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探索病毒感染期间的 m6A 和 m5C 表观转录组：以 HIV 为例

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DOI：

10.3791/62426

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2022年3月5日

 ,  , 
1Institute of Microbiology, Lausanne University Hospital and University of Lausanne, 2Bioinformatics Core Facility, SIB Swiss Institute of Bioinformatics

本文内容

摘要

RNA修饰在病毒感染中的作用刚刚开始被探索，可能揭示新的病毒-宿主相互作用机制。在本研究中，我们提供了一种用于研究病毒感染背景下m6A和m5C RNA修饰的分析流程。

摘要

近年来，RNA修饰在生物过程中的作用受到越来越多研究的关注，这一领域如今被称为表观转录组学。其中，mRNA分子上的N6-甲基腺苷（m6A）和5-甲基胞嘧啶（m5C）RNA修饰已被广泛报道，可能参与调控细胞过程。因此，表观转录组学构成了除转录组分析之外必须考虑的新型调控层面，因为其同样可因暴露于各种化学或生物因子（包括病毒感染）而发生改变或受到调控。

本文介绍了一种工作流程，可同时分析感染或未感染人类免疫缺陷病毒（HIV）细胞中 m6A 和 m5C 修饰的联合细胞与病毒表观转录组景观。从感染和未感染 HIV 的细胞中分离并片段化 mRNA 后，我们采用了两种不同的方法：MeRIP-Seq（一种基于 RNA 免疫沉淀的技术），用于富集含有 m6A 修饰的 RNA 片段；BS-Seq（一种基于亚硫酸氢盐转化的技术），用于在单核苷酸分辨率下鉴定 m5C 修饰。在进行甲基化特异性捕获后，构建 RNA 文库用于高通量测序。我们还开发了专用的生物信息学分析流程，可独立于转录本的基础表达谱来识别差异甲基化（DM）转录本。

总体而言，该方法能够同时探索多种表观转录组修饰，并提供病毒感染或其他细胞扰动条件下差异修饰转录本的图谱。这一方法为发现细胞应答中的新参与者和新机制提供了新的机遇，例如促进或限制病毒复制的宿主因子。

引言

它 众所周知，RNA分子可发生修饰，迄今为止已发现超过150种转录后修饰1它们包括将化学基团（主要是甲基）添加到RNA分子中嘧啶和嘌呤环的几乎所有位置2此类转录后修饰已被证实高度富集于转运RNA（tRNA）和核糖体RNA（rRNA），并最近也在信使RNA（mRNA）分子上被发现。

新一代测序技术（NGS）的发展以及特异性识别特定化学修饰的抗体的制备，首次使得在转录组范围内研究特定化学修饰的位置和频率成为可能。这些进展加深了人们对RNA修饰的理解，并实现了对mRNA分子上多种修饰的定位与图谱绘制3,4。

尽管表观遗传学研究DNA和组蛋白修饰在转录组调控中的作用，表观转录组学则类似地关注RNA修饰及其功能。表观转录组学的研究 修饰作用为揭示可能调控多种细胞过程（如RNA剪接、转运、稳定性和翻译）的新型调控机制提供了新的机遇5因此，最近的研究发现病毒侵染期间细胞RNA和病毒RNA上均存在大量表观转录组修饰，这并不令人意外。6迄今为止研究的病毒包括DNA病毒和RNA病毒；其中，HIV可被视为一个开创性的例子。总体而言，在病毒感染背景下发现的RNA甲基化可能有助于研究尚未阐明的病毒表达或复制机制，从而为控制这些病毒提供新的工具和靶点7.

在HIV表观转录组学领域，病毒转录本的修饰已被广泛研究，结果表明此类修饰的存在有利于病毒复制8,9,10,11,12,13。目前已有多种技术可用于在全转录组水平上检测表观转录组修饰。其中最常用的技术是基于免疫沉淀的方法，如MeRIP-Seq和miCLIP，用于m6A的鉴定。MeRIP-Seq依赖于RNA片段化以捕获含有甲基化残基的片段，而miCLIP则基于RNA-抗体紫外交联后产生α-m6A抗体特异性突变特征，从而实现更精确的定位。

m5C 修饰的检测可通过类似于 m6A 检测的抗体依赖性技术（即 m5C RIP）、亚硫酸氢盐转化、AZA-IP 或 miCLIP 方法实现。Aza-IP 和 m5C miCLIP 均利用特定的甲基转移酶作为“诱饵”，在 RNA 甲基化过程中靶向 RNA。在 Aza-IP 中，靶细胞被暴露于 5-氮杂胞苷，导致新生 RNA 中随机引入胞苷类似物 5-氮杂胞苷位点。在 miCLIP 中，NSun2 甲基转移酶 经过基因改造，携带 C271A 突变14,15。

本研究以HIV为模型，聚焦于感染细胞中m6A和m5C修饰的双重表征。经过方法学优化，我们建立了一种整合甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）与RNA亚硫酸氢盐转化（BS）的工作流程，可在转录组范围内同时探索宿主细胞与病毒环境中的m6A和m5C表观转录组标记。该工作流程既可用于细胞RNA提取物，也可用于从病毒颗粒中分离的RNA。

甲基化RNA免疫沉淀（MeRIP）16 可用于研究 m 的方法6在转录组水平上的研究已得到充分确立，并且存在一系列 m6目前市面上已有商品化的A特异性抗体17该方法包括对 m 的选择性捕获6使用含A的RNA片段进行m6特异性抗体。该技术的主要缺点有两个：（i）分辨率有限，其高度依赖于RNA片段的大小，因此只能提供含有甲基化位点的近似位置和区域；（ii）进行分析所需的起始材料量较大。在以下优化的实验方案中，我们将RNA片段大小标准化至约150 nt，并将起始材料用量从目前推荐的10 µg poly-A筛选RNA减少至仅需1 µg poly-A筛选RNA。同时，我们还提高了m6通过与特定抗体结合的RNA片段，并采用竞争性洗脱方法进行分离6使用肽而非基于苯酚的技术或蛋白酶K等更常规但特异性较低的洗脱方法。然而，这种RIP-based检测的主要局限性仍然是分辨率不够理想，无法精确识别发生修饰的A核苷酸。

