纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

摘要

我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。

摘要

细胞外囊泡（EVs）的生理与病理生理作用日益受到重视，使得EV研究领域迅速发展。目前存在多种EV分离方法，每种方法在EV的下游得率和纯度方面各有优缺点。因此，对采用特定方法从特定来源分离得到的EV样本进行表征，对于正确解读下游实验结果以及不同实验室间结果的比较至关重要。目前已有多种方法可用于测定EV的大小和数量，这些参数可能因疾病状态或对外部条件的响应而发生变化。纳米颗粒追踪分析（NTA）是用于单个EV高通量分析的重要技术之一。本文介绍了一种利用NTA领域重大技术突破的新型仪器，对从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离的EV进行定量和粒径测定的详细实验方案。结果表明，该方法可对采用不同方法从不同来源分离的EV提供可重复且可靠的总颗粒浓度和粒径分布数据，并已通过透射电子显微镜得到验证。该仪器在NTA中的应用将有助于推动NTA方法的标准化，提升EV研究的严谨性和可重复性。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞类型分泌的、大小为0.03–2 µm的膜性小泡¹。根据其释放机制和大小不同，常被称为“外泌体”、“微囊泡”或“凋亡小体”²。早期认为EVs仅是细胞清除废物以维持内环境稳态的一种简单方式³，但现在已知它们还可通过传递包括DNA、RNA（mRNA、microRNA）、脂质和蛋白质在内的分子物质参与细胞间通讯^4,5，并在正常生理过程及病理过程中发挥重要的调控作用^1,5,6,7,8。

分离和定量EVs的方法有多种，已在其他地方有所描述^9,10,11,12分离方案的选择以及EV的来源会显著影响EV的得率和纯度。即使是长期以来被视为外泌体分离“金标准”方法的差速离心法，也可能存在较大的实验变异性，进而影响所获得的EV群体及其后续分析结果。¹³因此，目前存在的多种不同细胞外囊泡（EV）分离与定量方法，使得文献中报道的实验结果难以进行比较、重复和解读。¹⁴此外，细胞外囊泡（EV）的释放可受到细胞状态或多种外界因素的调控。有研究表明，EV可通过保护细胞免受细胞内应激损伤，在维持细胞稳态中发挥重要作用。¹⁵，因为多项研究表明，细胞应激会促进细胞外囊泡（EV）的分泌。例如，在细胞暴露于缺氧、内质网应激、氧化应激、机械应力、香烟烟雾提取物以及颗粒物空气污染后，均已报道EV释放增加^{16,17,18,19,20,21,22}。已有研究表明，EV的释放也会被改变 体内 高脂饮食或禁食16小时的小鼠释放的脂肪细胞EVs更多²³为了研究特定处理或条件是否改变细胞外囊泡（EV）的释放，必须准确测定EV的数量。对EV大小分布的评估还可能提示EV的主要亚细胞来源（例如，晚期内体/多泡体与质膜融合 versus 质膜出芽）。²⁴因此，需要建立可靠的方法来准确测定所研究的EV制备物的总浓度及其粒径分布。

一种快速且高灵敏度的溶液中细胞外囊泡（EVs）可视化与表征方法是纳米颗粒追踪分析（NTA）。该方法的原理以及与其他EVs粒径和浓度检测方法的比较此前已有详细阐述^25,26,27,28。简而言之，在NTA测量过程中，当EVs被激光束照射时，通过其散射的光进行可视化。散射光经显微镜聚焦到相机上，记录颗粒的运动轨迹。NTA软件追踪每个颗粒的随机热运动（即布朗运动），以确定扩散系数，并利用斯托克斯-爱因斯坦方程计算每个颗粒的粒径。NTA首次应用于生物样本中EVs的测量是在2011年²⁵。直到最近，仅有两家主流公司提供商用NTA仪器²⁹，随后ViewSizer 3000（下文简称颗粒追踪仪器）的推出，通过结合创新的硬件与软件解决方案，克服了其他NTA技术的显著局限性。

