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格勒诺布尔 EMBL HTX 设施中的自动化晶体学流程

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DOI：

10.3791/62491

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2021年6月5日

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1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

本文内容

摘要

本文介绍了如何在欧洲分子生物学实验室格勒诺布尔分站（EMBL Grenoble）的HTX实验室中，利用基于CrystalDirect技术的自动化大分子晶体学流程，实现从蛋白质到结构的解析、快速配体-蛋白质复合物分析以及大规模片段筛选。

摘要

欧洲分子生物学实验室格勒诺布尔分部（EMBL Grenoble）运营着高通量结晶实验室（HTX Lab），这是一个大规模的用户设施，为全球用户提供高通量晶体学服务。HTX实验室致力于大分子晶体学中新方法的开发。通过结合高通量结晶平台、用于全自动晶体挑取与冷冻的CrystalDirect技术以及我们开发的CRIMS软件，我们已建立了可经互联网远程操作的大分子晶体学全自动分析流程。这些流程包括用于解析新结构的“蛋白质到结构”流程、支持药物化学研究的蛋白质-配体复合物快速表征流程，以及可对超过1000个片段组成的文库进行评估的大规模自动化片段筛选流程。本文将介绍如何访问并使用这些资源。

引言

从结晶到衍射数据的收集与处理，大分子晶体学实验流程的各个步骤均已引入自动化技术1,2,3,4,5,6,7,8,9，其中包括多种样品装载技术10,11,12,13,14,15,16,17。这不仅加快了晶体结构解析的速度，也促进了诸如结构导向药物设计等应用的发展18,19,20,21,22,23,24。本文将介绍位于格勒诺布尔的HTX实验室中可用的自动化晶体学流程的若干方面及其底层技术。

位于格勒诺布尔的欧洲分子生物学实验室（EMBL）高通量晶体学（HTX）实验室是欧洲最大的学术性结晶筛选设施之一。该实验室坐落于欧洲光子与中子（EPN）园区，与欧洲同步辐射装置（ESRF）和劳厄-朗之万研究所（ILL）毗邻，其中ESRF可产生世界上最明亮的X射线束，而ILL则提供高通量中子束。自2003年投入运行以来，HTX实验室已为800多位科学家提供服务，每年处理超过1000个样品。HTX实验室致力于大分子晶体学新方法的开发，包括样品评估与质量控制方法25,26 ，以及CrystalDirect技术，实现晶体的全自动挑取与处理15,16,17。HTX实验室还开发了晶体学信息管理系统（CRIMS），这是一种基于网络的实验室信息管理系统，可在结晶实验与同步辐射数据采集设施之间实现自动化通信，从而在整个样品流程中——从纯化蛋白到衍射数据——实现信息的无缝流转。通过整合HTX设施的能力、CrystalDirect技术以及CRIMS软件，我们已建立起从蛋白到结构解析的全自动分析流程，将结晶筛选、晶体优化、全自动晶体挑取与处理、低温冷冻以及在多个同步辐射光源上的X射线数据采集整合为单一、连续的工作流程，并可通过网页浏览器进行远程操作。该流程可用于支持新结构的快速解析、蛋白-配体复合物的表征，以及通过X射线晶体学开展的大规模化合物与片段筛选。

HTX 实验室配备了一台非体积结晶机器人（包含一个LCP模块，可用于可溶性蛋白和膜蛋白的结晶）、晶体培养箱（分别设置在5 °C和20 °C）、两台用于制备结晶筛选实验的自动化液体处理工作站，以及两台自动化的CrystalDirect晶体 harvesting 装置，每轮操作周期可制备并储存多达400个冷冻样品针。科研人员通过快递将样品寄送至该设施，随后由HTX实验室的专职技术人员进行处理。科研人员可通过CRIMS系统提供的网络界面远程设计结晶筛选和优化实验。通过该界面，他们可根据自身样品的具体需求，从设施提供的广泛参数和实验方案中进行选择。所有实验结果及完整的实验参数将通过CRIMS系统实时向用户开放。所有收到的样品均会采用一种专门开发的方法进行检测，以评估其结晶可能性25,26,27。根据该检测结果，系统将向用户提出关于最佳孵育温度以及可能的样品优化实验的具体建议。一旦结晶实验设置完成，科研人员即可通过网络查看在不同时间点采集的结晶图像，以评估实验结果。当发现适合X射线衍射实验的晶体时，科研人员可使用专用界面制定晶体挑取方案，随后由CrystalDirect机器人自动执行该操作。