目前可通过两种不同方法对m5C修饰进行分析：一种是基于RIP（RNA免疫沉淀）的m5C特异性抗体方法，另一种是RNA亚硫酸氢盐转化法。由于RIP方法在鉴定甲基化位点方面分辨率有限，因此我们采用了可实现单核苷酸分辨率的亚硫酸氢盐转化法。RNA暴露于亚硫酸氢盐（BS）时，会引起胞嘧啶脱氨，从而将胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。因此，在RNA亚硫酸氢盐转化反应中，所有未甲基化的胞嘧啶均被脱氨并转化为尿嘧啶，而胞嘧啶第5位上的甲基具有保护作用，可防止BS诱导的脱氨反应，从而保留胞嘧啶残基。基于BS的方法能够在单碱基分辨率下检测m5C修饰的核苷酸，并评估每条转录本的甲基化频率，从而揭示m5C修饰的动态特征18。然而，该技术的主要局限在于甲基化位点的假阳性率。实际上，BS转化仅对单链RNA中可及的胞嘧啶残基有效。然而，若RNA存在紧密的二级结构，则可能掩盖N5C位点，阻碍BS转化，导致未甲基化的胞嘧啶未能转化为尿嘧啶，从而产生假阳性结果。为解决这一问题并降低假阳性率，我们进行了三轮变性与亚硫酸氢盐转化循环19。此外，我们在样品中引入了两个对照，以评估亚硫酸氢盐转化效率：一方面加入ERCC测序对照（非甲基化的标准化且商业可得的序列）20以及poly-A耗尽的RNA，用于评估亚硫酸氢盐转化率；另一方面通过RT-PCR验证28S核糖体RNA上一个已知且高度保守的甲基化位点C4447的存在21。

在病毒学领域，将这两种表观转录组学研究方法与下一代测序技术及精确的生物信息学分析相结合，可实现对m6A 和 m5碳动态（即病毒感染后可能发生的RNA修饰时间动态变化，并揭示一系列具有临床治疗潜力的新靶点。

方案

1. 细胞准备

注意：起始细胞数量可根据细胞类型及其RNA含量的不同而有所变化。

  1. 准备足够数量的细胞，以获得 200–500 µg 总 RNA 或 5–7 µg 经 poly-A 筛选的 RNA。例如，50 × 106 个 SupT1 细胞使用基于苯酚的试剂提取后，可获得约 500 µg 总 RNA，因此每种独立实验条件均需此数量的细胞。
  2. 根据实验设计以及所测试的条件数量（如感染、时间点、处理）准备相应数量的细胞。若实验目标是获取未感染细胞和感染 HIV 后 24 小时的细胞，则总共需要 100 × 106 个细胞，其中一半用于未感染条件，另一半用于感染条件。

2. RNA 提取

  1. 从细胞中提取RNA：苯酚-氯仿法
    1. 对于每种条件，收集细胞（例如，50 × 106通过离心去除上清液并弃去。
    2. 向每份 50 x 106 细胞沉淀，用移液器上下吹打数次以混匀。
    3. 室温孵育5分钟，以确保细胞完全裂解。裂解后的细胞样品可于-80 °C保存，或直接进行后续处理。
      注意：如有需要，细胞也可分装为每份 10 x 106 每管1.5 mL，每管含细胞若干，加入1 mL基于苯酚的裂解试剂裂解，便于储存。
    4. 加入1 mL氯仿，倒置混匀。
    5. 室温孵育3分钟。
    6. 在 2,000 × g 条件下于 4 °C 离心 15 分钟。
    7. 用移液器吸出水相（上相），转移至新管中。将试管倾斜45°，小心吸取剩余溶液，完成水相的转移。
      注意：不同样本中水相的体积可能有所差异，但应接近于加入样本中的氯仿体积。 即， 1 mL。 切勿转移任何间相或有机层！ 使用相位锁定管或相位标记管可促进此过程。
    8. 向水相中加入0.5 mL 100%分子生物学级异丙醇。
    9. 在 -80 °C 下孵育 1 小时，以使 RNA 沉淀。
    10. 在 12,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟，使沉淀的 RNA 成团。
    11. 弃去上清液，将RNA沉淀重悬于1 mL 75%分子生物学级乙醇中，短暂涡旋振荡。
    12. 在 7,500 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟，弃去上清液。
    13. 将沉淀物风干15分钟。
    14. 将沉淀重悬于20 µL无RNase的水中，并转移至新管。
    15. 用额外的20 µL水清洗空管，以最大程度回收RNA，并将洗液与首次的20 µL液体合并。
    16. 使用分光光度计定量总RNA，并利用片段分析仪评估RNA质量。
  2. 从病毒颗粒中提取RNA：基于柱式病毒RNA提取试剂盒的提取方法
    注意：使用基于苯酚的试剂从病毒颗粒中提取RNA会导致病毒RNA质量较低，进而产生质量较差的文库。因此，应优先采用基于离心柱的RNA提取方法。本实验不宜使用含有载体RNA（carrier RNA）用于RNA洗脱和回收的RNA提取试剂盒，应避免使用此类试剂盒。由于HIV RNA具有多聚腺苷酸化（poly-Adenylated）特性，无需额外进行mRNA分离，直接提取的RNA即可满足MeRIP-Seq和BS-Seq流程的起始要求。通常情况下，从广泛感染的细胞中获取的1–2 mL病毒上清液即可提供足量RNA，用于完成整个实验流程。
    1. 加入150 µL β-巯基乙醇至30 mL裂解缓冲液中，配制缓冲液。加入96 mL 100%乙醇至病毒洗涤缓冲液中，进行重悬。
    2. 收集含有病毒的上清液，离心以沉淀细胞碎片，从而最大限度减少细胞RNA污染。
    3. 将1 mL病毒上清液转移至15 mL离心管中。
    4. 向1 mL病毒样本中加入3 mL病毒RNA缓冲液，涡旋混匀。
    5. 将700 µL样品转移至插入收集管中的柱子中。
    6. 室温下以13,000 × g离心2分钟。
    7. 弃去流穿液。
    8. 重复前三个步骤，直至处理完整个样本，从而将全部RNA捕获在基于硅胶的基质柱上。
    9. 向柱中加入 500 µL 病毒洗涤缓冲液。
    10. 室温下以 10,000 × g 离心 1 分钟。弃去穿流液。
    11. 向柱中加入 200 µL 病毒洗涤缓冲液。
    12. 在室温下以10,000 × g离心1分钟。弃去滤过液。
    13. 将柱子放入空的收集管中。
    14. 室温下以10,000 × g离心1分钟，以彻底去除残留的洗涤缓冲液污染物。
    15. 将柱子小心转移至一个1.5 mL离心管中。
    16. 向柱基质中心直接加入20 µL无DNase/RNase水，室温下10,000 × g离心30秒。
    17. 向柱基质中心直接加入10 µL无DNase/RNase的水，再次离心30秒。
    18. 使用分光光度计定量总RNA，并利用片段分析仪评估RNA质量。
      ​注意：只要所提取的RNA质量高，且RNA完整性/质量数值良好，可采用任何方法进行RNA提取 > 9. 总RNA可保存在-80 °C，直至进一步处理。

