我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器,来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。
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我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器,来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。
细胞外囊泡(EVs)的生理与病理生理作用日益受到重视,使得EV研究领域迅速发展。目前存在多种EV分离方法,每种方法在EV的下游得率和纯度方面各有优缺点。因此,对采用特定方法从特定来源分离得到的EV样本进行表征,对于正确解读下游实验结果以及不同实验室间结果的比较至关重要。目前已有多种方法可用于测定EV的大小和数量,这些参数可能因疾病状态或对外部条件的响应而发生变化。纳米颗粒追踪分析(NTA)是用于单个EV高通量分析的重要技术之一。本文介绍了一种利用NTA领域重大技术突破的新型仪器,对从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离的EV进行定量和粒径测定的详细实验方案。结果表明,该方法可对采用不同方法从不同来源分离的EV提供可重复且可靠的总颗粒浓度和粒径分布数据,并已通过透射电子显微镜得到验证。该仪器在NTA中的应用将有助于推动NTA方法的标准化,提升EV研究的严谨性和可重复性。
细胞外囊泡(EVs)是一类由几乎所有细胞类型分泌的微小(0.03–2 µm)膜性囊泡1。根据其释放机制和大小,这些囊泡常被称为“外泌体”、“微囊泡”或“凋亡小体”2。早期认为EVs仅是细胞清除废物以维持稳态的一种简单方式3,但现在已知它们还可通过传递包括DNA、RNA(mRNA、microRNA)、脂质和蛋白质在内的分子物质参与细胞间通讯4,5,并在正常生理过程及病理过程中发挥重要的调控作用1,5,6,7,8。
分离和定量EVs的方法有多种,已在其他地方有所描述9,10,11,12分离方案的选择以及EV的来源会显著影响EV的得率和纯度。即使是长期以来被视为外泌体分离“金标准”的差速离心法,也可能存在较大的实验变异性,进而影响所获得的EV群体及其后续分析结果。13因此,细胞外囊泡分离与定量的各种不同方法使得文献中报道的实验结果难以进行比较、重复和解释。14此外,细胞外囊泡(EV)的释放可受到细胞状态或多种外界因素的调控。有研究表明,EV可通过保护细胞免受细胞内应激损伤,在维持细胞稳态中发挥重要作用。15,因为多项研究表明,细胞应激会促进细胞外囊泡(EV)的分泌。例如,在细胞暴露于缺氧、内质网应激、氧化应激、机械应激、香烟烟雾提取物以及颗粒物空气污染后,均已报道EV释放增加16,17,18,19,20,21,22。EV 的释放也已被证明会受到修饰 体内 高脂饮食或禁食16小时的小鼠释放的脂肪细胞EVs增多23为了研究特定处理或条件是否改变细胞外囊泡(EV)的释放,必须准确测定EV的数量。对EV大小分布的评估还可能提示EV的主要亚细胞来源(例如,晚期内体/多泡体与质膜融合 versus 质膜出芽)。24因此,需要有可靠的方法来准确测量所研究的EV制备物的总浓度及其粒径分布。
一种快速且高度灵敏的溶液中细胞外囊泡(EVs)可视化与表征方法是纳米颗粒追踪分析(NTA)。该方法的原理以及与其他EVs粒径和浓度检测方法的比较此前已有详细阐述25,26,27,28。简而言之,在NTA检测过程中,当EVs被激光束照射时,通过其散射的光进行可视化。散射光经显微镜聚焦到相机上,记录颗粒的运动轨迹。NTA软件追踪每个颗粒的随机热运动(即布朗运动),以确定扩散系数,并利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算每个颗粒的粒径。NTA首次应用于生物样本中EVs的检测是在2011年25。直到最近,仅有两家主流公司提供商用NTA仪器29,随后ViewSizer 3000(下文简称颗粒追踪仪器)的推出,通过结合创新的硬件与软件解决方案,克服了其他NTA技术的重大局限性。
粒子追踪仪器通过分析液体样品中纳米颗粒的布朗运动来表征其特性,并通过分析微米级较大颗粒的重力沉降来表征其特性。该仪器独特的光学系统包含三个激光光源(波长分别为450 nm、520 nm和635 nm)的多光谱照明,使研究人员能够同时分析多种粒径范围的颗粒(如外泌体、微囊泡)。图1展示了该仪器的装置示意图。
本文展示了如何利用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪,对分离的小鼠和人源细胞外囊泡(EVs)进行粒径分布和浓度测定。