CrystalDirect 技术基于使用改良的蒸气扩散结晶微孔板和激光束，将晶体样品安装并冷冻冷却至可进行衍射数据收集的支撑装置中，从而填补了结晶与数据采集之间存在的自动化空白15,16,17。简而言之，晶体在一种改良的蒸气扩散板——即 CrystalDirect 微孔板中生长。一旦晶体形成，CrystalDirect 收获机器人会自动发射激光束，切割出含有晶体的薄膜片，将其附着到标准的衍射数据收集针上，并在氮气流中进行冷冻冷却（参见 Zander et al. 2016 及 https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8 ）。该技术相较于手动或半自动晶体安装方法具有多项优势。例如，晶体的尺寸和形状不再成为限制因素，因此无论是大尺寸晶体还是微晶都可同样方便地收获；由于该技术独特的操作方式（参见文献17，Zander 等），通常可避免使用冷冻保护剂，从而使X射线衍射分析更加直接简便。此外，激光束还可作为手术工具，在晶体成簇生长或出现外延生长等情况下，用于选择样品中最适合的晶体区域。CrystalDirect 技术还可用于自动化浸泡实验17，即将小分子或其他化学物质溶液递送至晶体，从而支持完全自动化的大规模化合物和片段筛选。一旦晶体被 CrystalDirect 机器人收获并冷冻冷却后，即可转移至 SPINE 或 Unipuck 样品托中，这些样品托与全球大多数同步辐射大分子晶体学光束线兼容。该系统能够以完全自主的方式收获多达 400 根样品针（相当于低温储存杜瓦瓶的容量）。CRIMS 系统在整个过程中与收获机器人通信，实现对晶体样品（样品托和样品针）的自动化追踪管理。样品托同时标记有条形码和 RFID 标签，以方便样品管理21,28。

CRIMS 提供一个应用程序编程接口（API），支持与 ISPyB 系统的自动化通信，该系统在欧洲及全球多个同步辐射装置中用于支持X射线数据采集的管理与处理29。在自动完成晶体收获后，科研人员可选择晶体样品（载样环）并为位于欧洲同步辐射装置（ESRF，法国格勒诺布尔）7,8,9 或 Petra III 同步辐射装置（德国汉堡）18,19 的大分子晶体学光束线创建样品运输任务。CRIMS 将所选光束线样品的相关数据连同预设的数据采集参数一并传输至同步辐射信息管理系统。当样品抵达所选的同步辐射光束线后，X射线数据采集可通过手动操作、远程光束线操作或完全自动化的方式进行（例如由欧洲分子生物学实验室与欧洲同步辐射装置联合结构生物学组（JSBG）运行的 ESRF 的 MASSIF-1 光束线8）。数据采集完成后，CRIMS 会自动获取同步辐射数据处理系统生成的采集结果及初步数据处理结果，并通过便捷的用户界面呈现给科研人员。

HTX 实验室应用这些自动化流程来支持三种不同的应用：快速测定新结构、快速表征蛋白质-配体复合物以及大规模化合物和片段筛选。以下将介绍如何使用和操作这些流程。

方案

注意：全球科学家获得这些技术平台的资助使用权限，由一系列资助项目支持。在撰写本文时，申请使用权限可通过 iNEXT Discovery 项目（https://inext-discovery.eu）或 INSTRUCT-Eric（https://instruct-eric.eu/）提交。iNEXT Discovery 是由欧盟委员会“地平线2020”计划资助的欧洲设施网络，旨在促进转化结构生物学研究20 。有关特定时期获得资助使用权限的具体方式和途径，请联系通讯作者。本方案描述了从蛋白质到结构解析的技术流程，涵盖了所有技术平台共有的操作步骤，其余两个平台的特定细节将在下文讨论。本说明中的操作指南适用于 CRIMS V4.0 版本。 