该颗粒追踪仪器通过分析液体样品中纳米颗粒的布朗运动，以及较大微米级颗粒的重力沉降行为，对其进行表征。仪器独特的光学系统包含三个激光光源（波长分别为450 nm、520 nm和635 nm）的多光谱照明，使研究人员能够同时分析多种粒径范围的颗粒（如外泌体、微囊泡）。图1展示了仪器装置的示意图。

本文展示了如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪（NTA）对分离的小鼠和人源EV进行粒径分布及浓度测定。

图1：颗粒追踪仪器的光学系统。 NTA仪器使用三种波长的激光照射颗粒，分别为：450 nm、520 nm、635 nm。通过位于比色皿90°方向的数字摄像机检测并追踪单个颗粒散射的光，进行视频记录。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

所有涉及这些样本的操作均遵循机构动物护理和使用委员会以及机构审查委员会的指南。NTA 方法的示意图见图2。

图2：使用颗粒示踪仪器的NTA方法概述。 样品制备完成后插入仪器中。打开NTA软件，调整记录参数，并对样品进行聚焦。随后，进行数据记录、处理和显示。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 细胞外囊泡的分离

注意：小鼠性腺周围脂肪组织的细胞外囊泡（EV）的分离方法如前所述²³。血浆EV从1 mL人血浆中分离，采用以下方案：

1. 收集血浆并在 3,000 × g 条件下离心 15 分钟，以去除细胞碎片。将上清液转移至新管中。
   注意：如果仍可检测到额外碎片，请将上清液在 12,000 × g 条件下再离心 10 分钟，并将上清液转移至新管中。
2. 每 250 µL 血浆中加入 67 µL 外泌体分离试剂。通过倒置或轻弹管壁充分混匀。
3. 将样品直立置于冰上孵育 30 分钟。
4. 将外泌体分离试剂与血浆的混合物在 4 °C 条件下以 3,000 × g 离心 10 分钟。
   注意：离心可在室温或 4 °C 进行，结果相似，但推荐使用 4 °C。离心后，EVs 可能在管底形成浅 beige 或白色沉淀。
5. 小心吸除上清液。短暂离心以收集残留的外泌体分离溶液，并彻底吸除所有液体，注意切勿扰动沉淀中的 EVs。
6. 将沉淀重悬于 200 µL 缓冲液 B（由生产商提供）中。使用分光光度计、荧光计、Bradford 法或其他常用方法测定并记录样品的蛋白浓度（用于步骤 2.8）。

2. 分离EV的纯化

1. 向重悬的EVs中加入200 µL缓冲液A（由制造商提供）。
2. 取出纯化柱（已提供），松开螺口盖，并折断底部封闭端。将纯化柱放入收集管中。
   注意：请保留底部封闭端，用于步骤2.7–2.9。
3. 在1,000 × g 条件下离心30秒，以去除保存缓冲液。
4. 弃去穿流液，并将纯化柱重新放回收集管中。
5. 为洗涤纯化柱，取下顶部盖子，在树脂上方加入500 µL缓冲液B，然后在1,000 × g 条件下离心30秒。弃去穿流液。请保留顶部盖子，用于步骤2.7–2.9。
6. 重复步骤2.4–2.5一次，以进一步洗涤纯化柱。
7. 用步骤2.2中取下的底部封闭端堵住纯化柱底部。在树脂上方加入100 µL缓冲液B，以准备上样。
8. 将步骤1.6中的全部内容（或相当于总蛋白量最多4 mg的体积）加入树脂中。将螺口盖盖在纯化柱顶部。
9. 在室温下置于旋转摇床上混合，时间不超过5分钟。

3. 样品洗脱

1. 松开螺口盖并取下柱底盖，立即转移至一个 2 mL 微量离心管中。
   ​注意：一旦取下柱底盖，样品将立即开始洗脱。请确保已准备好 2 mL 微量离心管以接收洗脱液，以尽量减少样品损失。
2. 在 1,000 x g 条件下离心 30 秒，以获得纯化的细胞外囊泡（EVs）。弃去层析柱。

