具备高信噪比、在图像饱和时发出警告，并支持在同一蛋白条带中进行两种荧光颜色多重检测的仪器。
  8. 使用适用于荧光Western印迹成像的软件分析条带强度。

结果

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以下展示了针对单个PRMT的细胞实验中Western印迹结果的示例。表4中也总结了实验的详细信息。

PRMT1 活性检测
PRMT1 是细胞内组蛋白 H4 第3位精氨酸不对称二甲基化（H4R3me2a）的主要催化酶13。当 PRMT1 活性丧失时，细胞内全局的 Rme1 和 Rme2s 水平显著升高13。如图1A和1B所示，可使用多种抗体来检测 Rme1、Rme2a、Rme2s 以及 H4R3me2a 的全局变化。PRMT1 沉默3天后，可观察到全局 Rme2a 和 H4R3me2a 水平显著降低，而 Rme1 和 Rme2s 水平升高（图1A、1B）。不同细胞系的基础 H4R3me2a 信号水平存在差异，因此为便于监测 PRMT1 活性丧失，可选用基础甲基化水平较高的细胞系（如 MCF7 细胞系）进行实验（图1C）。观察 PRMT1 抑制效果的最佳时间，例如使用 I 型 PRMT 抑制剂 MS0238 处理后，为2天（图1D、1E）。更长时间的处理会导致细胞活力和生长能力下降。

PRMT3 活性检测
对于PRMT3细胞实验，尚无选择性生物标志物蛋白可在Western blot中检测到其甲基化水平的变化 PRMT3 敲低或过表达。PRMT3 被证明可对 H4R3 进行不对称二甲基化修饰。 体外14然而，该修饰主要由PRMT1催化完成，因此设计了PRMT3过表达的外源性实验。结果与 体外 研究结果表明，野生型PRMT3的过表达会导致H4R3me2a水平升高，而其催化失活突变体（E338Q）则无此效应（图2A）。由于HEK293T细胞对该修饰标记具有较低的基础甲基化水平，因此被选用（图1C）。该检测方法进一步通过PRMT3选择性抑制剂SGC707进行了验证。7，这抑制了PRMT3依赖的H4R3不对称甲基化（图2B).

PRMT4 活性检测
PRMT4 在精氨酸 1064 位点对 BAF155 进行不对称二甲基化修饰15。由于可特异性识别 BAF165-R1064me2a 的抗体已有商业化产品，因此可通过 Western 印迹检测 R1064me2a 修饰水平的变化来监测细胞中 PRMT4 的活性。当 PRMT4 蛋白缺失或使用 PRMT4 特异性抑制剂 TP-06410抑制其催化活性时，BAF165-R1064me2a 水平会下降（图 3）。通常经过 2 天的处理即可基本消除甲基化信号。

PRMT5 活性检测
PRMT5 负责大多数蛋白质精氨酸的对称性二甲基化修饰。已有文献报道，多种 SMN 复合物蛋白（包括 SmBB'）均为 PRMT5 的底物16。可通过检测整体精氨酸对称性二甲基化水平或 SmBB' 蛋白的对称性二甲基化变化来监测 PRMT5 的活性。敲低PRMT5 基因会导致整体 Rme2s 水平下降，而敲低PRMT1、3、4、6 和 7 则不会产生此效应（图 4A）。在大多数细胞系中，使用 PRMT5 特异性抑制剂 LLY-28311 和 GSK591 处理细胞 2–3 天，可显著抑制 SmBB'Rme2s 信号（图 4B）。多数细胞对 PRMT5 抑制敏感，长期暴露于抑制剂会导致细胞增殖减缓和细胞死亡。

PRMT6 活性检测
已有报道指出，PRMT6 是细胞内组蛋白 H3 精氨酸 2 位不对称二甲基化（H3R2me2a）的主要催化酶17。在 HEK293T 细胞中，敲低 PRMT6 3 天不足以观察到 H3R2me2a 水平的显著下降。然而，野生型 PRMT6 的过表达可提高 H3R2me2a 水平，同时也增加 H3R8me2a 和 H4R3me2a 水平，而其催化失活突变体（V86K/D88A）则无此效应（图 5A）。目前已发现多种对 PRMT6 活性具有不同效力和选择性的抑制剂：选择性变构 PRMT6 抑制剂 SGC687018、I 型 PRMT 抑制剂 MS0238，以及 PRMT4/6 抑制剂 MS0499。这些抑制剂均可抑制 PRMT6 依赖性的 H3R2 不对称二甲基化（图 5B），同时也抑制 H4R3 和 H3R8 的不对称二甲基化（数据未显示）。