1. 高通量结晶实验室

  1. 开始之前，请通过 CRIMS 系统 https://htxlab.embl.fr/#/ 向 HTX 实验室申请注册。用户凭据可提供对所有实验设计和评估界面的远程访问权限。 
    1. 通过网络浏览器（支持 Firefox、Chrome 和 Safari）登录 CRIMS。CRIMS 网络服务器经过加密，以防止第三方在数据通过网络传输时访问数据。进入 CRIMS 后，屏幕左侧的一系列菜单可帮助管理并创建样本、申请结晶实验、管理及可视化培养板等。视频教程系列可访问 https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d 获取。
      注意：通过快递寄送样品的用户需在寄送前通过 CRIMS 系统注册样品及所需的结晶实验，以确保样品到达后可及时处理。请将货运详细信息发送至 htx@embl.fr。
  2. 使用网络浏览器登录 CRIMS（https://htxlab.embl.fr），然后点击 样本菜单这将打开一个包含项目和样本管理工具的界面。
  3. 点击 新样本 按钮并提供所需信息。CRIMS 可用于在不同项目、靶标和构建体下对样本进行组织。可将样本分配至现有类别，或在此时创建新的类别。
  4. 输入所需信息后，点击 保存 & 提交申请选择结晶方案、所用的结晶筛选试剂盒、孵育温度以及实验的预期日期。
    1. 在注释栏中提供对HTX实验室操作人员至关重要的样品相关信息。也可选择自定义筛选条件（见下文）。提交结晶实验申请后，将由HTX实验室团队进行审核，并通过电子邮件发送实验排期的确认通知。请确保所选实验日期与样品运输所需时间相兼容。
  5. 一旦样品抵达实验室，HTX 实验室的操作人员将按照要求开展实验。结晶实验设置完成后，将通过电子邮件发送确认信息，并将结晶板转移至自动成像仪。CRIMS 系统可访问所有实验参数，并会自动追踪新的成像过程。当有新图像可用时，系统将自动发送电子邮件通知。基于 Thermofluor 的30 基于本机构开发的方案进行的样本质量评估实验25,26 此时对每个样本均进行此操作，并将通过CRIMS提供。
  6. 结晶实验的图像以及样品质量评估结果将在结晶板设置完成后不久即可在CRIMS中查看。点击 热荧光法 菜单并导航至样本，查看样本质量评估实验的结果。
    1. 点击 培养皿 菜单以查看结晶板中的图像。导航至样品，然后单击 查看 查看上一次成像会话或在 + （展开）符号以选择不同的成像会话。一系列工具可帮助用户轻松查找和浏览样本。例如，点击屏幕顶部的项目框可筛选出属于该项目的样本，大多数表格列中均提供搜索功能。
  7. 使用该培养板 查看 用于帮助评估和评分结晶实验结果的界面。该界面可实现对结晶板中不同孔位的浏览，选择图像类型（如可见光、紫外光）、选择图像分辨率或记录评分等操作。该界面还提供结晶实验所用的全部实验参数，包括结晶溶液的组成。
  8. 点击 优化 根据初步筛选确定的主要命中条件，设计晶体优化筛选方案的菜单。 化学品 和 储备液 子菜单允许注册和管理结晶储备溶液。 筛选 子菜单提供一个界面，用于设计您自己的优化实验或自定义筛选方案。
    1. 选择最适合实验设计的板型、储备溶液或梯度配置。可要求 CRIMS 输出与 Formulator 机器人（Formulatrix）直接兼容的文件，以自动将筛选溶液移液至微孔板中；也可输出包含加样体积的可打印文档，用于手动操作。
  9. 重复步骤 1.2 至 1.8，进行晶体优化实验。