4. 纳米颗粒跟踪分析的样品制备

1. 使用无绒材料（如超细纤维布）覆盖工作区域，防止纤维进入比色皿中。
2. 佩戴手套后，将比色皿放置于磁力比色皿夹具上，然后将搅拌子放入比色皿中。操作比色皿时务必始终佩戴手套，以避免在比色皿表面留下指纹或污渍。
3. 使用钩状工具将插入件放入比色皿中，如图3所示。请注意插入件的方向，以便后续步骤使用（步骤5.4）。

图3：插入件在石英比色皿中的正确取向。 插入件的“缺口”应从比色皿正面可见。将比色皿放入仪器时，应使该缺口面向相机。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 使用移液器，通过插入件上的孔将 400–500 µL 室温的稀释液或稀释后的样品缓慢加入比色皿中。轻轻吹打混匀，避免引入气泡。
   1. 首先准备一个装有所选稀释液（空白对照）的比色皿，用于测量稀释液的颗粒浓度。应在测量样品前完成此步骤，以便校正样品的背景浓度。
      注意：良好的空白对照（本例中为磷酸盐缓冲液 [PBS]）其浓度应<9 × 10⁶（取决于稀释液种类），在实时观察中每屏幕显示 1–10 个颗粒（图 4）。建议实际样品的颗粒浓度至少为背景浓度的 3 倍。
   2. 可选步骤：在记录样品前，可先用 400–500 µL 稀释液或稀释后的样品预润洗比色皿。操作方法为：将 400–500 µL 稀释后的样品加入比色皿，弃去溶液，再加入 400–500 µL 新鲜样品用于测量。此步骤有助于清除比色皿内的残留物。

图 4：空白样本在合适浓度范围内稀释液的代表性实时流画面。 使用过滤后的 PBS（推荐 0.02 µm 或 3 kDa）稀释 EV 样品。良好的空白样本在实时观察中每视野应显示约 1-10 个颗粒，对应的浓度范围为 10⁵-10⁶。 请点击此处查看此图的放大版本。

5. 盖上比色皿盖，检查是否有气泡。如有必要，轻敲去除气泡。使用无绒布擦拭比色皿外表面。

5. 粒子示踪仪器的启动程序

1. 打开计算机工作站和仪器，运行第一个样品前等待几分钟，然后单击软件图标启动程序。当屏幕提示时，单击NTA以进行纳米颗粒追踪分析。从Recording选项卡开始，在整个实验流程中通过单击不同的软件选项卡（Record, Process, Plot）在各功能间切换。首先记录样品（稀释液或EV制备物），然后处理记录数据，最后绘制结果。
2. 按照屏幕上的指示填写有关样品的所有必要信息。检查所有必填字段是否已完整且准确填写，例如：样品名称、描述、样品制备方法、稀释倍数 [1000]、目标温度（设定为 22 °C），以及稀释液：从下拉菜单中选择稀释液，并使用 PBS 作为 EV 的稀释液。从下拉菜单中选择 PBS 将自动填充盐度为 9%。这些信息对于确定液体的动态黏度至关重要。
   注意：即使探头已显示达到目标温度（即绿色圆点稳定），样品池内部温度达到平衡仍可能需要长达 3 分钟。如果未正确设置目标温度，样品读数可能会有显著差异，因为样品温度的变化会显著影响颗粒的布朗运动。
3. 打开仪器盖板，取下覆盖在样品池放置位置上的保护帽。
   警告：该颗粒追踪仪器被认证为 1 类激光产品（21 CFR Ch. I part 1040），内部含有潜在危险的激光，可能导致烧伤和/或永久性视力损伤。为防止意外或伤害，请勿通过拧下侧面螺栓的方式拆除仪器外壳。请注意，在正常操作过程中，激光束完全封闭在仪器内部，不会对用户构成威胁。此外，仪器的样品架内置有磁性安全联锁装置，当样品架盖板被移除时，可防止激光运行。
4. 将步骤 4.3 中的样品池以正确方向放入仪器内（参见图 5）。将盖帽重新盖在样品池上，并关闭仪器盖板。操作仪器时，必须始终在样品架上安装盖帽。切勿禁用或试图绕过安全联锁功能。

