本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。
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摘要
摘要
人类肺部发育与疾病的研究因缺乏生物学上相关的 体外 模型系统。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）可逐步分化为三维多细胞肺类器官，包含上皮和间充质细胞群体。我们通过在特定时间点依次引入多种生长因子和小分子，模拟胚胎发育信号，高效地生成定型内胚层、前部前肠内胚层，进而获得肺祖细胞。随后将这些细胞包埋于生长因子减少型（GFR）基底膜基质培养基中，使其在外界生长因子刺激下自发形成三维肺类器官。这些全肺类器官（WLO）在暴露于地塞米松、环磷酸腺苷（cAMP）和异丁基黄嘌呤后，经历早期肺发育阶段，包括分支形态发生和成熟过程。WLO包含表达KRT5（基底细胞）、SCGB3A2（club细胞）和MUC5AC（杯状细胞）的气道上皮细胞，以及表达HOPX（I型肺泡细胞）和SP-C（II型肺泡细胞）的肺泡上皮细胞。类器官中也存在间充质细胞，包括表达平滑肌肌动蛋白（SMA）和血小板源性生长因子受体A（PDGFRα）的细胞。由iPSC衍生的WLO可在三维培养条件下维持数月，并可通过表面标志物分选以纯化特定细胞群体。iPSC来源的WLO可用于研究人类肺发育过程，包括肺上皮与间充质之间的信号交互，模拟基因突变对人类肺细胞功能与发育的影响，以及评估感染性因子的细胞毒性。
引言
肺是一个复杂、异质性且动态的器官，其发育可分为六个 distinct 阶段：胚胎期、假腺泡期、毛细管期、囊泡期、肺泡期以及微血管成熟期1,2。后两个阶段在人类发育过程中跨越出生前和出生后，而前四个阶段则仅发生在胎儿发育期间，除非发生早产3。胚胎期始于内胚层生殖层，并以气管和肺芽的出芽为结束标志。肺的发育部分依赖于上皮细胞与间充质细胞之间的信号传导4。这些相互作用导致肺的分支形成、细胞增殖、细胞命运决定以及发育中肺组织的细胞分化。肺可分为传导区（从气管到终末细支气管）和呼吸区（从呼吸性细支气管到肺泡）。每个区域含有独特的上皮细胞类型：传导气道包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞、刷细胞、神经内分泌细胞和离子细胞5，而呼吸上皮则主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞组成6。目前对于各种细胞类型的发育过程及其对损伤的反应仍了解甚少。由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肺类器官模型使得研究人员能够在无需使用原代人肺组织的情况下，研究驱动人类肺发育的机制、遗传突变对肺功能的影响，以及上皮和间充质组织对病原微生物的反应。
与胚胎分化各个阶段相对应的标志物包括：定型内胚层（DE）的CXCR4、cKit、FOXA2和SOX177，前前肠内胚层（AFE）的FOXA2、TBX1和SOX28，以及早期肺祖细胞的NKX2-19。在胚胎肺发育过程中，前肠分化为背侧的食管和腹侧的气管。左右肺芽作为两个独立的突起出现在气管芽周围10。在分支形态发生过程中，上皮周围间充质产生弹性组织、平滑肌、软骨和脉管系统11。上皮与间充质之间的相互作用对正常肺发育至关重要，其中包括间充质分泌的FGF1012和上皮产生的SHH13。
在此，我们描述了一种将人诱导多能干细胞（hiPSCs）定向分化为三维（3D）全肺类器官（WLO）的实验方案。尽管已有类似方法在肺祖细胞（LPC）阶段通过分选分离肺祖细胞以生成肺泡样结构14,15 （远端）类器官或气道16 （近端）类器官，或生成腹侧-前部前肠球状体，以制备表达肺泡细胞和间充质标志物以及芽尖祖细胞类器官的人肺类器官17该方法的优势在于包含了肺上皮细胞和间充质细胞两种类型，以调控和协调肺分支形态发生、成熟及扩张过程。 体外.