3. 使用寡聚(dT)25 通过多聚A选择法分离mRNA

注意：由于细胞提取物中含有高度甲基化的核糖体RNA，强烈建议通过核糖体RNA耗竭法或更优的聚腺苷酸（poly-A）阳性选择法来分离poly-A RNA。此步骤为可选步骤，仅应在细胞RNA样本中进行，以获得更高分辨率的测序结果。若分析非聚腺苷酸化的病毒RNA的甲基化情况，应优先选择核糖体RNA耗竭法，而非poly-A选择法，或直接对总RNA进行分析。

  1. 用于poly-A捕获的磁珠制备
    1. 重悬 Oligo(dT)25 通过涡旋振荡混匀磁珠储存液小瓶 >30 s
    2. 将200 µL磁珠转移至1.5 mL离心管中。根据待处理RNA样本的总数，准备相应数量的含磁珠离心管。
      注意：1管200 µL Dynabeads储存液相当于1 mg磁珠，可结合75 µg总RNA样品。
    3. 将离心管置于磁力架上静置1分钟，弃去上清液。从磁力架上取下离心管。
    4. 加入1 mL结合缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，1.0 M LiCl，2 mM EDTA），涡旋振荡重悬。将离心管置于磁架上静置1分钟，弃去上清液。从磁架上取下离心管。重复上述步骤。
    5. 将洗涤后的磁珠重悬于100 µL结合缓冲液中。
  2. 总RNA提取
    1. 用无RNase的水将总RNA稀释至终浓度为0.75 µg/µL，相当于75 µg/100 µL。
      注意：如果 RNA 浓度较低，无需调整体积，按以下步骤操作即可。
    2. 将总RNA按每管100 µL分装至多个离心管中。
    3. 向每个RNA样本中加入100 µL结合缓冲液。
    4. 将总RNA在65 °C加热2分钟以破坏二级结构。
    5. 立即置于冰上，直至准备进行下一步操作。
      注意：孵育时间可根据待处理样本数量而调整，但不应超过1小时，以避免RNA降解。
  3. Poly-A 选择
    1. 向每个RNA管（步骤3.2）中加入100 µL洗涤后的磁珠（步骤3.1）。
    2. 用移液器反复吹打混匀，室温下在旋转摇床上孵育15分钟以充分结合。
    3. 打开所有管子，置于磁力架上1分钟，小心吸除所有上清液。
    4. 将上清液转移至新离心管中，留置备用，用于第二轮RNA捕获（步骤3.3.14），以提高poly-A最终回收率。
    5. 从磁力架上取下离心管，加入200 µL洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，0.15 M LiCl，1 mM EDTA）。用移液器轻柔吹打4至5次以充分混匀。
    6. 将试管置于磁架上1分钟，弃去上清液。
    7. 重复洗涤步骤一次（重复步骤 3.3.5 和 3.3.6）。
    8. 加入20 µL预冷的10 mM Tris-HCl以洗脱磁珠上的poly-A RNA。
    9. 80 °C 下孵育 2 分钟。
    10. 将试管置于磁架上，迅速将含有poly-A RNA的上清液转移至新的无RNase的试管中。将试管置于冰上。
    11. 重复洗脱步骤（步骤 3.3.8 至 3.3.10）以提高得率。
    12. 用 200 µL 洗涤缓冲液将相同的磁珠洗涤一次。用移液器轻柔吹打 4 至 5 次以混匀。
    13. 置于磁架上1分钟，弃去洗涤缓冲液。
    14. 将步骤 3.3.4 的流穿液加入珠子中，并重复从结合到洗脱的步骤（步骤 3.3.2 至 3.3.10）。暂时将 RNA 洗脱液分别保存在不同的离心管中。
      注意：可选步骤，可将上清液（相当于步骤 3.3.4）转移至新离心管中留作对照。在实验结束时，通过乙醇沉淀法或选用的柱纯化方法对 RNA 进行纯化和浓缩（即，RNA纯化与浓缩试剂盒）。该样品对应于去除了poly-A的RNA样品，可作为亚硫酸氢盐转化的对照（步骤8.2.2）。
    15. 使用分光光度计定量洗脱的RNA，并保留2 µL等分试样，用于后续通过片段分析仪评估RNA质量。
      ​注意：多聚A尾RNA可保存在-80 °C，直至需要时使用。

4. RNA 工作流程

  1. 将细胞多聚腺苷酸化RNA（mRNA）和病毒RNA样品均分为两份，分别用于相应的表观转录组学分析流程：
    (i) 取5 µg细胞mRNA或1 µg病毒RNA用于MeRIP-Seq及输入对照（进入步骤5至7，以及步骤9）。
    (ii) 取1 µg细胞mRNA或500 ng病毒RNA用于BS-Seq（进入步骤8和9）。

5. RNA 片段化

注意：RNA片段化使用RNA片段化试剂进行，适用于MeRIP-Seq及对照RNA样本。此步骤极为关键，需仔细优化，以获得长度在100-200 nt之间的片段。

  1. 将mRNA总体积分装至0.2 mL PCR管中，每管18 µL。
    注意：操作需迅速。为获得可重复的结果，每次处理的样本数不应超过8个。扩大反应体积无法保证可重复且均一的片段化效果。
  2. 将PCR仪预热至70 °C。
  3. 在每根PCR管的管壁边缘加入2 µL片段化试剂。
  4. 盖紧管盖并短暂离心（确保试剂同时与8根管中的RNA接触）。
  5. 将样本放入预热的PCR仪中，在70 °C孵育15分钟。
  6. 孵育一结束，立即向每管中快速加入2 µL终止液。
  7. 短暂离心后置于冰上，直至准备进行下一步操作。
    注意：孵育时间可根据待处理样本数量调整，但不应超过1小时，以避免RNA降解。
  8. 若样本超过8份，需对剩余样本重复上述操作。
  9. 将所有管中样本合并，随后使用RNA纯化浓缩试剂盒（步骤6）或任何定制的柱式纯化试剂盒进行RNA纯化，以去除缓冲液成分，并将纯净的片段化RNA回收至水中。