图 5：粒子追踪仪器中比色皿的正确朝向。 比色皿的正面（可看到插入件的“缺口”）应面向相机。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 单击Streaming上方的箭头以开启相机。
6. 单击下拉箭头展开Record设置。将增益（Gain）和激光功率（Laser power）设置为适用于当前应用的数值。有关小尺寸（100 nm）EVs进行NTA时所用参数，请参见Table 1（以及Supplemental Figure 1）。
   注意：通过单击下拉箭头访问的这些高级设置可能受密码保护。记录和处理稀释液（空白样）时，应使用与后续样品相同的设置。
7. 调节焦距，直至颗粒清晰对焦。对焦时应选择相对较小的颗粒进行（图6）。对于小EVs定量分析（与外泌体一致），推荐使用以下录制参数：帧率：30 fps，曝光时间：15 ms，搅拌时间：5 s，等待时间：3 s，激光功率—蓝色：210 mW，绿色：12 mW，红色：8 mW，每段视频帧数：300帧，增益：30 dB。
   注意：用户可将缩放（Zoom）调至1x和/或提高增益以辅助对焦。请务必在录制视频前将这些参数重新设为推荐值。

图6：显示粒子聚焦状态的代表性实时画面。（A）粒子未聚焦时的实时画面示例。粒子呈现类似光晕的模糊轮廓。请调整焦距。（B）粒子正确聚焦时的实时画面示例。最小的粒子清晰可见。可开始记录。请点击此处查看此图的放大版本。

8. 进行目视质量检查，以确保样品已适当稀释。如果样品浓度过高，请将比色皿从仪器中取出，并逐步进行稀释。重复此过程，直至样品达到适当稀释程度，然后进入第6步。
   ​注意：切勿过度稀释样品！务必逐级进行稀释。理想的空白样品在屏幕上仅显示少量颗粒（1–4个），如图4所示。对于细胞外囊泡（EV）样品，适当稀释后的样品在屏幕上应可见约20–100个颗粒，且背景无发光样或云雾状图像（参见图7示例）。这将使颗粒浓度处于每毫升5 × 10⁶ 至 2 × 10⁸ 个颗粒的最优范围内（未校正稀释因子）。

图7：代表性的实时流画面，显示不同颗粒稀释程度。（A）样品浓度过高的实时流画面示例。若记录浓度过高的样品，将导致结果不准确。（B）适当稀释样品的实时流画面示例。屏幕上可见60–100个颗粒，记录所得原始浓度为5 × 10⁶–2 × 10⁸ 个颗粒/mL。（C）样品浓度过低的实时流画面示例。若样品过于稀释，则被追踪的颗粒数量不足，样本量降低，因此结果在统计学上无效。此种情况下，建议增加录制视频的数量。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 视频数据采集

1. （可选）将缩放设置为 0.5 倍，以节省带宽并防止丢失帧。
2. 单击录制开始录制视频（推荐的录制参数见表 1）。
   注意：默认情况下，仪器将对样品搅拌 5 秒，静置 3 秒，然后录制 10 秒，再重复此过程。通常录制 50 段视频需要约 15 分钟，处理时间约 13 分钟。
3. 录制视频期间请勿触碰仪器。确保实验台表面无振动。
   注意：建议将仪器放置在防震平台或防震台上，以减少附近设备产生的振动干扰，避免影响纳米颗粒运动的测定。请勿在与颗粒追踪仪器相同的实验台上操作离心机、涡旋混合器或其他可能产生振动的设备。振动在屏幕上通常表现为原本呈圆形的颗粒出现拉长现象。若仪器受到强烈振动，可能需要重新调整光学元件。该仪器未设计为由用户进行维护或校准；如需维护、服务或校准，请联系制造商。
4. 记录下任何可见到大量不规则白色团块（即非常大的颗粒）的视频，并在步骤 7.3 中将其从处理流程中剔除。

