利用Ussing腔室技术对原生组织中肠紧密连接屏障功能及离子通透性的功能评估

摘要

肠上皮不仅具有营养吸收功能，还能防止有害物质侵入。位于上皮细胞间连接最顶端的紧密连接可调节溶质和离子的细胞旁通透性。本文介绍了一种制备黏膜片并利用尤斯 chamber 技术评估紧密连接离子选择性的实验方案。

摘要

Ussing chamber 技术最初由丹麦科学家 Hans Ussing 于 1951 年发明，用于研究钠离子通过蛙皮肤的跨细胞转运。此后，该技术已被应用于多种不同组织，以研究跨膜转运的生理参数。与其他方法相比，Ussing chamber 方法更具优势，因其可使用天然组织，因而更接近体内（in vivo）的实际状况。然而，由于使用的是天然组织，通量较低，实验时间有限，且组织制备需要熟练的技术和培训。该技术已被用于研究各种组织中的特定转运蛋白，阐明囊性纤维化等疾病的病理生理机制，研究药物的转运与吸收，尤其促进了对肠道营养物质转运的理解。鉴于组织的整体上皮转运过程，不仅跨上皮途径重要，旁细胞途径也同样重要。紧密连接是决定肠道组织特异性旁细胞通透性的关键因素。本文将采用 Ussing chamber 技术，通过测量跨上皮电导和稀释电位，评估离子的旁细胞选择性通透性。

引言

Ussing室法最初由丹麦科学家Hans Ussing开发。Ussing首次利用该方法测量钠离子通过蛙皮肤的短路电流，此前已观察到NaCl能够逆浓度梯度跨皮肤转运¹。他的系统将蛙皮肤固定在两个腔室之间，使皮肤两侧均可接触溶液。每个腔室中含有循环并通气的任氏液（Ringer's solution）。靠近皮肤处设有两根细小的琼脂任氏液桥，连接至饱和KCl-甘汞电极，用于通过电位计测量电位差。另外一对琼脂任氏液桥位于每个腔室的另一端，连接至含有被AgCl饱和的饱和KCl溶液的烧杯，以接入由电池提供的电动势。通过使用电位分压器调节电压，使跨皮肤的电位差保持为零，从而实现短路条件。同时连接微安表以读取通过皮肤的电流（原始腔室设计参见参考文献¹中的图示）。

在过去的70年中，该技术已被应用于多种不同的组织，尤其是肠道组织，用于研究营养物质和离子的转运。例如，通过将兔回肠组织置于此类 chamber 中，研究了霍乱引起腹泻的机制，发现霍乱毒素诱导的腹泻是由cAMP²介导的。此外，这些chamber还被用于研究通过Na⁺-葡萄糖共转运蛋白1（SGLT1）进行葡萄糖转运的机制³。我们实验室专注于肠道上皮细胞的跨细胞和旁细胞转运。利用Ussing chamber方法，在旁细胞钠离子转运....

方案

本实验所使用的所有动物均饲养于静冈大学的动物饲养设施中，实验操作均遵循静冈大学规定的动物研究指南。所有实验均获得静冈大学动物护理与使用委员会的批准（许可证号 #205272 和 #656-2303）。

1. NaCl 电极的制备

注意：本实验所用的电极含有浓 NaCl 或 KCl。KCl/甘汞电极为商业购买。实验开始前，需确保所有电极均用浓 NaCl 或 KCl 溶液填充至顶端。

1. 准备带有塑料盖的小玻璃瓶（体积为 20 mL）。
2. 在塑料盖上钻两个孔，一个用于 NaCl 盐桥（直径 2.5 mm），另一个用于银丝（直径 1 mm；图 1C，NaCl 电极）。
3. 将玻璃瓶中装满饱和 NaCl 溶液（约 15 mL，直至装满）。
4. 将银丝（直径 0.8 mm，长 7 cm）插入瓶中，但需确保瓶外的银丝部分可通过小号鳄鱼夹与放大系统连接。
5. 不使用时，用封口膜包裹电极并覆盖孔洞，防止干燥。

2. 盐桥的制备

注意：盐桥需至少在实验前一天制备，以确保有充足的时间凝固。盐桥可重复使用，但不建议使用超过2个月后的盐桥。

1. NaCl 盐....

结果

本文所示结果属于一个已完成的较大项目的一部分（见参考文献^4,23,24）。

在Cldn15^-/-小鼠中，小肠的跨上皮电导降低。
在短路条件下，Cldn15^-/-小鼠中段小肠的基础黏膜跨层电导低于野生型小鼠（图3A；Cldn15^-/-小鼠和野生型小鼠分别为22.3 mS/cm²和48.7 mS/cm²）。同时测定了Cldn15^-/-小鼠的基础短路电流（I_sc）.......