6. RNA 纯化

注意：此步骤可通过乙醇沉淀或任何基于离心柱的 RNA 纯化与浓缩方法进行即，RNA纯化与浓缩试剂盒）

  1. 用50-75 µL无DNase/RNase的水洗脱或重悬纯化的RNA。
    注意：如果使用基于柱的方法，强烈建议进行两轮洗脱，以确保最大回收率。
  2. 使用分光光度计定量纯化的片段化mRNA，并用片段分析仪评估RNA质量。
  3. 保留100 ng片段化mRNA作为文库构建和测序的输入对照（进入步骤9）。剩余的片段化mRNA（至少2.5 µg）可用于MeRIP（进入步骤7.2）。

7. MeRIP

注意：每次免疫沉淀（IP）至少需要 2.5 µg 的片段化 mRNA，可使用特异性抗 m6A 抗体（实验条件）或抗 IgG 抗体（阴性对照）。

  1. 免疫沉淀磁珠制备
    1. 为每个样本在新的锥形管中配制4 mL 1× IP缓冲液，方法是将800 µL 5× mRNA IP缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.4、750 mM NaCl、0.5% Igepal CA-630和无核酸酶水）与3.2 mL无核酸酶水混合稀释。
      注意：至少需要进行两组反应（一组为实验组，一组为IgG对照组）。
    2. 将试管置于冰上。
    3. 标记适当数量的1.5 mL微量离心管，用于所需数量的免疫沉淀反应：
      n 个用于抗 m6A 抗体的离心管（测试）
      n 个试管（阴性对照）用于正常小鼠 IgG。
    4. 重悬磁珠（例如，Magna ChIP Protein A/G）通过倒置和涡旋混匀，不应有可见的珠状团块。
    5. 对于每个计划的反应, 将25 µL磁珠转移至微量离心管中。
    6. 加入相对于所用珠子原始体积10倍量的1×IP缓冲液（来自步骤7.1.1）即， 每25 µL磁珠使用250 µL 1× IP缓冲液。
    7. 通过轻轻吹打数次使磁珠充分重悬。
    8. 将试管置于磁力架上静置1分钟。
    9. 移除并弃去上清液，注意不要吸走任何磁珠。将试管从磁铁上取下。
    10. 重复洗涤步骤（步骤 7.1.6 至 7.1.9）。
    11. 将磁珠用 1× IP 缓冲液重悬，每 25 µL 原体积磁珠加入 100 µL 1× IP 缓冲液。
    12. 每25 µL磁珠原始体积中加入5 µL抗体（1 µg/µL）。
      n 个（检测）管中加入抗 m6A 抗体（克隆株 17-3-4-1）[1 µg/µL]。
      n 个含有正常小鼠 IgG（1 µg/µL）的试管（阴性对照）。
    13. 室温下在旋转仪上孵育30分钟，使抗体与磁珠充分结合。
    14. 将离心管置于磁力架上1分钟。弃去上清液。从磁力架上取下离心管，加入100 µL 1× IP缓冲液重悬抗体-磁珠混合物。
  2. RNA免疫沉淀（RIP）
    1. 为每份2.5 µg mRNA样品配制500 µL RIP反应体系，具体如下：100 µL片段化RNA（来自步骤6.12）中含有2.5 µg RNA；295 µL无核酸酶水；5 µL 40 U/µL RNase抑制剂；以及100 µL 5× IP缓冲液。
    2. 向每份抗体-磁珠混合物（约100 µL，来自步骤7.1.14）中加入500 µL RIP反应混合液。轻轻吹打数次，充分重悬磁珠。置于冰上。
    3. 将所有 RIP 反应管置于4 °C旋转摇床上孵育2小时。
    4. 短暂离心MeRIP反应样品，使管盖和管壁上的液滴沉降至管底。将离心管置于磁力分离架上静置1分钟。
    5. 将上清液转移至新的离心管中，注意不要扰动磁珠。
      注意：可将流穿组分保留作为对照，以验证RIP效率（进入步骤7.3.9）。
    6. 从磁力架上取下离心管。加入500 µL预冷的1x IP缓冲液洗涤磁珠。通过轻轻吹打数次使磁珠充分重悬。
    7. 将试管置于磁力架上静置1分钟，弃去上清液。
    8. 重复洗涤步骤（7.2.6–7.2.7）两次，共洗涤3次。
    9. 将离心管置于冰上，并立即进行洗脱步骤。
  3. 洗脱
    1. 制备 20 mM m6将10 mg N6-Methyladenosine, 5′-monophosphate sodium salt（m6A) 在1.3 mL无核酸酶水中溶解，分装为每份150 µL，于-20 °C保存。
    2. 每个样本（测试样本和对照样本）：通过混合以下组分配制 225 µL 洗脱缓冲液：45 µL 5x IP 缓冲液、75 µL 20 mM m6A，3.5 µL 的 40 U/µL RNase 抑制剂，以及 101.5 µL 无核酸酶水。
    3. 向珠子（来自步骤 7.2.9）中加入 100 µL 洗脱缓冲液（来自步骤 7.3.2）。通过轻轻吹打数次充分混匀，以完全重悬珠子。
    4. 将所有试管在 4 °C 条件下于摇床中持续振荡孵育 1 小时。
    5. 短暂离心RIP反应，以收集管盖和管壁上的液滴 两侧。将离心管置于磁力架上静置1分钟。
    6. 将含有洗脱RNA片段的上清液转移至新的1.5 mL微量离心管中。注意不要吸出磁珠，以免增加背景噪音。
    7. 重复洗脱步骤（7.3.3 至 7.3.6）：再次加入 100 µL 洗脱缓冲液，4 °C 下孵育 1 小时，磁分离后收集洗脱液。
    8. 将同一份样品的所有洗脱液合并（总洗脱体积应为 200 µL）。
    9. 通过乙醇沉淀法或选择基于柱的方法（例如，RNA Clean and Concentrator）纯化洗脱的RNA以及流穿液（可选，来自步骤7.2.5）。
    10. 使用高灵敏度检测试剂盒，通过片段分析仪评估流穿组分和洗脱组分中RNA的浓度和质量。若RNA质量合格，则进行文库构建和高通量测序（步骤9）。
      ​注意：MeRIP 实验所获得的 RNA 量非常少，必须使用高灵敏度检测试剂盒才能确保准确定量。若无生物分析仪，也可直接进行文库构建。