PRMT7 检测
PRMT7 对HSP70的组成型和诱导型（分别为HSPA8和HSPA1/6）中的精氨酸469均进行单甲基化修饰12尽管目前尚无商业化的抗体可用于检测HSP70-R469me1水平，但该修饰位点可利用广谱单甲基化抗体进行检测。通过缺失PRMT7蛋白或使用PRMT7特异性抑制剂SGC3027抑制其催化活性12，导致 HSP70-R469me1 水平降低（图6A，BSGC3027 是一种可穿透细胞膜的前体药物，在细胞内经还原酶转化为PRMT7选择性抑制剂SGC8158，因此其细胞活性在不同细胞系中可能存在差异。多种癌细胞系高水平表达可诱导的HSP70同工型，且由于存在核源性的非特异性条带干扰，甲基化信号可能难以检测图6C因此，对于PRMT7细胞实验，建议使用主要表达HSPA8的细胞系（如C2C12），或者由于HSP70主要定位于细胞质，可检测首选细胞系胞质组分中的HSP70-R469me1水平。

PRMT8 检测
PRMT8 是唯一具有组织特异性表达模式的 PRMT，主要在脑组织中表达19其序列相似性达80%，且底物偏好性与PRMT1相似19与PRMT1主要在N端存在差异，其中豆蔻酰化导致PRMT8与质膜结合20据报道，PRMT8 与 PRMT1 共同甲基化 RNA 结合蛋白 EWS21由于PRMT8在非神经元细胞系中的活性较低，而EWS也可被PRMT1甲基化，因此需采用共表达PRMT8与EWS的检测方法 PRMT1 敲低细胞系已建立。由于 PRMT1 是一个必需基因，其长期缺失会导致细胞死亡，因此需要一个可诱导的系统，在该系统中 PRMT1 在用于PRMT8检测前，已将其敲低3天（图7A）。与EWS共同表达野生型PRMT8可导致EWS的不对称二甲基化水平升高，而催化失活突变体（E185Q）则无此效应图7B）。测试了多种不对称二甲基精氨酸抗体，只有Asym25抗体可检测到甲基化。该检测进一步使用PRMT I型选择性化学探针MS023进行了验证8，这降低了PRMT8依赖性的外源性EWS的不对称二甲基化图7B）。尽管 MS023 在抑制 PRMT8 方面效力很强 体外 在细胞中，需要高浓度的 MS023 才能观察到甲基化抑制作用21.

PRMT9 检测
PRMT9 被证明可在精氨酸508位点对 SAP145 进行对称性二甲基化修饰22遗憾的是，目前尚无商业化的抗体能够识别该标记。在PRMT9检测实验中，使用了由希望之城医疗中心贝克曼研究所Yanzhong Yang博士慷慨提供的抗体。当过表达时，野生型SAP145可被PRMT9甲基化，而R508K突变型SAP145则不能图 8A）。该检测旨在监测内源性SAP145-R508me2s的水平，并使用化合物X（一种原型PRMT9抑制剂，研究进行中，尚未发表）进行了验证，该化合物可有效抑制PRMT9 体外 具有纳摩尔级效力。化合物X以剂量依赖性方式降低SAP145-R508me2s水平（图8B).

蛋白质表达与修饰分析；Western blot结果；siRNA效应；PRMT1作用；H4R3me2a检测。
图1。PRMT1细胞实验。（A）PRMT1基因敲低导致全细胞非对称性精氨酸双甲基化（Rme2a）水平降低，同时对称性精氨酸双甲基化（Rme2s）和单甲基化（Rme1）水平升高。PRMT1敲低效率见B图。（B）PRMT1敲低降低了组蛋白H4R3的非对称双甲基化（H4R3me2a）水平。（C）不同细胞系中基础H4R3me2a水平存在差异。（D）I型PRMT抑制剂MS023以剂量依赖方式降低H4R3me2a水平。MCF7细胞用MS023处理2天。（E）该图显示了H4R3me2a信号强度经总组蛋白H4归一化后的非线性拟合结果。MS023的IC50为8.3 nM（n=1）。请点击此处查看该图的放大版本。

