纳米颗粒追踪分析用于细胞外囊泡的定量与粒径测定

摘要

我们演示如何使用一种新型纳米颗粒跟踪分析仪器，来估算从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离出的细胞外囊泡的粒径分布及总颗粒浓度。

摘要

细胞外囊泡（EVs）的生理与病理生理作用日益受到重视，使得EV研究领域迅速发展。目前存在多种EV分离方法，每种方法在EV的下游得率和纯度方面各有优缺点。因此，对采用特定方法从特定来源分离得到的EV样本进行表征，对于正确解读下游实验结果以及不同实验室间结果的比较至关重要。目前已有多种方法可用于测定EV的大小和数量，这些参数可能因疾病状态或对外部条件的响应而发生变化。纳米颗粒追踪分析（NTA）是用于单个EV高通量分析的重要技术之一。本文介绍了一种利用NTA领域重大技术突破的新型仪器，对从小鼠围生殖腺脂肪组织和人血浆中分离的EV进行定量和粒径测定的详细实验方案。结果表明，该方法可对采用不同方法从不同来源分离的EV提供可重复且可靠的总颗粒浓度和粒径分布数据，并已通过透射电子显微镜得到验证。该仪器在NTA中的应用将有助于推动NTA方法的标准化，提升EV研究的严谨性和可重复性。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞类型分泌的微小（0.03–2 µm）膜性囊泡¹。根据其释放机制和大小，这些囊泡常被称为“外泌体”、“微囊泡”或“凋亡小体”²。早期认为EVs仅是细胞清除废物以维持稳态的一种简单方式³，但现在已知它们还可通过传递包括DNA、RNA（mRNA、microRNA）、脂质和蛋白质在内的分子物质参与细胞间通讯^4,5，并在正常生理过程及病理过程中发挥重要的调控作用^1,5,6,7,8。

分离和定量EVs的方法有多种，已在其他地方有所描述^9,10,11,

方案

所有涉及这些样本的操作均遵循机构动物护理和使用委员会以及机构审查委员会的指南。NTA 方法的示意图见图2。

图 2：使用颗粒示踪仪器的纳米颗粒示踪分析（NTA）方法概述。 样品制备完成后插入仪器中。打开NTA软件，调整记录参数，并对样品进行聚焦。随后，记录、处理并显示数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

1. 细胞外囊泡的分离

注意：小鼠性腺周围脂肪组织的细胞外囊泡（EV）的分离方法如前所述

结果

在本演示之前，首先通过测量聚苯乙烯微球标准品的粒径分布来验证仪器的校准情况，以确保所获取数据的有效性。我们使用本方案推荐的默认记录参数和处理设置，测试了100 nm和400 nm微球的粒径分布（图8）。

对于100 nm的聚苯乙烯微球标准品，测得浓度为4.205 × 10⁷ 个颗粒/mL。平均粒径（标准差，SD）为102（±17）nm，变异系数（CV）为0.16。D10/D50/D90值分别为76/104/126 nm。这表明粒子追踪仪器对100 nm单分散微球的粒径报告准确。对于400 nm的聚苯乙烯微球标准品，浓度为4.365 × 10⁷ 个颗粒/mL。平均粒径（SD）为391（±47）nm，CV为0.12。D10/D50/D90值分别为150/358/456 nm（表3）。尽管报告的平均粒径与微球的实际尺寸非常接近，但可以看出本方案中所用的仪器设置对约100 nm的小颗粒更为准确。因此，对于大于400 nm的颗粒，建议优化激光参数。研究人员.......

讨论

本文展示了一种通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）检测细胞外囊泡（EV）的方案，可同时测量多种粒径范围的粒径分布，并测定多分散样品中EV的总浓度。本研究中使用小鼠腹股沟脂肪组织和人血浆作为EV来源，但其他组织或生物液体（如血清、尿液、唾液、乳汁、羊水及细胞培养上清液）中分离得到的EV也可用于NTA检测。通过测定聚苯乙烯标准微球，确认仪器已正确校准，并证明该NTA仪器能够准确测量直径≤400 nm的纳米颗粒。随后对小鼠组织EV样品进行不同稀释倍数的检测。如图9所示，所报告的颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，符合预期，表明仪器在不同稀释条件下对颗粒浓度的检测具有较高准确性，且技术重复之间的变异较小。然而，该结果仅在颗粒浓度处于仪器工作范围（每毫升5×10⁶至2×10⁸个颗粒）内时成立；因此，适当稀释样品是本方案中的关键步骤。校正稀释倍数后，四种不同稀释度下测得的样品总颗粒浓度估算值基本一致，四次检测间的变异系数（CV）为15.1%。此外，对同一样品多次稀释后重复测量的结果显示，粒径分布评估具有良好的精确性：颗粒浓度随稀释倍数成比例变化，而报告的粒径.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1X dPBS	VWR	02-0119-1000	用于稀释样品
100 nm 乳胶微球标准品	Thermo Scientific	3100A	用于测试 ViewSizer 3000 的校准
400 nm 乳胶微球标准品	Thermo Scientific	3400A	用于测试 ViewSizer 3000 的校准
离心过滤单元	Amicon	UFC901024	用于过滤 PBS 稀释液
收集管，2 mL	Qiagen	19201	用于人血浆细胞外囊泡的分离
压缩空气除尘器	DustOff	DPSJB-12	用于清洁比色皿
比色皿插件	HORIBA Scientific	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
比色皿定位夹具	HORIBA Scientific	-	在将插件放入比色皿时用于固定磁力搅拌子；随 ViewSizer 3000 购买时提供
去离子水	VWR	02-0201-1000	用于清洁比色皿
配备显示器、键盘、鼠标及所有必要线缆的台式计算机	Dell	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
乙醇（70–100%）	Millipore Sigma	-	用于清洁比色皿
ExoQuick ULTRA	System Biosciences	EQULTRA-20A-1	用于人血浆细胞外囊泡的分离
带盖玻璃闪烁小瓶	Thermo Scientific	B780020	用于清洁比色皿
"Hook" 工具	Excelta	-	随 ViewSizer 3000 购买时提供
无尘超细纤维布	Texwipe	TX629	用于清洁比色皿及覆盖工作台面
微量离心管，2 mL	Eppendorf	22363344	用于人血浆细胞外囊泡的分离
搅拌子	Sp Scienceware	F37119-0005
带盖 Suprasil 石英比色皿	Agilent Technologies	AG1000-0544	初次购买 ViewSizer 3000 时提供
ViewSizer 3000	HORIBA Scientific	-	纳米颗粒追踪分析仪