本方案利用小分子化合物和生长因子，引导多能干细胞依次分化为定型内胚层、前前肠内胚层及肺祖细胞。随后，通过包括分支形成和成熟在内的关键发育步骤，将这些细胞诱导形成三维全肺类器官。分化方案的概要如图所示。 图1a 代表性明场图像显示了内胚层和类器官的分化情况 图1b. 图1c，d 展示内胚层分化过程中基因表达的详细情况，以及完成分化后肺上皮细胞近端和远端群体的基因表达。
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方案
本研究方案已获得加州大学圣地亚哥分校人类研究保护项目机构审查委员会的批准（181180）。
1. 从诱导性多能干细胞诱导 definitive endoderm（第1 - 3天）
- 使用前30分钟，将生长因子减少型（GFR）-基底膜（BM）基质胶在冰上缓慢融化。在冰冷的DMEM/F12混合液中，将GFR BM基质胶按1:1比例稀释，使其占该培养基的50%。将P1000移液器吸头放入冰箱预冷备用。
- 用500 µL预先在冰冻DMEM/F12中配制的50% GFR-基底膜基质胶包被12孔板的每个孔。包被完成后，去除孔中多余的液体混合物和/或气泡，并将培养板置于冰上或4 °C冰箱中静置20分钟使其凝固。随后，将培养板转移至37 °C培养箱中过夜，以完成凝胶化和干燥。
- 当hiPSCs达到70-90%融合度时，在消化前1小时加入10 µM Rho相关激酶（ROCK） 抑制剂Y-27632。吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。加入细胞解离培养基（每12孔板孔0.5 mL），在含5% CO2的培养箱中37 °C孵育20分钟，使hiPSCs解离。
- 从培养箱中取出培养板，向每孔12孔板中加入0.5 mL干细胞传代培养基（表1）；使用预冷的P1000吸头轻轻吹打 细胞，获得单细胞悬液。将解离后的细胞转移至15 mL锥形离心管中；在300 x g条件下离心5分钟。
- 吸除上清液，用1 mL添加了10 µM ROCK抑制剂（Y-27632）的mTeSR Plus培养基重悬细胞沉淀。进行细胞计数。将2.0 x 105 个hiPSCs加入1 mL含ROCK抑制剂Y-27632的mTeSR培养基中，接种至已包被GFR-基底膜基质胶的12孔板每孔。在37 °C培养箱中过夜培养。
注意：细胞接种数量需根据具体细胞系进行优化。铺板后24小时，孔内细胞融合度应达到50%-70%。 - 第1天，吸除mTeSR Plus培养基，加入补充有100 ng/mL人Activin A和5 µM GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR99021的定型内胚层（DE）诱导培养基（表1）。
注意：为确保分化成功，含GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR99021的DE培养基应在第1天DE诱导后20-24小时内移除。 - 第2天和第3天，更换为仅补充100 ng/mL Activin A的DE诱导培养基。
注意：DE分化总时长不应超过72小时，否则效率将下降。第4天若观察到大量细胞死亡，应将DE培养基总暴露时间减少6-12小时。 - 为分析DE分化效率，通过流式细胞术或FOXA2和/或SOX17的免疫荧光分析，确认CXCR4和/或cKit的表达率超过90%（图2a）。
2. 前肠前部内胚层（AFE）诱导（第4 - 6天）
- 第4天，更换为添加了10 µM SB431542和2 µM Dorsomorphin的无血清基础培养基（SFBM）（表1），用于前肠内胚层（AFE）诱导。连续3天每日更换AFE诱导培养基（第4天、第5天和第6天）。
- 为分析AFE诱导效率，通过免疫荧光染色确认SOX2、TBX1和FOXA2的强表达（图2b）。
3. 肺祖细胞（LPC）分化（第7 - 16天）
- 第7天，将GFR-基底膜基质培养基置于冰上解冻。吸除AFE培养基，并用1× PBS洗涤一次。每孔加入1 mL细胞解离溶液，于37 °C孵育10分钟。
- 向含有细胞解离溶液的孔中加入1 mL淬灭培养基（含2% FBS的DMEM/F12）。通过轻柔吹打使细胞保持聚集体状态。确保所有细胞均已脱离并转移至15 mL锥形离心管中，于300 × g离心5分钟。
- 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于淬灭培养基 中，并补充添加10 ng/mL人重组骨形态发生蛋白-4（BMP4）、0.1 µM全反式维甲酸（RA）、3 µM GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR99021以及10 µM Rock抑制剂Y-27632。
- 进行细胞计数。将2.5 × 105个细胞加入100 µL预冷的GFR-基底膜基质培养基中，充分混匀后将液滴加入12孔板的孔中。将培养板置于37 °C孵育30–60分钟，使培养基充分聚合。每孔加入1 mL含10 µM Rock抑制剂Y-27632的LPC培养基，确保液滴完全浸没，随后于37 °C过夜孵育。
- 第8天，即LPC诱导24小时后，更换LPC培养基以去除Rock抑制剂Y-27632。每隔一天更换一次LPC培养基，共培养9–11天。
注：若培养基在24小时内变黄，则需每天更换培养基。 - 为评估LPC诱导效率，应确认细胞内转录因子NKX2-1的强表达，或通过流式细胞术检测表面标志物CD47hi/CD26low15或CPM18（图2c）。肉眼观察下，LPC类球体应呈圆形且透明（图2c）。
注：若NKX2-1阳性细胞效率低于30%，则不应继续进行肺类器官分化。
4. 3D 肺类器官诱导（第 16 - 22 天）
- 第17天，将GFR-基底膜基质培养基置于冰上解冻。吸除LPC诱导培养基，然后加入2 µg/mL的dispase（1 mL）加入孔中，使用 P1000 移液器重悬培养基/中性蛋白酶混合液。置于 37 °C孵育15分钟。再次吹打混匀，并继续在37 °C孵育 37 °C 下继续孵育 15 分钟。
- 将dispase和细胞转移至15 mL圆锥形离心管中。用预冷的PBS（2–3 mL）洗涤孔板并重悬dispase/细胞混合物。在400 × g下离心5分钟。 g手动移除上清液，注意不要扰动培养基/细胞沉淀层。重复冰冷 PBS 洗涤，并 将锥形离心管再次以400 x g离心5分钟 g.