显示H4R3me2a表达的Western印迹；PRMT3对组蛋白修饰的影响，重叠分析。
图2．PRMT3细胞实验。（A）在HEK293T细胞中，野生型（WT）PRMT3的过表达可提高H4R3me2a水平，而其E338Q催化突变体则无此效应。细胞转染FLAG标签标记的PRMT3持续24小时。（B）PRMT3选择性抑制剂SGC707可降低异位表达的PRMT3依赖性H4R3不对称去甲基化。请点击此处查看该图的放大版本。

BAF155-R1064me2a 分析；siRNA，PRMT4 影响；Western 印迹结果，蛋白质表达研究。
图 3。PRMT4 细胞实验。（A）PRMT4 沉默导致 BAF155-R1064 非对称性精氨酸二甲基化水平降低（HEK293T 细胞）。（B）PRMT4 特异性抑制剂 TP-064 降低 BAF155-R1064Rme2a 水平。HEK293T 细胞用化合物处理 2 天。请点击此处查看此图的放大版本。

siRNA 分析；Western 印迹；PRMT 抑制；蛋白质表达水平；荧光成像分析。
图 4．PRMT5 细胞实验。 （A）PRMT5 基因敲低导致整体对称性精氨酸二甲基化水平下降（MCF7 细胞）。（B）PRMT5 特异性抑制剂 GSK591 和 LLY-283 降低 SmBB' 的对称性精氨酸二甲基化信号（绿色），而 SmBB' 总体水平保持不变（红色）。MCF7 细胞用化合物处理 2 天。请点击此处查看该图的放大版本。

PRMT6 甲基化分析，显示组蛋白修饰中H3和H4重叠的Western印迹图。
图 5．PRMT6 细胞实验。 （A）在HEK293T细胞中，野生型（WT）PRMT6的过表达可提高H4R3me2a、H3R2me2a和H3R8me2a水平，而V86K/D88A催化失活突变体则无此效应。细胞转染带FLAG标签的PRMT6持续24小时。（B）PRMT6选择性抑制剂（SGC6870）、I型PRMT抑制剂（MS023）以及PRMT4/6抑制剂（MS049）均可降低PRMT6依赖性的H3R2me2a水平。请点击此处查看该图的放大版本。

PRMT7基因敲除实验；蛋白质印迹分析；HSP70与Rme1；荧光重叠。
图6．PRMT7细胞实验。（A）PRMT7基因敲除导致HSP70-R469单甲基化水平降低（HCT116细胞）。（B）PRMT7选择性抑制剂SGC3027可降低C2C12细胞中HSP70-R469的单甲基化水平。细胞用化合物处理2天。（C）由于存在核来源的非特异性条带干扰，使用广谱单甲基化精氨酸抗体（Rme1）检测可诱导型HSP70（HSPA1/6）的HSP70-R469甲基化可能较为困难。建议在细胞质组分中检测HSP70的甲基化水平。请点击此处查看该图的放大版本。

Western blot 实验；PRMT1、β-actin 表达；条件：阿霉素处理；荧光检测。
图 7．PRMT8 细胞检测。（A）当 PRMT1 活性通过敲低被抑制时，可检测到 PRMT8 对 EWS 的甲基化。HEK293T 细胞被转导携带可诱导的 PRMT1 敲低载体。经多西环素处理 3 天后，PRMT1 水平显著降低。（B）当 PRMT1 被敲低时，外源性 EWS 可被过表达的野生型 PRMT8 而非催化失活突变体（E185Q）进行不对称二甲基化。该甲基化可被高浓度的 I 型 PRMT 抑制剂（MS023）所抑制。HEK293T PRMT1KD 细胞共转染了带 FLAG 标签的野生型或催化突变型 PRMT8 以及带 GFP 标签的 EWS，并用 MS023 处理 20 小时。请点击此处查看该图的放大版本。