8. RNA 亚硫酸氢盐转化

  1. 对照与试剂制备
    1. ERCC混合物加标对照：按照制造商说明书添加ERCC混合物，建议将0.5 µL未稀释的ERCC混合物加入500 ng mRNA中。该对照可用于评估 亚硫酸氢盐转化效率
    2. Spike Poly-A 耗竭 RNA（来自步骤 3.3.14）按 1/1000 比例（即， 500 pg 的去多聚A尾RNA对应500 ng的mRNA。该样品富含核糖体RNA，因此应含有28S rRNA，可作为亚硫酸氢盐转化的阳性对照。
      注意：总RNA也可用作阳性对照，以替代poly-A缺失RNA。
    3. 使用RNA甲基化试剂盒进行亚硫酸氢盐转化（例如，Zymo EZ）
    4. RNA洗涤缓冲液：使用前，向12 mL RNA洗涤缓冲液浓缩液中加入48 mL 100%乙醇（或52 mL 95%乙醇）。
  2. 亚硫酸氢盐转化
    注意：按照下述制造商的操作说明，使用市售的RNA亚硫酸氢盐转化试剂盒进行亚硫酸氢盐转化。
    1. 在0.2 mL的PCR管中，加入1000 ng的mRNA（或300至1000 ng之间）。加入外参对照：1 µL ERCC混合液（步骤8.1.1）和1000 pg的poly-A耗尽RNA（步骤8.1.2）。用无DNase/RNase的水将体积补足至20 µL。
    2. 向每个20 µL的RNA样本中加入130 µL RNA转化试剂。
    3. 用移液器上下吹打混匀样品。
    4. 短暂离心，以确保管盖或管壁无液滴残留。
    5. 将PCR管放入热循环仪中，执行以下步骤：70 °C 变性5分钟；54 °C 转化45分钟；变性与转化步骤共重复3个循环；最后在4 °C 长期保存。
      注意：三次变性与亚硫酸氢盐转化循环可确保样本的亚硫酸氢盐转化完全。样本可保存于 -80 °C 或直接进行后续处理。
    6. 进行柱上脱磺酸化。将层析柱放入一个空的收集管中，然后向柱中加入250 µL RNA结合缓冲液。
    7. 将样品（约150 µL，来自步骤8.2.5）加入含有RNA结合缓冲液的柱中，通过上下移液混合。
    8. 向柱中的样品-RNA结合缓冲液混合物中加入400 µL 95-100%乙醇。盖紧管盖，立即通过反复倒置柱子数次进行混匀。
    9. 以最大速度（≥ 10,000 × g）离心30秒。弃去穿流液。
    10. 向柱中加入 200 µL RNA 洗涤缓冲液，全速离心 30 秒。
    11. 向柱中加入 200 µL RNA 脱磺酸化缓冲液，在室温下孵育 30 分钟。孵育结束后，以最大转速离心 30 秒，弃去穿流液。
    12. 向柱中加入 400 µL RNA 洗涤缓冲液，全速离心 30 秒。用额外的 400 µL RNA 洗涤缓冲液重复洗涤步骤。弃去穿流液。
    13. 将离心柱放入已清空的收集管中，以最大速度离心2分钟。将离心柱转移至无RNase的离心管中。
    14. 向柱基质中直接加入 ≥ 10 µL 无 DNase/RNase 水，室温孵育 1 分钟。全速离心 30 秒。
      注意：我们通常使用 20 µL 洗脱体积。洗脱得到的 RNA 可立即使用，或在 -20 °C 保存长达 3 个月。如需长期保存，请置于 -80 °C。
    15. 取出2.5 µL用于片段分析仪检测RNA的质量与数量，随后进行文库构建和高通量测序（步骤9）。
    16. 取4 µL已转化的RNA用于亚硫酸氢盐转化效率的对照（步骤8.3）。
  3. 通过RT-PCR进行亚硫酸氢盐转化对照
    注意：此步骤可确保在进行测序前，亚硫酸氢盐转化已成功完成。来自28S核糖体RNA的 智人 将用作RNA甲基化分析的阳性对照，因为GenBank登录号NR_003287中第4447位的C残基已被报道为100%甲基化。
    引物序列：
    H 28SF 引物：5'-GGGGTTTTAYGATTTTTTTGATTTTTTGGG-3'
    H 28SR 引物：5'-CCAACTCACRTTCCCTATTAATAAATAAAC-3'
    1. 使用高容量 cDNA 反转录试剂盒配制反转录（RT）反应混合液。将试剂盒组分置于冰上解冻，并在冰上按下述方法配制 RT 主混合液：
      4 µL 经亚硫酸氢盐转化的 RNA（来自步骤 8.2.14）：
      2 µL 10xRT缓冲液
      0.8 µL 25倍dNTP混合液 [100 mM]
      10x RT随机引物2 µL
      1 µL 多重编码逆转录酶
      1 µL RNase抑制剂
      9.2 µL 无核酸酶水2O
      注意：每个逆转录反应体系最终体积应为20 µL，使用0.2 mL PCR管。
    2. 将试管放入热循环仪中，按照以下反转录程序运行：25 °C 反应 10 分钟；37 °C 反应 120 分钟；85 °C 反应 5 分钟；然后在 4 °C 无限期保存。
    3. 使用具有校对功能的PCR酶配制PCR反应体系，以特异性扩增28S rRNA。将试剂盒组分置于冰上解冻，轻轻涡旋振荡并短暂离心。在冰上或冰冻金属板架上按下表配制PCR预混液：
      0.6 µL 的 10 µM H 28SF 引物
      0.6 µL 的 10 µM H 28SF 引物
      6.5 µL 模板 cDNA
      22.5 µL DNA聚合酶预混液
      注意：每次PCR反应的终体积应为20 µL，使用0.2 mL PCR管。
    4. 将试管放入热循环仪中，按照以下PCR程序进行反应：95 °C 预变性5 min；45个循环的变性（95 °C 15 s）、退火（57 °C 30 s）和延伸（72 °C 15 s）；72 °C 最终延伸10 min，随后在4 °C 无限期保存。
    5. 在2%琼脂糖凝胶上加载10 µL反应产物进行电泳。预期条带大小为130 - 200 bp。
  4. PCR产物测序
    1. 使用基于离心柱的方法纯化PCR产物，以去除酶和dNTP残留，并将扩增的DNA洗脱于至少20 µL无DNase/RNase的水中。
    2. 使用分光光度计定量纯化的DNA。
    3. 测序反应
      1. 每次测序反应使用 40 ng 的 PCR 产物。
      2. 使用 H 28SF 和 H 28SR 引物进行双向测序。
      3. 将序列与已知的未转化序列（28S核糖体N5（RNA28SN5））进行比对。检查C4447位点是否存在C残基，并确认其他位置的C是否被T残基取代。