- 手动去除上清液，然后向锥形离心管中加入 2 mL 基于胰蛋白酶的解离溶液。在 37 °C 下孵育 12 分钟。
- 孵育后，用 P1000 移液器枪头重悬细胞。然后向锥形离心管中加入等体积的淬灭培养基，并在 400 x g 5 分钟。吸除上清液，重悬细胞 在淬灭培养基中加入10 µM ROCK抑制剂Y-27632。
注意：肺类器官诱导成功的关键在于将细胞以细胞团形式包埋，而非单细胞形式，因此请相应调整移液操作。 - 进行细胞计数。计算获得 5.0–8.0 × 10⁶ 个细胞所需的体积。4 每孔细胞。将LPC细胞聚集体分装至1.5 mL微量离心管中，在400 x g条件下离心5分钟 g. 去除上清液，注意不要扰动细胞沉淀，仅保留10 µL残留培养基。
- 将细胞沉淀重悬于200 µL冷的GFR-基底膜基质培养基中，加入细胞培养膜插件（6.5 mm直径，0.4 µm孔径，聚酯膜）。将培养板在37 °C孵育30–60分钟，使GFR-基底膜基质培养基聚合。
- 加入1 mL 3D类器官诱导培养基（表1）补充有 成纤维细胞生长因子-7 (FGF7) (10 ng/mL)、FGF10 (10 ng/mL)、GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR (3 µM)、表皮生长因子（EGF）(10 ng/mL)以及10 µM ROCK抑制剂 向膜插件的基底外侧室加入抑制剂 Y-27632。每隔一天更换培养基，持续 6 天。
5. 肺类器官三维分支（第23 - 28天）
- 在第23天更换为3D分支培养基（表1），并添加FGF7（10 ng/mL）、FGF10（10 ng/mL）、GSK3β抑制剂/Wnt激活剂CHIR99021（3 µM）、RA（0.1 µM）、EGF（10 ng/mL）以及血管内皮生长因子（VEGF）/胎盘生长因子（PlGF） （10 ng/mL）。每两天更换一次培养基，持续6天。
注意：在3D分支分化第6天时，应观察到多个分支状类器官（图2）。
6. 肺类器官三维成熟（第29 - 34天）
- 第29天，更换为3D成熟培养基（表1），该培养基与3D分支培养基相同，但需添加地塞米松（50 nM）、cAMP（100 µM）以及磷酸二酯酶抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX，又称异丁基黄嘌呤 ，100 µM）。每隔一天更换一次培养基，持续6天。
注意：在转入3D成熟培养后的24小时内，分支类器官应开始扩张并转变为透明球状结构。
7. 肺类器官三维免疫细胞化学染色
- 对于三维全肺类器官分析，使用4%多聚甲醛（PFA）在4 °C条件下固定膜插件中的GFR-基底膜基质介质1小时。按照已发表的标准方案进行石蜡包埋并切片贴附于载玻片上。
- 染色前进行抗原修复。气道标志物包括KRT5、MUC5AC和SCGB3A2。肺泡标志物包括SP-C、SP-B、HTII-280、HTI-56和HOPX（图3）。
8. 将完整肺类器官从GFR-基底膜基质培养基中取出用于传代、流式细胞术分析或冷冻保存
- 为了将类器官从GFR-基底膜基质培养基中解离，移除基底室中的培养基，并在顶腔中加入2 µg/mL的分散酶（1 mL）。
- 使用P1000移液器轻轻吹打培养基/分散酶混合液，然后放入培养箱中孵育15分钟。再次轻轻吹打混合液，并继续孵育15分钟。
- 加入1 mL预冷的PBS（4 °C），将含有基质培养基的类器官转移至15 mL锥形离心管中。在400 × g下离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动细胞沉淀。
- 用1 mL预冷PBS再洗涤一次，在400 × g下离心5分钟。小心移除上清液，避免扰动基质/细胞混合物。
- 向锥形离心管中加入1 mL细胞解离溶液，轻轻吹打重悬GFR-基底膜基质培养基/细胞混合物。若需以细胞聚集体形式传代或冻存，则放入培养箱中孵育12分钟；若需制备单细胞悬液，则孵育20分钟。
- 加入等体积的终止培养基，在400 × g下离心5分钟。用含10 µM ROCK抑制剂Y-27632的终止培养基重悬细胞。
注意：此步骤时，离心管中不应观察到残留的基底膜培养基。若仍有残留，请重复步骤8.5和8.6。 - 进行细胞计数，并计算下游应用所需的细胞悬液体积。
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结果
接种后24小时，即第1天，诱导多能干细胞应达到50%–90%汇合度。第2天，定型内胚层细胞应达到90%–95%汇合度。在定型内胚层诱导过程中，第4天常可观察到明显的细胞死亡，但贴壁细胞仍保持紧密的鹅卵石样形态。图2b）。如果大部分贴壁细胞脱落，则应终止分化，并考虑将细胞在含激活素A的DE培养基中的孵育时间缩短6-12小时。在前肠内胚层（AFE）诱导过程中，细胞死亡极少，细胞保持贴壁状态，但形态上会显得更小且异质性增加。只有当SOX2和FOXA2双阳性细胞得率较低时，才应在第7天进行传代。 >80%。在传代至基底膜基质进行三维LPC诱导后，将首先出现小型球状体，随后逐渐生长，部分开始分支。成功的内胚层分化基因表达谱包括：定型内胚层（DE）阶段SOX17表达升高；随后SOX17表达下降，FOXA2和SOX2表达升高，并首次出现NKX2-1；进一步发育阶段NKX2-1表达持续升高，同时维持SOX2和FOXA2的表达。与早期胚胎发育一致，前肠前体（AFE）的腹侧化促进肺芽发育（NKX2-1+），而背侧化则促进胃肠道发育（SOX2+）。在LPC阶段的培养物中将同时包含肺和胃的前体细...