SAP145蛋白与化合物X结合的荧光显微分析，显示GFP重叠。
图8．PRMT9细胞实验。（A）野生型SAP145可被PRMT9甲基化，而R508K突变型SAP145则不能。HEK293T细胞转染GFP标记的SAP145表达质粒，培养1天。（B）原型PRMT9抑制剂（化合物X）以剂量依赖方式减少SAP145在R508位点由PRMT9介导的对称性二甲基化。HEK293T细胞用该化合物处理2天。请点击此处查看该图的放大版本。

PRMT细胞每毫升密度
PRMT1MCF71 x 105
PRMT3HEK293T2 x 105
PRMT4HEK293T1 x 105
PRMT5MCF71 x 105
PRMT6HEK293T2 x 105
PRMT7C2C121 x 105
PRMT8HEK293T (PRMT1 KD)*2 x 105
PRMT9HEK293T2 x 105
*进行PRMT8检测前3天，用多西环素（2 µg/mL）处理细胞

表1. PRMT活性测定推荐的细胞类型及密度。

PRMT每24孔板加入的DNA量（µg）Addgene编号附加说明
PRMT30.5 FLAG-PRMT3164695
或 0.5 FLAG-PRMT3 (E338Q)164696
PRMT60.5 FLAG-PRMT6164697
或 0.5 FLAG-PRMT6(V86K/D88A)164698
PRMT80.05 EWS-GFP164701
0.45 PRMT8-FLAG164699
或 0.45 PRMT8(E185Q)-FLAG164700
PRMT90.05 SAP145-GFPNA由希望之城医疗中心贝克曼研究所Yanzhong Yang博士惠赠
或 0.05 SAP145-R508K-GFP
0.45 空载体

表2. 转染实验推荐的DNA浓度。

PRMT抗体化学探针（细胞活性 IC50）阴性对照
PRMT1H4R3me2a (1:2000)MS023 -PRMT I型MS094
Rme1 (1:1000)(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM，分别)
Rme2s (1:2000)
Rme2a (1:2000)
Rme2a (ASYM24, 1:3000)
Rme2a (ASYM25, 1:2000)
H4 (1:2000)
B-actin (1:500 )
PRMT3H4 (1:2000)SGC707 (IC50 = 91 nM)XY-1
H4R3me2a (1:2000)
FLAG (1:5000)
PRMT4BAF155 (1:200)TP-064 (IC50 = 43 nM)TP064N
BAF155-R1064me2a (1:3000)SKI-73 (IC50 = 540 nM)*SKI-73N*
PRMT5anti-SmBB’ (1:100)LLY-283 (IC50 = 30 nM)LLY-284
Rme2s (#13222, 1:2000)GSK591 (IC50 = 56 nM)SGC2096
PRMT6H4R3me2a (1:2000)SGC6870 (IC50 = 0.9 µM)SGC6870N
H4 (1:2000)MS023 -PRMT I型MS094
H3R2me2a (1:2000)(PRMT1, PRMT6, PRMT3, PRMT4 IC50 = 9, 56, 1000, 5000 nM，分别)
H3R8me2a (1:2000)MS049 (PRMT4, 6 IC50 = 970, 1400 nM，分别)MS049N
H3 (1:5000)
FLAG (1:5000)
PRMT7Rme1 (1:1000)SGC3027 (IC50 = 1300 nM) *SGC3027N*
Hsp/Hsc70 (1:2000)*
PRMT8GFP (1:3000)MS023 (50 µM)MS094
Rme2a (ASYM25, 1:2000)
FLAG (1:5000)
PRMT9SAP145 (1:1000)
SAP145-R508me2s -由希望之城贝克曼研究所Yanzhong Yang博士惠赠 (1:1000) (PIMID: 25737013)
二抗山羊抗兔IgG-IR800 (1:5000)
驴抗鼠IgG-IR680 (1:5000)
* - 抗体识别HSPA8、HSPA1和HSPA6（通过过表达GFP标记蛋白验证），*前药——IC50在不同细胞系中可能有所差异