图1:颗粒追踪仪光学系统。 纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)使用三种不同波长的激光照射颗粒,分别为:450 nm、520 nm 和 635 nm。通过位于比色皿90°方向的数码摄像机检测并追踪单个颗粒散射的光信号,进行视频记录。请点击此处查看该图的放大版本。
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所有涉及这些样本的操作均遵循机构动物护理和使用委员会以及机构审查委员会的指南。NTA 方法的示意图见图2。

图 2:使用颗粒示踪仪器的纳米颗粒示踪分析(NTA)方法概述。 样品制备完成后插入仪器中。打开NTA软件,调整记录参数,并对样品进行聚焦。随后,记录、处理并显示数据。 请点击此处查看该图的放大版本。
1. 细胞外囊泡的分离
注意:小鼠性腺周围脂肪组织的细胞外囊泡(EV)的分离方法如前所述23。血浆EV从1 mL人血浆中分离,采用以下方案:
2. 分离的细胞外囊泡的纯化
3. 样品洗脱
4. 纳米颗粒跟踪分析的样品制备

图 3:插入件在石英比色皿中的正确取向。 插入件的“缺口”应从比色皿正面可见。将比色皿插入仪器时,应使缺口面向相机。 请点击此处查看此图的放大版本。

图4:空白样品在合适浓度范围内稀释液的代表性实时流图像。 将细胞外囊泡(EV)样品用过滤后的(推荐0.02 µm或3 kDa)PBS稀释。良好的空白样品在实时观察中每视野应显示约1-10个颗粒,对应的浓度范围为105-106。 请点击此处查看该图的放大版本。
5. 粒子示踪仪的启动程序

图 5:样品池在粒子追踪仪器中的正确取向。 样品池的正面(可看到插入件的“缺口”)应朝向相机。请点击此处查看该图的放大版本。

图6:显示颗粒聚焦状态的代表性实时画面。(A)颗粒未聚焦的实时画面示例。颗粒呈现类似光晕的辉光或显得模糊。需调整焦距。(B)颗粒处于正确聚焦状态的实时画面示例。最小的颗粒清晰对焦。此时开始记录。请点击此处查看该图的放大版本。

