本文描述了将诱导多能干细胞逐步定向分化为包含近端和远端肺上皮细胞以及间充质的三维全肺类器官的方法。
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摘要
摘要
人类肺部发育与疾病的研究因缺乏生物学上相关的 体外 模型系统。人诱导性多能干细胞（hiPSCs）可逐步分化为三维多细胞肺类器官，包含上皮和间充质细胞群体。我们通过在特定时间点依次引入多种生长因子和小分子，模拟胚胎发育信号，高效地生成定型内胚层、前部前肠内胚层，进而获得肺祖细胞。随后将这些细胞包埋于生长因子减少型（GFR）基底膜基质培养基中，使其在外界生长因子刺激下自发形成三维肺类器官。这些全肺类器官（WLO）在暴露于地塞米松、环磷酸腺苷（cAMP）和异丁基黄嘌呤后，经历早期肺发育阶段，包括分支形态发生和成熟过程。WLO包含表达KRT5（基底细胞）、SCGB3A2（club细胞）和MUC5AC（杯状细胞）的气道上皮细胞，以及表达HOPX（I型肺泡细胞）和SP-C（II型肺泡细胞）的肺泡上皮细胞。类器官中也存在间充质细胞，包括表达平滑肌肌动蛋白（SMA）和血小板源性生长因子受体A（PDGFRα）的细胞。由iPSC衍生的WLO可在三维培养条件下维持数月，并可通过表面标志物分选以纯化特定细胞群体。iPSC来源的WLO可用于研究人类肺发育过程，包括肺上皮与间充质之间的信号交互，模拟基因突变对人类肺细胞功能与发育的影响，以及评估感染性因子的细胞毒性。
引言
肺是一个复杂、异质性且动态的器官，其发育可分为六个 distinct 阶段：胚胎期、假腺泡期、毛细管期、囊泡期、肺泡期以及微血管成熟期1,2。后两个阶段在人类发育过程中跨越出生前和出生后，而前四个阶段则仅发生在胎儿发育期间，除非发生早产3。胚胎期始于内胚层生殖层，并以气管和肺芽的出芽为结束标志。肺的发育部分依赖于上皮细胞与间充质细胞之间的信号传导4。这些相互作用导致肺的分支形成、细胞增殖、细胞命运决定以及发育中肺组织的细胞分化。肺可分为传导区（从气管到终末细支气管）和呼吸区（从呼吸性细支气管到肺泡）。每个区域含有独特的上皮细胞类型：传导气道包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞、刷细胞、神经内分泌细胞和离子细胞5，而呼吸上皮则主要由Ⅰ型和Ⅱ型肺泡细胞组成6。目前对于各种细胞类型的发育过程及其对损伤的反应仍了解甚少。由诱导多能干细胞（iPSC）衍生的肺类器官模型使得研究人员能够在无需使用原代人肺组织的情况下，研究驱动人类肺发育的机制、遗传突变对肺功能的影响，以及上皮和间充质组织对病原微生物的反应。
与胚胎分化各个阶段相对应的标志物包括：定型内胚层（DE）的CXCR4、cKit、F....
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方案
本研究方案已获得加州大学圣地亚哥分校人类研究保护项目机构审查委员会的批准（181180）。
1. 从诱导性多能干细胞诱导 definitive endoderm（第1 - 3天）
- 使用前30分钟，将生长因子减少型（GFR）-基底膜（BM）基质胶在冰上缓慢融化。在冰冷的DMEM/F12混合液中，将GFR BM基质胶按1:1比例稀释，使其占该培养基的50%。将P1000移液器吸头放入冰箱预冷备用。
- 用500 µL预先在冰冻DMEM/F12中配制的50% GFR-基底膜基质胶包被12孔板的每个孔。包被完成后，去除孔中多余的液体混合物和/或气泡，并将培养板置于冰上或4 °C冰箱中静置20分钟使其凝固。随后，将培养板转移至37 °C培养箱中过夜，以完成凝胶化和干燥。
- 当hiPSCs达到70-90%融合度时，在消化前1小时加入10 µM Rho相关激酶（ROCK） 抑制剂Y-27632。吸除培养基，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤一次。加入细胞解离培养基（每12孔板孔0.5 mL），在含5% CO2的培养箱中37 °C孵育20分钟，使hiPSCs解离。
- 从培养箱中取出培养板，向每孔12孔板中加入0.5 mL干细胞传代培养基（表1）；使用预冷的P1000吸头轻轻吹打 细胞，获得单细胞悬液。将解离后的细胞转移至15 mL锥形离心管中；在3....