表3. 推荐的抗体及PRMT化学探针/阴性对照工具化合物。

PRMT生物标志物检测读数检测验证推荐细胞系参考文献
PRMT1H4R3me2a, Rme1, Rme2s, Rme2aH4R3me2a 水平标准化至总 H4，全局 Rme1、Rme2a 或 Rme2s 水平标准化至 B-actin。敲低 PRMT1 会降低细胞中基础 H4R3me2a 和全局 Rme2a 水平，并升高全局 Rme1 和 Rme2s 水平（图 1A、B）。I 型 PRMT 化学探针 MS023 以剂量依赖方式降低 H4R3me2a 水平（图 1D）。不同细胞的基础 H4R3me2a 水平存在差异（图 1C）。MCF7 细胞具有较高的基础 H4R3me2a 水平，因此更适合用于监测 PRMT1 活性下降的实验。8
PRMT3H4R3me2a外源性 FLAG 标签 PRMT3 野生型或催化失活突变体（E338Q）引起的 H4R3me2a 甲基化水平，标准化至总组蛋白 H4过表达野生型 PRMT3 可增加 H4R3me2a 水平，而其催化突变体（E338Q）则无此效应（图 2A）。PRMT3 选择性抑制剂 SGC707 可降低 PRMT3 依赖的 H4R3me2a 水平升高（图 2B）HEK293T 细胞的基础 H4R3me2a 水平较低（图 1C），适合用于监测外源性 PRMT3 活性7
PRMT4BAF155-R1064me2aBAF155-R1064me2a 水平标准化至总 BAF155敲低 PRMT4 可降低 BAF155 的不对称二甲基化水平（图 3A）。使用 PRMT4 选择性化学探针（TP-064）处理 2 天可降低 BAF155 的不对称二甲基化水平（图 3B）任何细胞系10
PRMT5SmBB’-Rme2s使用泛 Rme2s 抗体（CST）检测 SmBB’-Rme2s 水平，标准化至总 SmBB’敲低 PRMT5 导致 SmBB’ 对称二甲基化水平降低（图 4A）。使用 PRMT5 选择性化学探针 GSK591 和 LLY285 处理 2 天可降低 SmBB’-Rme2s 水平（图 4B）任何细胞系11
PRMT6H4R3me2a
H3R2me2a
H3R8me2a		外源性 FLAG 标签 PRMT6 野生型可提高 H4R3me2a、H3R2me2a 或 H3R8me2a 甲基化水平，而催化失活突变体（V86K,D88A）则无此效应，分别标准化至总组蛋白 H4 或 H3过表达野生型 PRMT6 可升高 H3R2me2a、H3R8me2a 和 H4R3me2a 水平，而其催化突变体（V86K,D88A）则无此效应（图 5A）。变构 PRMT6 抑制剂（SGC6870）、I 型 PRMT 抑制剂 MS023 以及 PRMT4/6 抑制剂 MS049 均可降低 PRMT6 依赖的 H3R2me2a 水平升高（图 5B）HEK293T 细胞的基础 H4R3me2a、H3R2me2a 和 H3R8me2a 水平较低，适合用于监测外源性 PRMT6 活性8,9
PRMT7HSP70-R469me1HSP70-Rme1 甲基化水平标准化至总 HSP70PRMT7 敲除或敲低可降低 HSP70 单甲基化水平（图 6A）。使用 PRMT7 选择性化学探针 SGC3027 处理 2 天可剂量依赖性地降低 PRMT7 依赖的 HSP70 单甲基化水平（图 6B）C2C12, HT180
多种癌细胞系表达可诱导形式的 HSP70，其甲基化信号与一种核源性非特异性蛋白重叠（图 6C）。在此情况下，建议分析细胞质组分中的 HSP70 甲基化水平。		12
PRMT8EWS-Rme2a在 PRMT1 敲除细胞中，由外源性 FLAG 标签 PRMT8 野生型或 E185Q 催化突变体引起的外源性 GFP 标签 EWS 甲基化水平，标准化至总 GFP 信号。仅在 PRMT1 敲低细胞中，野生型 PRMT8 过表达可甲基化异位表达的 EWS，而催化突变体 E185Q 则无此效应（图 7A）。I 型 PRMT 化学探针 MS023 可抑制 PRMT8 对外源性 EWS 的不对称二甲基化（图 8B）HEK293T PRMT1 敲低（可诱导型）。
PRMT1 敲低会导致细胞死亡，因此建议使用可诱导系统。		8
PRMT9SAP145-R508me2sPRMT9 依赖的 SAP145 在 R508 位点的对称二甲基化水平，标准化至 SAP145 总量PRMT9 缺失（而非 PRMT5 缺失）导致 SAP145 对称二甲基化水平降低。GFP 标签的 SAP145 野生型可被 PRMT9 甲基化，而 SAP145mut（R508K）则不能（图 8A）。使用原型 PRMT9 抑制剂 Copound X 处理 2 天可剂量依赖性地降低 SAP145-R508me2s 水平（图 8B）。任何细胞系21