7. 处理采集的数据

1. 当出现提示表明视频已录制完成时，点击OK以结束录制。然后选择Process选项卡。
   注意：此处可暂停实验流程。之后可通过打开颗粒追踪仪器的软件，指定已保存录制视频的目录，并直接跳转至Process选项卡，重新启动数据处理。
2. 分析EVs时，勾选Disable auto detection override选项框，并将特征直径（Feature Diameter）设置为30。点击Process。（处理参数参见表2，处理界面参见补充图2）。系统将实时显示分布直方图，以便用户实时查看处理过程。
   1. 对于外泌体（exosomes），使用默认的Polydisperse Sample检测阈值进行处理。仅当溶液中颗粒尺寸差异极大时，才将Detection Threshold Manual设置为0.8，而非标准阈值0.99。
3. 如果某些视频中明显可见极大量大颗粒（参见步骤6.4），请导航至录制视频的存储目录，删除有问题的视频文件。在编辑完视频文件列表后，需同步修改其他由用户维护的日志中记录的视频数量。
4. 处理完成后，点击OK，然后选择Plot选项卡。对于EVs，将主图（Main chart）显示为LogBinSilica。
   ​注意：在Plot选项卡中，用户可自定义图表的其他参数，例如设定x轴（颗粒直径，nm）的范围，以确定生成图表的积分区域。

8. 显示并解读结果

1. 要创建 PDF 报告，请点击 报告 按钮。此时测量已完成，可以查看结果。
   注意：请务必首先记录并处理空白样品，以便校正后续样品的背景颗粒浓度。如果遗漏此步骤，可在样品测量后补录空白样品，并手动校正样品的颗粒浓度。
2. 查看 PDF 报告，报告中显示了平均粒径、中位粒径和众数粒径，以及根据稀释因子校正并扣除分散液颗粒浓度后的颗粒浓度。报告还显示了分布宽度（标准偏差）。
   ​注意：极少有应用场景适合仅用单一数值来代表整体情况。因此，建议描述完整的粒径分布，并报告所分析样品的分布宽度（例如，如 表 3 所示）。
3. 记录生成数据时所使用的以下仪器参数，这些参数在报告结果时应予以说明：分散液（Diluent）、各激光器的激光功率 [mW]、曝光时间 [ms]、增益 [dB]、帧率 [fps]、每段视频的帧数、记录的视频数量、处理设置（例如，LogBinSilica）、积分范围 [最小 nm，最大 nm]（建议将最小值设为 50 nm），以及被追踪的颗粒数量（建议每段视频至少分析约 150 个颗粒；每样品总追踪数建议不少于 3,750，以避免粒径分布中出现人为假象峰，并获得具有统计学意义的数据）。

9. 清洗比色皿

1. 在样品之间手动清洗比色皿。首先，将比色皿中的样品倒空。
   注意：样品可从比色皿中回收保存，也可弃去。
2. 比色皿倒空后，用去离子水（DI水）冲洗10–15次，再用乙醇（70–100%）冲洗3次。操作时，确保溶剂完全充满比色皿。
3. 使用无绒毛的微纤维布擦拭比色皿外壁，避免在表面留下污迹。比色皿内壁可自然晾干，或使用压缩空气除尘器吹干。
   注意：仅可使用镜头纸或无绒毛微纤维布擦拭比色皿的光学表面，因为大多数纸制品含有微小的木质纤维，可能划伤或损坏比色皿表面。
4. 准备两个玻璃闪烁瓶：一个装有70–100%乙醇，另一个装有去离子水。先将插入件或搅拌子放入乙醇瓶中，再放入去离子水瓶中，通过剧烈振荡进行冲洗。使用无绒毛布或压缩空气除尘器将插入件和搅拌子干燥。
   注意：比色皿和插入件也可使用超声水浴进行清洗。若采用此方法，首先确保超声设备内有足够水量（至少5 cm深）。然后将比色皿和插入件放入一个玻璃烧杯（50 mL或更大），向烧杯中加入酒精至与水浴液面齐平，将烧杯置于水中，开启电源。每次超声时间不超过5分钟；若需更长时间，每次5分钟超声后应让设备休息>5分钟。
5. 清洗并干燥完成后，应立即将所有部件妥善存放。