讨论

在本实验中，使用尤斯室（Ussing chamber）测量了Cldn15^-/-小鼠和野生型（WT）小鼠小肠的基线电生理参数以及NaCl稀释电位。进行尤斯室实验时，验证实验所用组织膜制备物是否具有活性至关重要。通常通过添加葡萄糖或腺苷酸环化酶激活剂佛司可林（forskolin），观察短路电流（I_sc）是否出现适当升高（在小鼠中为100–300 µA/cm²）来判断组织活性。另一种评估肠道组织制备物是否适用于实验的方法是检测组织的电导率。受损组织的电导率通常高于正常值（小鼠正常电导率约为20–60 mS/cm²），而肌层未充分剥离的组织则往往表现出低于正常的电导率（图2）。所有尤斯室实验方案中最关键的步骤是组织制备，必须确保组织无任何损伤。此外，对于小肠组织，理想情况下应在解剖后10分钟内将膜制备物安装至尤斯室中，以避免组织降解。组织安装完成后，不应尝试重新调整，以免造成损伤。实验过程中，在从尤斯室中移除缓冲液、调节盐桥或搅拌棒时，必须避免以任何方式触碰肠道组.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#3 聚乙烯管	Hibiki		外径 1.0 mm；内径 0.5 mm
#7 聚乙烯管	Hibiki		外径 2.3 mm；内径 1.3 mm
10 mL 带锁注射器	Terumo	SS-10LZ	使用锁定式注射器可防止填充过程中针头脱落
19 号针头	Terumo	NN-1938R	操作针头时请小心谨慎，并将其丢弃至锐器容器中
23号针头	Terumo	NN-2332R	操作针头时请小心谨慎，并将其丢弃至锐器容器中
5 mm 打孔器	NA	NA	用于在滤纸和封口膜上打孔
针灸针	Seirin	NS	用作解剖针，将组织固定在解剖板上
琼脂	Fujifilm Wako	010-15815
鳄鱼夹	NA	NA	将电极连接至放大器
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-甘露醇	Fujifilm Wako	133-00845	用于校正稀释用 HEPES 缓冲液中的渗透压差异
D(+)-葡萄糖	Fujifilm Wako	049-31165
解剖工具包			您将需要：剪刀和弯头镊子
解剖板			我们使用了10 cm的细胞培养板，并用硅橡胶覆盖
DMSO	Sigma	472301-500ML	用于配制佛司可林储备液
电生理记录仪	TOA Electronics	PRR-5041	市面上可购得其他等效的电生理记录仪
上皮电压钳放大器	Nihon Kohden	CEZ9100	其他等效的放大器可商业获得
滤纸，切成方形	NA	NA	使用5 mm打孔器打孔，用于固定肠道标本
精细镊子	快速基因	FG-B50476	用于肌肉层的钝性分离
Forskolin	Alomone Labs	F-500	用DMSO配制10 mM储备液，终浓度为10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
吲哚美辛	Sigma	I7338-5G	在21 mM NaHCO₃中配制1 mM储存液，终浓度为10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/甘汞电极	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	关东化学	32379-00
L(+)-谷氨酰胺	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
混合气体（95% O₂，5% CO₂）2/5% CO₂2)	静冈氧气公司		用于使用林格溶液时对林格溶液和腔室进行通气
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl电极	NA	NA	需要浓 NaCl 溶液和银丝的手工电极
NaHCO₃3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 气体	静冈氧气公司		用于使用 HEPES 缓冲液时的鼓泡室
帕拉菲膜	贝米斯	PM-996	用于帮助密封尤西 chamber
pH计	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES 缓冲液需在 37 ℃ 下调节至 pH 7.4 °C
pH计电极	DKK-TOA Corp	GST-5311C
硅橡胶	Shinetsu Chemical	KE-12	用于填充解剖板
银丝			用于制备 NaCl 电极
带塑料盖的小罐子	NA	NA	用于 NaCl 电极
体视显微镜	Zeiss	Stemi 305	体视显微镜可提供立体视觉，使您能够更轻松地解剖组织
Tris（Trizma 试剂）	Sigma	T1503-1KG	配制1M溶液以调节HEPES缓冲液的pH值
尤斯灌流室	先进化学工业		这些灌流室为定制的连续灌流式尤辛室，窗口直径为5 mm
水泵和加热系统	东京理化工业株式会社	NTT-110