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讨论
3D 全肺类器官（WLO）的成功分化依赖于一个多步骤、为期 6 周的精细操作流程，需特别注意生长因子和小分子的作用时间、传代后的细胞密度以及 hiPSCs 的质量。如需故障排除，请参见表 2。hiPSCs 在消化前应达到约 70%–80% 的融合度，且自发分化比例应低于 5%。本方案推荐使用"mTeSR plus" 培养基；然而， 普通 "mTeSR" 培养基 也已被用于获得相似结果，且成本更低。对于细胞外基质，我们使用 GFR 基底膜基质。我们采用 ReLesR（见材料表）对 hiPSCs 进行传代，以减少细胞自发分化。
在内胚层分化过程中，应在每次换液前后每天观察细胞。指定的生长因子/小分子应每天新鲜添加至基础培养基中，以防止过早降解。定型内胚层（DE）中出现细胞死亡是常见现象，但在前部前肠内胚层（AFE）和肺祖细胞（LPC）诱导阶段应尽量减少细胞死亡。如果在定型内胚层分化的第3天（即第4天）出现大量细胞死亡，可将定型内胚层阶段的总时间缩短6–12小...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加州再生医学研究所（CIRM）资助（项目编号：DISC2-COVID19-12022）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| 12孔板 | 康宁 | 3512 | |
| 12孔插件，0.4 μm，半透明 | VWR | 10769-208 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | 创新细胞技术 | AT104 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| 不含视黄酸的B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）第五组分，7.5% 溶液 | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 哈姆’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 艾斯科沃’s 改良杜氏磷酸盐缓冲液’s 介质（IMDM）+ Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout血清替代物（KSR） | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | 康宁 | 354230 | |
| 巯基甘油 | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus 试剂盒（10/箱） | 干细胞技术 | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | 干细胞技术 | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632（Rock抑制剂） | R&D 系统 | 1254/1 | |
| 生长因子/小分子 | |||
| Activin A | R&D 系统 | 338-AC | |
| 全反式维甲酸（RA） | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D 系统 | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D 系统 | 3093 | |
| EGF | R&D 系统 | 236-EG | |
| FGF10 | R&D 系统 | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D 系统 | 251-KG/CF | |
| IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D 系统 | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D 系统 | 297-VP/CF | |
| 一抗 | 稀释率 | ||
| CXCR4-PE | R&D 系统 | FAB170P | 1:200（F） |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000（F） |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D 系统 | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB（成熟） | 七座山 | 48604 | 1:1500（F）1:500（W）a |
| SPC（成熟） | LS Bio | LS-B9161 | 1:100（F）；1:500（W） a |
参考文献
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