9. 文库构建与高通量测序

  1. 使用mRNA试剂盒制备测序文库（例如，Illumina TruSeq Stranded），从“洗脱-引物-片段化”步骤开始，并遵循制造商说明。
    1. 然而，对于输入的RNA-Seq和MeRIP-Seq样品，将样品在80 °C孵育2分钟，仅用于起始变性，不再进一步片段化。
  2. 使用Illumina平台进行测序。根据偏好和实验设计，可选择单端或双端测序，读长至少为100 nt。

10. 生物信息学分析

  1. m6数据处理
    1. 运行 FASTQC24 评估 m 中的读段质量6A 和测序产生的输入 FASTQ 文件。
    2. 运行 Atropos25 剪切测序读段中的低质量末端和接头序列。运行 Atropos 时设置以下参数。
      1. 去除以下接头序列：AGATCGGAAGAG、CTCTTCCGATCT、AACACTCTTTCCCT、AGATCGGAAGAGCG、AGGGAAAGAGTGTT、CGCTCTTCCGATCT。
      2. 使用以下Phred质量阈值：5，用于根据制造商说明修剪低质量末端（https://support.illumina.com/downloads/illumina-adapter-sequences-document-1000000002694.html）。
      3. 修剪后使用以下最小读长：25个碱基对。
    3. 合并GRh38人类基因组与HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] 参考序列（FASTA格式）。
    4. 使用 HISAT2 对合并的参考序列进行索引26.
    5. 对修剪后的测序读段运行 HISAT2 进行比对 到索引参考序列。使用默认的 HISAT 参数。
    6. 使用 SAMtools 对比对后的 reads 进行排序和索引27.
    7. 运行 SAMtools stat 和 Qualimap 228, 用于测序文库比对后的质量检查。
    8. 可选地，使用 multiQC 收集并汇总上一步的质量指标29.
    9. HIV 基因组在 5' LTR 和 3' LTR 中具有同源的 634 bp 序列：使用 SAMtools 将来自 5' LTR 的多重比对读段重新比对至对应的 3' LTR 区域。
    10. 为了鉴定 m6A峰，运行峰识别软件MACS230 (v 2.1.2)。需谨慎选择 MACS2 的运行参数，以确保其在 RNA-Seq 数据上的正确运行，因为峰值识别可能受基因表达水平影响，短外显子可能被错误识别为峰值。因此，必须从 m 中扣除输入信号6一个未经 MACS2 对基于 DNA 的数据常规平滑处理的信号。将以下参数应用于 MACS2 的 'callpeak' 子命令：
      -keep-dup auto（控制 MACS2 对重复序列的处理行为，“auto”模式允许 MACS 基于二项分布，以 1e-5 作为 p 值阈值，计算在完全相同位置上的最大读段数量）
      - g 2.7e9（人类基因组大小，单位为bp）
      -q 0.01（调用显著峰的最小FDR阈值）
      -nomodel（用于跳过构建位移模型，该模型专为ChIP-Seq实验设计）
      -slocal 0
      -llocal 0（将此参数与前一个参数均设为0可使MACS2直接减去输入reads，而不进行平滑处理）6A读数
      -片段大小 100（片段平均长度，单位为 bp）
      - B
    11. 运行 MACS2 的差异峰检测子命令 'bdgdiff'，以比较感染样本与非感染样本。'bdgdiff' 的输入为上一步中 'callpeak' 生成的 bedGraph 文件。针对每个时间点，使用 'bdgdiff' 进行感染样本与非感染样本的比较，并从 m 中减去相应的输入信号6一个信号并提供附加参数：-g 60 -l 120。
  2. m5C 数据处理
    1. 运行 Cutadapt31 使用以下参数对原始测序读段中的接头序列进行修剪：
      衔接器 "AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAAC"
      ​-最小长度=25
    2. 使用 seqkit 对截短的测序读段进行反向互补32因为测序方案会产生来自反义链的读段。
    3. 运行 FastQC 以检查测序读段质量。
    4. 合并GRh38人基因组与HIV [Integrated linear pNL4-3Env-GFP] 参考序列（FASTA格式）。
    5. 使用 meRanTK 软件包中的 meRanGh 应用程序对合并的参考序列进行索引33.
    6. 使用以下参数将 meRanGh 与之对齐：
      - 允许将未比对的读段写入输出文件
      -MM 允许将多重比对的读段写入输出文件
      -bedGraph 输出的 -bg 参数
      -​mbgc 10 根据覆盖度（至少 10 条读段覆盖）报告的区域
    7. HIV 基因组在 5' LTR 和 3' LTR 中具有同源的 634 bp 序列：使用 SAMtools 将来自 5' LTR 的多重比对读段重新比对至对应的 3' LTR 区域。
    8. 通过 meRanTK 提供的 meRanCall 工具，使用以下参数运行甲基化检测：
      -rl = 126，读长
      -ei = 0.1，用于甲基化率 p 值计算的误差区间
      -​cr = 0.99，预期转化率
    9. 运行 MeRanTK 的实用程序 estimateSizeFactors.pl 以估计每个样本的大小因子。这些大小因子将在下一步中作为参数使用。
    10. 对非感染与感染样本进行差异甲基化分析时运行 MeRanCompare 在12、24和36小时时间点进行分析。采用以下参数：显著性阈值设为0.01，作为报告的最低标准；并使用前一步骤获得的大小因子。

结果

该实验流程已被证明可用于研究m6A和m5C甲基化在HIV感染背景下的作用。为此，我们采用了一种CD4+ T细胞系模型（SupT1），将其分为感染HIV与未处理两组。每种条件下起始使用5000万个细胞，最终获得平均约500 µg总RNA，RNA质量数为10（图1A-B）。经过poly-A筛选后，每种条件下回收得到10至12 µg的mRNA（约占总RNA的2%）（图1B）。此时，我们取5 µg经poly-A富集的RNA用于MeRIP-Seq流程，另取1 µg用于BS-Seq流程。由于HIV RNA具有多聚腺苷酸化特征，无需额外处理，可直接进行MeRIP-Seq和BS-Seq操作。