结果

在本演示之前，首先通过测量聚苯乙烯微球标准品的粒径分布来校准仪器，以确保所获取数据的有效性。我们使用本方案推荐的默认记录参数和处理设置，测试了100 nm和400 nm微球的粒径分布（图8）。

对于100 nm的聚苯乙烯微球标准品，测得浓度为4.205 × 10⁷ 个颗粒/mL。平均粒径（标准差，SD）为102（±17）nm，变异系数（CV）为0.16。D10/D50/D90值分别为76/104/126 nm。这表明粒子追踪仪器对100 nm单分散微球的粒径报告准确。对于400 nm的聚苯乙烯微球标准品，浓度为4.365 × 10⁷ 个颗粒/mL。平均粒径（SD）为391（±47）nm，CV为0.12。D10/D50/D90值分别为150/358/456 nm（表3）。尽管报告的平均粒径与微球的实际尺寸非常接近，但可以看出，本方案中使用的仪器设置对约100 nm的小颗粒更为准确。因此，对于大于400 nm的颗粒，建议优化激光参数。研究人员在进行纳...

讨论

本文展示了一种通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测细胞外囊泡（EV）的方案，可同时测量多种粒径范围的粒径分布，并测定多分散样品中EV的总浓度。本研究中使用小鼠腹股沟周围脂肪组织和人血浆作为EV来源，但其他组织或生物液体（如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水及细胞培养上清液）中分离得到的EV也可用于NTA分析。通过对聚苯乙烯标准微球的测量，验证了仪器校准正确，并证明该NTA仪器能够准确测定直径≤400 nm的纳米颗粒。随后测试了小鼠组织EV样品的不同稀释度。如图9所示，所报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，符合预期，表明该仪器在不同稀释度下均可准确检测颗粒浓度，且技术重复之间的变异极小。然而，此结果仅在颗粒浓度处于仪器工作范围（每毫升5×10⁶至2×10⁸个颗粒）内时成立；因此，对样品进行适当稀释是本方案中的关键步骤。校正稀释倍数后，四种不同稀释度测得的样品总颗粒浓度估算值基本一致，在四次稀释中变异系数（CV）为15.1%。此外，对同一样品多个稀释度的重复测量显示，粒径分布评估具有良好的精确性：颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，而报告的粒径测量值则...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	用于稀释样品
100 nm 乳胶微球标准品	Thermo Scientific	3100A	用于测试 ViewSizer 3000 的校准
400 nm 乳胶微球标准品	Thermo Scientific	3400A	用于测试 ViewSizer 3000 的校准
离心过滤单元	Amicon	UFC901024	用于过滤 PBS 稀释液
收集管，2 mL	Qiagen	19201	用于人血浆细胞外囊泡的分离
压缩空气除尘器	DustOff	DPSJB-12	用于清洁比色皿
比色皿插件	HORIBA Scientific	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
比色皿定位夹具	HORIBA Scientific	-	在将插件放入比色皿时用于固定磁力搅拌子；随 ViewSizer 3000 购买时提供
去离子水	VWR	02-0201-1000	用于清洁比色皿
配备显示器、键盘、鼠标及所有必要线缆的台式计算机	Dell	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
乙醇（70–100%）	Millipore Sigma	-	用于清洁比色皿
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	用于人血浆细胞外囊泡的分离
带盖玻璃闪烁小瓶	Thermo Scientific	B780020	用于清洁比色皿
"Hook" 工具	Excelta	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
无尘超细纤维布	Texwipe	TX629	用于清洁比色皿及覆盖工作台面
微量离心管，2 mL	Eppendorf	22363344	用于人血浆细胞外囊泡的分离
搅拌子	Sp Scienceware	F37119-0005
带盖 Suprasil 石英比色皿	Agilent Technologies	AG1000-0544	初次购买 ViewSizer 3000 时提供
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	-	纳米颗粒追踪分析仪