表4. PRMT 酶活性检测汇总。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文描述了使用荧光 Western 印迹方法检测 PRMT 家族成员的详细细胞检测方案。选择了独特的底物，这些底物在单个 PRMT 缺失或催化活性被抑制后，其精氨酸甲基化水平的变化可被清晰检测，且不会被家族其他成员所代偿。某些蛋白质可被多种 PRMT 甲基化21,23，表明底物特异性存在重叠，其中某些 PRMT 仅对特定蛋白底物的细胞甲基化修饰贡献少量修饰量24,25,26,27，例如 PRMT8 和 PRMT1 均参与 EWS 蛋白的甲基化。因此，每项检测均需通过基因敲低和/或过表达实验对底物和抗体进行充分验证，并进一步使用特征明确的选择性抑制剂进行验证。我们鉴定了 PRMT 特异性的底物，其甲基化修饰水平在 PRMT 缺失或抑制后的 2–3 天内即可检测到变化，以避免因细胞活力和增殖能力下降带来的间接影响，从而干扰甲基化精氨酸修饰水平的判断。尽管已成功为 PRMT1、PRMT4、PRMT5、PRMT7 和 PRMT9 找到特异性底物，但对于 PRMT3、PRMT6 和 PRMT8，则必须采用功能获得性策略。我们测试了多种针对不同细胞靶标的精氨酸甲基化特异性抗体，但在 PRMT3 和 PRMT6 敲低后 3 天内均未能检测到显著变化；因此，我们开发了生物标志物检测方法，通过共表达外源酶及其催化失活突变体，后者用于控制底物基础甲基化水平。PRMT8 是 PRMT1 的近源同源物，且具有相似的底物偏好性。由于未能鉴定出 PRMT8 特异性的生物标志物，我们建立了在 PRMT1 敲低细胞中的检测体系，其中同时共表达 PRMT8 和 EWS。PRMT1 也是介导组蛋白 H4 第3位精氨酸（H4R3）不对称二甲基化的主要酶。因此，在将 H4R3me2a 用作 PRMT3 和 PRMT6 细胞检测的生物标志物时，我们选择基础 H4R3me2a 水平较低的细胞，并使用催化失活突变体作为背景对照。尽管内源性检测更受青睐，但外源性检测在评估多种选择性 PRMT 抑制剂的细胞活性方面具有重要价值7,8,9。随着对 PRMT 生物学认知的不断深入，我们预期将通过发现更多针对 PRMT3、PRMT6 和 PRMT8 的特异性生物标志物蛋白，进一步优化这些检测方法。

使用经过验证的抗体和适当的对照对于PRMT实验的性能至关重要。此处推荐的所有抗体均已通过基因敲低和过表达实验进行了充分验证，但批次间的差异（尤其是多克隆抗体）仍可能影响其性能。因此，必须结合遗传学方法和化学探针及其相应的阴性对照，以确认实验的可靠性。此外，对于需要蛋白过表达的PRMT实验，必须同时使用催化失活突变体和野生型蛋白，以确定基础甲基化水平。

这一系列用于分析细胞中PRMT活性的定量检测方法，由于仅需基本的细胞培养和荧光Western印迹技术，且可在最少设备和有限技术条件下快速、简便地实施，因此可广泛适用于科学界。推荐的PRMT抗体和化学探针还可用于基于活性的蛋白质谱分析（ABPP）实验，以评估特定ABPP探针的适用性、监测靶标结合情况，并通过竞争性ABPP模式评估脱靶效应。本文讨论的检测方法开发策略也可推广至其他酶家族，如蛋白质赖氨酸甲基转移酶和乙酰转移酶。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明不存在任何竞争性财务利益或其他冲突性利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