图7:代表性的实时成像画面,展示不同颗粒稀释度下的情况。(A)浓度过高的样本实时成像示例。若样本浓度过高,将导致结果不准确。(B)稀释适当的样本实时成像示例。屏幕上可见60–100个颗粒,记录所得原始浓度为5 × 106–2 × 108 个颗粒/mL。(C)稀释过度的样本实时成像示例。若样本过于稀释,则被追踪的颗粒数量不足,样本量降低,因此结果在统计学上无效。在此情况下,建议增加录制视频的数量。请点击此处查看该图的放大版本。
6. 视频数据采集
7. 处理采集的数据
8. 显示并解读结果
9. 清洗比色皿
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在本演示之前,首先通过测量聚苯乙烯微球标准品的粒径分布来验证仪器的校准情况,以确保所获取数据的有效性。我们使用本方案推荐的默认记录参数和处理设置,测试了100 nm和400 nm微球的粒径分布(图8)。
对于100 nm的聚苯乙烯微球标准品,测得浓度为4.205 × 107 个颗粒/mL。平均粒径(标准差,SD)为102(±17)nm,变异系数(CV)为0.16。D10/D50/D90值分别为76/104/126 nm。这表明粒子追踪仪器对100 nm单分散微球的粒径报告准确。对于400 nm的聚苯乙烯微球标准品,浓度为4.365 × 107 个颗粒/mL。平均粒径(SD)为391(±47)nm,CV为0.12。D10/D50/D90值分别为150/358/456 nm(表3)。尽管报告的平均粒径与微球的实际尺寸非常接近,但可以看出本方案中所用的仪器设置对约100 nm的小颗粒更为准确。因此,对于大于400 nm的颗粒,建议优化激光参数。研究人员...
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本文展示了一种通过纳米颗粒跟踪分析(NTA)检测细胞外囊泡(EV)的方案,可同时测量多种粒径范围的粒径分布,并测定多分散样品中EV的总浓度。本研究中使用小鼠腹股沟脂肪组织和人血浆作为EV来源,但其他组织或生物液体(如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水及细胞培养上清液)中分离得到的EV也可用于NTA检测。通过测定聚苯乙烯标准微球,确认仪器已正确校准,并证明该NTA仪器能够准确测量直径≤400 nm的纳米颗粒。随后对小鼠组织EV样品进行不同稀释倍数的检测。如图9所示,所报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化,符合预期,表明仪器在不同稀释条件下对颗粒浓度的检测具有较高准确性,且技术重复之间的变异较小。然而,该结果仅在颗粒浓度处于仪器工作范围(每毫升5×106至2×108个颗粒)内时成立;因此,适当稀释样品是本方案中的关键步骤。校正稀释倍数后,四种不同稀释度下测得的样品总颗粒浓度估算值基本一致,四次检测间的变异系数(CV)为15.1%。此外,对同一样品多次稀释后重复测量的结果显示,粒径分布评估具有良好的精确性:颗粒浓度随稀释倍数成比例变化,而报告的粒径...
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所有作者均声明不存在利益冲突。
本工作得到了美国国立卫生研究院(ES030973-01A1、R01ES025225、R01DK066525、P30DK026687、P30DK063608)的支持。我们感谢HORIBA Instruments Incorporated公司的Jeffrey Bodycomb博士在仪器校准方面的帮助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1X dPBS | VWR | 02-0119-1000 | 用于稀释样品 |
| 100 nm 乳胶微球标准品 | Thermo Scientific | 3100A | 用于测试 ViewSizer 3000 的校准 |
| 400 nm 乳胶微球标准品 | Thermo Scientific | 3400A | 用于测试 ViewSizer 3000 的校准 |
| 离心过滤单元 | Amicon | UFC901024 | 用于过滤 PBS 稀释液 |
| 收集管,2 mL | Qiagen | 19201 | 用于人血浆细胞外囊泡的分离 |
| 压缩空气除尘器 | DustOff | DPSJB-12 | 用于清洁比色皿 |
| 比色皿插件 | HORIBA Scientific | - | 随 ViewSizer 3000 购买时提供 |
| 比色皿定位夹具 | HORIBA Scientific | - | 在将插件放入比色皿时用于固定磁力搅拌子;随 ViewSizer 3000 购买时提供 |
| 去离子水 | VWR | 02-0201-1000 | 用于清洁比色皿 |
| 配备显示器、键盘、鼠标及所有必要线缆的台式计算机 | Dell | - | 随 ViewSizer 3000 购买时提供 |
| 乙醇(70–100%) | Millipore Sigma | - | 用于清洁比色皿 |
| ExoQuick ULTRA | System Biosciences | EQULTRA-20A-1 | 用于人血浆细胞外囊泡的分离 |
| 带盖玻璃闪烁小瓶 | Thermo Scientific | B780020 | 用于清洁比色皿 |
| "Hook" 工具 | Excelta | - | 随 ViewSizer 3000 购买时提供 |
| 无尘超细纤维布 | Texwipe | TX629 | 用于清洁比色皿及覆盖工作台面 |
| 微量离心管,2 mL | Eppendorf | 22363344 | 用于人血浆细胞外囊泡的分离 |
| 搅拌子 | Sp Scienceware | F37119-0005 | |
| 带盖 Suprasil 石英比色皿 | Agilent Technologies | AG1000-0544 | 初次购买 ViewSizer 3000 时提供 |
| ViewSizer 3000 | HORIBA Scientific | - | 纳米颗粒追踪分析仪 |
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