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结果
接种后24小时，即第1天，诱导多能干细胞应达到50%–90%汇合度。第2天，定型内胚层细胞应达到90%–95%汇合度。在定型内胚层诱导过程中，第4天常可观察到明显的细胞死亡，但贴壁细胞仍保持紧密的鹅卵石样形态。图2b）。如果大部分贴壁细胞脱落，则应终止分化，并考虑将细胞在含激活素A的DE培养基中的孵育时间缩短6-12小时。在前肠内胚层（AFE）诱导过程中，细胞死亡极少，细胞保持贴壁状态，但形态上会显得更小且异质性增加。只有当SOX2和FOXA2双阳性细胞得率较低时，才应在第7天进行传代。 >80%。在传代至基底膜基质进行三维LPC诱导后，将首先出现小型球状体，随后逐渐生长，部分开始分支。成功的内胚层分化基因表达谱包括：定型内胚层（DE）阶段SOX17表达升高；随后SOX17表达下降，FOXA2和SOX2表达升高，并首次出现NKX2-1；进一步发育阶段NKX2-1表达持续升高，同时维持SOX2和FOXA2的表达。与早期胚胎发育一致，前肠前体（AFE）的腹侧化促进肺芽发育（NKX2-1+），而背侧化则促进胃肠道发育（SOX2+）。在LPC阶段的培养物中将同时包含肺和胃的前体细.......
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讨论
3D 全肺类器官（WLO）的成功分化依赖于一个多步骤、为期 6 周的精细操作流程，需特别注意生长因子和小分子的作用时间、传代后的细胞密度以及 hiPSCs 的质量。如需故障排除，请参见表 2。hiPSCs 在消化前应达到约 70%–80% 的融合度，且自发分化比例应低于 5%。本方案推荐使用"mTeSR plus" 培养基；然而， 普通 "mTeSR" 培养基 也已被用于获得相似结果，且成本更低。对于细胞外基质，我们使用 GFR 基底膜基质。我们采用 ReLesR（见材料表）对 hiPSCs 进行传代，以减少细胞自发分化。
在内胚层分化过程中，应在每次换液前后每天观察细胞。指定的生长因子/小分子应每天新鲜添加至基础培养基中，以防止过早降解。定型内胚层（DE）中出现细胞死亡是常见现象，但在前部前肠内胚层（AFE）和肺祖细胞（LPC）诱导阶段应尽量减少细胞死亡。如果在定型内胚层分化的第3天（即第4天）出现大量细胞死亡，可将定型内胚层阶段的总时间缩短6–12小.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由加州再生医学研究所（CIRM）资助（项目编号：DISC2-COVID19-12022）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | |||
| 12孔板 | 康宁 | 3512 | |
| 12孔插件，0.4 μm，半透明 | VWR | 10769-208 | |
| 2-巯基乙醇 | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | 创新细胞技术 | AT104 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A4544 | |
| 不含视黄酸的B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| 牛血清白蛋白（BSA）第五组分，7.5% 溶液 | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| 哈姆’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| 艾斯科沃’s 改良杜氏磷酸盐缓冲液’s 介质（IMDM）+ Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout血清替代物（KSR） | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | 康宁 | 354230 | |
| 巯基甘油 | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus 试剂盒（10/箱） | 干细胞技术 | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 青霉素/链霉素 | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | 干细胞技术 | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632（Rock抑制剂） | R&D 系统 | 1254/1 | |
| 生长因子/小分子 | |||
| Activin A | R&D 系统 | 338-AC | |
| 全反式维甲酸（RA） | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D 系统 | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D 系统 | 3093 | |
| EGF | R&D 系统 | 236-EG | |
| FGF10 | R&D 系统 | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D 系统 | 251-KG/CF | |
| IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D 系统 | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D 系统 | 297-VP/CF | |
| 一抗 | 稀释率 | ||
| CXCR4-PE | R&D 系统 | FAB170P | 1:200（F） |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000（F） |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D 系统 | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB（成熟） | 七座山 | 48604 | 1:1500（F）1:500（W）a |
| SPC（成熟） | LS Bio | LS-B9161 | 1:100（F）；1:500（W） a |
参考文献
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M.
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