RNA提取流程示意图；mRNA筛选与测序步骤；数据图显示RNA纯度。
图1：下游应用的RNA制备。A) 显示RNA制备及用于同时进行MeRIP-Seq和BS-Seq流程的示意图。每个实心六边形代表一种RNA修饰类型，例如m6A（绿色）或m5C（粉色）。图中标注了实验所需RNA材料的用量。B) 代表性结果，展示总RNA提取（上图）和poly-A筛选（下图）后预期的RNA分布特征（片段大小和数量）。样品使用标准灵敏度试剂盒在片段分析仪上进行检测，以评估进入特定MeRIP-Seq和BS-Seq步骤前的RNA质量。RQN：RNA质量数；nt：核苷酸。请点击此处查看该图的放大版本。

MeRIP-Seq 流程是一种基于RNA免疫沉淀的技术，可用于研究RNA分子上m6A修饰的分布情况。该方法首先将RNA片段化，然后与偶联磁珠的m6A特异性抗体共同孵育，以进行免疫沉淀和捕获。对MeRIP富集的RNA片段以及未经处理的输入样本（input）进行测序并比较，从而鉴定出发生m6A修饰的RNA区域，进而识别m6A甲基化的转录本（图2A）。该技术的分辨率依赖于RNA片段化的效率，较短的片段有助于更精确地定位m6A修饰位点。在此实验中，细胞内poly-A筛选的RNA和病毒RNA在20 µL终体积中，使用RNA片段化缓冲液进行离子介导的片段化处理15分钟，获得长度为100–150 nt的RNA片段。从5 µg mRNA起始，回收得到4.5 µg片段化RNA，回收率达90%（图2B）。取100 ng片段化并纯化的RNA作为输入对照，直接用于文库构建和测序。剩余RNA（约4.4 µg）则按照MeRIP-Seq流程进行处理，即先将片段化RNA与连接了抗m6A特异性抗体的磁珠或作为对照的抗IgG抗体磁珠共同孵育。使用2.5 µg片段化RNA进行m6A特异性RIP（MeRIP），可回收约15 ng富集m6A的RNA材料，用于后续文库构建和测序（图2B）。如预期所示，使用抗IgG抗体作为对照的RIP未能获得足量RNA，无法进行进一步分析（图2B）。

MeRIP-Seq mRNA分析；m⁶A RIP示意图显示测序方法、数据分析和比较结果。
图2：MeRIP-Seq 流程图。 A) MeRIP-Seq 实验流程及输入对照的示意图。经 poly-A 筛选后，样本被片段化为 120–150 nt 的片段，其中一部分直接用于测序（100 ng，输入对照），另一部分用于RNA免疫沉淀（2.5 µg，RIP），后者使用抗-m6A 特异性抗体或抗-IgG 抗体作为阴性对照，随后进行测序。 B) 代表性结果展示片段化后（上图）和免疫沉淀后（下图，MeRIP：左，IgG 对照：右）预期的RNA分布谱（大小和含量）。样品经片段分析仪检测以评估RNA质量和浓度，再进行文库构建和测序。片段化RNA分析采用RNA标准灵敏度试剂盒，免疫沉淀RNA则使用高灵敏度试剂盒。 请点击此处查看该图的放大版本。

BS-Seq 分析流程可在核苷酸分辨率水平上探索 RNA 的 m5C 修饰，并实现对 m5C 甲基化转录本的鉴定。经亚硫酸氢盐转化后，未甲基化的胞嘧啶会转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变（图 3A）。由于亚硫酸氢盐转化过程的反应条件较为剧烈（即 高温和低 pH），转化后的 mRNA 会出现严重降解（图 3B），但该降解现象不会影响文库构建与测序。亚硫酸氢盐转化仅对单链 RNA 有效，因此可能受到双链 RNA 二级结构的阻碍。为评估胞嘧啶向尿嘧啶转化的效率，我们引入了两个对照。作为阳性对照，我们利用了先前报道的 28S rRNA 第 4447 位胞嘧啶高度甲基化的特征23。通过 RT-PCR 扩增并测序包含该甲基化位点在内的约 200 bp 片段后，我们观察到除第 4447 位的胞嘧啶保持不变外，其余所有胞嘧啶均成功转化为尿嘧啶，因此在 DNA 序列中表现为胸腺嘧啶。为控制亚硫酸氢盐转化率，我们使用了 commercially available synthetic ERCC RNA 序列作为对照。该混合物包含一组已知的、未甲基化且带有 poly-A 尾巴的 RNA 序列，具有多样的二级结构和长度。在完成文库构建与测序后，我们重点分析这些 ERCC 序列，通过统计所有 ERCC 序列中每个样本内总胞嘧啶残基中被转化的 C 数量，计算转化率。我们获得的转化率达到 99.5%，证实了亚硫酸氢盐转化反应的高效性与成功（图 3D）。

亚硫酸氢盐转化过程，mRNA测序示意图，DNA分析，转化率图。
图3：BS-Seq分析流程。A) BS-Seq工作流程示意图。经过poly-A筛选后，样本经亚硫酸氢盐处理，导致未甲基化的胞嘧啶（C）残基发生脱氨反应，转化为尿嘧啶（U）。相比之下，甲基化的胞嘧啶残基（m5C）不受亚硫酸氢盐处理影响，保持不变。B) 使用标准灵敏度试剂盒在片段分析仪上分析亚硫酸氢盐转化后RNA的分布情况（大小和含量）的代表性结果。C) 毛细管电泳图显示对28S rRNA中第4447位100%甲基化胞嘧啶（以蓝色高亮）周围区域进行RT-PCR扩增产物的代表性测序结果。相比之下，参考序列中的胞嘧啶残基因成功发生亚硫酸氢盐转化，在扩增子序列中被识别为胸腺嘧啶（T）残基。D) 通过分析HIV感染与非感染细胞中ERCC外参序列评估C-U转化率。平均转化率达到99.5%。请点击此处查看该图的放大版本。