结构基因组学联盟是一个注册慈善机构（编号：1097737），其资金来自艾伯维（AbbVie）、拜耳公司（Bayer AG）、勃林格殷格翰（Boehringer Ingelheim）、基因泰克（Genentech）、通过安大略基因组研究所 [OGI-196] 获得的加拿大基因组中心资助、欧盟和欧洲制药工业协会联合会通过创新药物计划2联合企业 [EUbOPEN 资助号 875510]、强生旗下杨森（Janssen）、默克公司（Merck KGaA，在加拿大和美国称为 EMD）、辉瑞（Pfizer）、武田制药（Takeda）以及惠康基金会 [106169/ZZ14/Z]。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 cm 细胞培养皿Greiner bio-one664160
24 孔细胞培养板Greiner bio-one662160
4–12% Bis-Tris 蛋白质凝胶ThermoFisher ScientificNP0323BOX, NP0322BOX, NP0321BOX
Amersham Hybond P PVDF 膜Millipore-Sigma10600021
抗 Asym 24 抗体Millipore-Sigma07-414
抗 Asym 25 抗体Millipore-Sigma09-814
抗 B-actin 抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-47778
抗 BAF155 抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-32763
抗 BAF155-R1064me2a 抗体Millipore-SigmaABE1339
抗 FLAG 抗体（#，1:5000）Millipore-SigmaF4799
抗 GFP 抗体Clontech632381
抗 H3 抗体Abcamab10799
抗 H3R2me2a 抗体Millipore-Sigma04-848
抗 H3R8me2a 抗体Rockland600-401-I67
抗 H4 抗体Abcamab174628
抗 H4R3me2a 抗体Active Motif39705
抗 Hsp/Hsc70 抗体EnzoADI-SPA-820
抗 PRMT1 抗体Millipore-Sigma07-404
抗 PRMT3 抗体Abcamab191562
抗 PRMT4 抗体Bethyl#A300-421A
抗 PRMT5 抗体Abcamab109451
抗 PRMT6 抗体Abcamab47244
抗 PRMT7 抗体Abcamab179822
抗 Rme1 抗体CST8015
抗 Rme2a 抗体CST13522
抗 Rme2s 抗体CST13222
抗 Rme2s (ASYM25), Millipore, 1:200009-814
抗 SAP145 抗体 (Abcam, #, 1:1000)Abcamab56800
抗 SAP145-R508me2s 抗体由希望之城贝克曼研究所 Yanzhong Yang 博士惠赠
抗 SmBB’ 抗体Santa Cruz Biotechnologiessc-130670
苯甲酸酶（benzonase）实验室自制
牛血清白蛋白（BSA）Millipore-SigmaA7906
C2C12 细胞系由麦吉尔大学 Stephane Richard 博士惠赠
cOmplete 无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物Millipore-Sigma11873580001
DMEM 培养基Wisent319-005-CL
二甲基亚砜（DMSO）BioshopDMS666.100
驴抗小鼠 IgG-IR680 抗体Licor926-68072
多西环素（doxycycline）Millipore-SigmaD9891
EDTABioshopEDT111.500
胎牛血清（FBS）Wisent80150
甘氨酸（glycine）BioshopGLN002.5
山羊抗兔 IgG-IR800 抗体Licor926-32211
HEK293T 细胞系由约克大学 Sam Benchimol 博士惠赠
Image Studio 软件 版本 5.2Licor
上样缓冲液：NuPAGE LDS 样品缓冲液（4x）ThermoFisher ScientificNP0007
MCF7 细胞系ATCC® HTB-22™
氯化钠（NaCl）BioshopSOD001.1
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液ThermoFisher ScientificNP0001
Odyssey 封闭缓冲液（用 PBST 稀释 4 倍）Licor927-40000也可使用 Intercept (PBS) 封闭缓冲液 # 927-70001
Odyssey CLX 成像系统Licor型号 9140
PBS（组织培养用）Wisent311-010-CL
PBS（Western blot 用）BioshopPBS405.4
青霉素-链霉素溶液（penstrep）Wisent450-201-EL
Pierce™ BCA 蛋白定量试剂盒ThermoFisher Scientific23225
十二烷基硫酸钠（SDS）BioshopSDS001.1
脱脂奶粉BioshopSKI400.500
TC20 自动细胞计数仪Biorad1450102
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）Wisent325-043-EL
TrisBioshopTRS003.5
吐温 X-100（Triton X-100）BioshopTRX506
台盼蓝（trypan blue）GIBCO15250-061
吐温-20（Tween-20）BioshopTWN510.500

参考文献

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PRMT Western Blot PRMT

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