经过m6A富集、亚硫酸氢盐转化的样本以及输入对照样本将进一步进行文库构建、测序和生物信息学分析（图4）。根据实验设计和所研究的生物学问题，可应用多种生物信息学分析方法。作为原理验证，本文展示了一种潜在应用（即，差异甲基化分析）的代表性结果，该分析聚焦于鉴定HIV感染后诱导产生的差异甲基化转录本。简而言之，我们在未感染和HIV感染的细胞中，独立于基因表达水平，分别考察了转录本的m6A或m5C甲基化水平，以进一步理解RNA甲基化在病毒生命周期中的作用。在对基因表达数据进行标准化后，我们发现ZNF469转录本的m6A甲基化状态随感染状态而变化：该转录本在未感染细胞中未发生甲基化，而在HIV感染后则出现多个甲基化峰（图5A）。对m5C的类似差异甲基化分析显示，PHLPP1转录本包含多个甲基化位点，且在HIV感染条件下更倾向于发生甲基化（图5B）。上述结果表明，HIV感染会影响细胞的表观转录组。

m6A 和 m5C RNA 测序流程；流程图、FASTQ 文件处理、比对、峰检测。
图 4：m6A 和 m5C 数据分析的生物信息学流程示意图。 请点击此处查看该图的放大版本。

ZNF469、PHLPP1的基因组定位；HIV整合、序列变异图谱、染色体分析。
图5：感染后差异甲基化转录本的示例。A) 代表性结果显示HIV感染细胞（绿色）与未感染细胞（灰色）中ZNF459转录本的m6A甲基化情况。y轴显示经输入表达量校正后的峰强度，x轴显示染色体上的位置。差异甲基化分析表明，ZNF469转录本在HIV感染后呈现高甲基化。 B) HIV感染细胞（上排）与未感染细胞（下排）中m5C甲基化基因的代表性结果。每个条形的高度代表每个核苷酸的测序读段数，用于评估覆盖度。每个C残基以红色表示，甲基化的C比例以蓝色表示。每个C残基上方标出了确切的甲基化率（%）。箭头标示出具有统计学显著性的差异甲基化C位点。样本使用IGV浏览器进行可视化。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

RNA修饰在病毒感染中的作用目前仍 largely 未知。深入理解表观转录组修饰在病毒感染背景下的作用，可能有助于寻找新的抗病毒治疗靶点。

在本研究中，我们提供了一个完整的工作流程，可用于分析感染细胞中m6A和m5C的表观转录组。根据具体的生物学问题，我们建议使用poly-A筛选的RNA作为起始材料。尽管该流程也可使用总RNA进行（此步骤为可选），但需注意的是，rRNA以及小RNA具有高度修饰性，含有大量甲基化残基，这可能导致有意义的测序数据在质量和数量上下降。

然而，如果研究的重点是非多聚腺苷酸化RNA，则应调整RNA提取步骤，以避免丢弃小RNA（在基于柱法的RNA提取中），并优先采用核糖体耗竭技术而非多聚A选择技术进入后续流程。

为了确保获得高质量的 RNA、正确的片段化以及适用于文库构建的 m6A 富集和亚硫酸氢盐转化 RNA 的质量，我们强烈建议使用片段分析仪或生物分析仪。然而，此类设备并非总是可用。作为替代方案，可通过琼脂糖凝胶电泳观察来评估 RNA、mRNA 的质量以及片段化后 RNA 的大小。此外，也可在不预先检测 RNA 量的情况下直接进行文库构建。

我们采用基于抗体的MeRIP-Seq16技术来研究m6A表观转录组景观。该技术基于RNA免疫沉淀，已被证实有效；然而，其中某些步骤需要仔细优化，可能至关重要。尽管已有研究指出m6A甲基化主要发生在RRA*CH共识序列内，但该基序在mRNA分子中出现频率很高，无法实现甲基化位点的精确定位。因此，获得可重复且一致的RNA片段化，生成较小的RNA片段，对于提高基于RIP的分辨率至关重要。在本实验方案中，我们推荐一种经过优化的流程，在我们的实验条件下可获得可重复且一致的结果；然而，该片段化步骤可能需要根据具体样本特征进一步优化。

最近描述了一种允许m6A直接测序的新技术。该技术基于使用特定的逆转录酶变体，这些变体在遇到m6A RNA修饰时会表现出独特的逆转录特征24。该技术经过仔细优化后，有望克服MeRIP-Seq面临的主要局限性（减少起始材料用量并实现更高分辨率）。为了研究m5C修饰，我们决定采用亚硫酸氢盐转化技术，以在核苷酸分辨率水平上检测被修饰的胞嘧啶残基。为了降低因RNA二级结构存在而导致的假阳性率，我们进行了3轮变性/亚硫酸氢盐转化，并利用ERCC外参对照进一步控制亚硫酸氢盐转化效率。该技术的一个局限性在于，亚硫酸氢盐转化条件非常剧烈，三轮变性/亚硫酸氢盐转化可能导致部分RNA降解，从而降低分辨率。然而，在本实验设置中，我们选择接受可能略低的分辨率，以提高数据集的整体质量。

得益于这些优化和对照措施，我们能够提供一种可靠且严谨的工作流程，可用于研究表观转录组景观及其在病毒感染、宿主-病原体相互作用或任何特定处理暴露条件下的改变。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由瑞士国家科学基金会（资助号 31003A_166412 和 314730_188877）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
AccuPrime Pfx SuperMixInvitrogen12344-040
抗m6A抗体_克隆17-3-4-1MilliporeMABE1006
氯仿默克67-66-3
ERCCInvitrogen4456740
EZ RNA甲基化检测试剂盒Zymo ResearchEZR5001
Fragment analyzer RNA试剂盒 - 高灵敏度RNA试剂盒安捷伦DNF-472-0500
Fragment analyzer RNA Kit - RNA试剂盒安捷伦DNF-471-0500
高容量 cDNA 反转录试剂盒应用生物系统公司4368814
Illumina TruSeq 链特异性 mRNAIllumina20020594
磁珠A/G混合液默克16-663
N6-甲基腺苷，5′-单磷酸钠盐（m6A）Sigma AldrichM2780-10MG
正常小鼠 IgGMerk12371
Oligo(dT)25Life Technologies61005,
PCRapaceStratec1020220300
Quick RNA病毒提取试剂盒Zymo Research1034
RNA纯化 &和浓缩器Zymo ResearchR1015
RNA片段化试剂AmbionAM8740
RNase 抑制剂AmbionAM2684
TrizolTRIzol试剂15596026

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探索病毒感染期间的 m6A 和 m5C 表观转录组：以 HIV 为例
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