  10. 一旦鉴定出适合进行X射线衍射实验的晶体，即转向该培养板 查看 界面并选择对应右侧结晶液滴的图像。预先存储的评分将帮助您轻松完成此操作。
    1. 单击以下任意一项 晶体收获 用于记录CrystalDirect晶体采集机器人或其上的自动晶体采集方案 人工收获 对于传统的手动晶体挂载，若在未配备 CrystalDirect 的设施中使用 CRIMS，两种界面都将引导用户完成晶体 harvesting 过程。CRIMS 会自动记录并将收获的晶体位置存储至 SPINE 或 Unipucks 中21.
  11. 选择 晶体管理器 CRIMS 菜单中。点击 收获的晶体 子菜单用于检查冷冻样品。使用 CrystalDirect 收集器时，将显示收集过程的图像，包括带有已收集晶体的针的图像。
  12. 选择 运输 菜单以连接至ESRF或Petra III同步辐射光源，并创建用于X射线衍射分析的样品 shipment。点击 创建货件 按钮并选择要使用的同步辐射光源及袋号（此处需要输入同步辐射光源的袋密码）。接下来的界面系列用于选择要包含在 shipment 中的 pukcs。该系统允许提供注释以支持数据收集，并为 MASSIF-1 等自动化光束线确定数据收集参数。
  13. 如果在ESRF或Petra III HTX实验室进行数据收集，操作人员将把样品转移至光束线；在其他同步辐射装置上进行的数据收集则由用户自行承担费用。用户可通过前往同步辐射设施现场、远程操作光束线或在MASSIF-1上完成数据收集。在最后一种情况下，数据收集过程完全自动化。在同步辐射设施中，ISPyB的特定界面29 允许用户恢复CRIMS发送的信息，并将样品载具与之关联，从而自动追踪数据收集结果。对于本文所述实验，同步辐射中的数据收集通常使用MXcube完成。31 软件，而数据处理和结构精修则使用 atuoPROC 完成32, Staraninso33，BUSTER33，Pipedream32,33 和 Coot35.
  14. 一旦完成数据收集实验，CRIMS 便会从 ISPyB 获取同步辐射光源处的汇总信息以及初始数据处理结果。29 系统。前往 CRIMS 晶体操作器 菜单并点击 晶体衍射数据 子菜单。所有关于衍射数据采集的信息和元数据均可查阅。还可以从同步辐射光源下载已处理的数据以及原始衍射图像。可查看多个数据集或选择特定数据集。样品管理工具可帮助浏览和选择特定项目的构建样品。
    注意：该流程可通过互联网实现从纯化蛋白质到X射线衍射结果的全自动操作，可同时处理一个或多个样品。该流程适用于结构生物学中不同背景和类型的项目。

结果

上述自动化晶体学流程已成功应用于支持大量内部和外部项目。其中一些亮点包括维也纳马克斯·佩鲁茨实验室（Max Perutz Laboratories）Djinović-Carugo 及其同事开展的项目，该项目专注于一种对细菌病原体生长至关重要的二肽基肽酶的结构与功能分析。通过快速进行结晶筛选、衍射评估、晶体优化以及X射线数据收集循环（本项目最多进行了8轮迭代），仅在数周内便获得了该蛋白三种不同构象状态的结构模型，从而为理解此类蛋白的功能机制提供了关键见解36（见图1）。

另一个例子来自巴塞罗那生物医学研究所（IRB，Barcelona）的 Macias 及其同事，他们结合生物信息学工具和结构生物学方法，鉴定出参与细胞命运调控的转录因子 SMAD3 和 SMAD4 新的 DNA 结合模体。该研究解析了 SMAD3 与 SMAD4 与不同 DNA 结合模体形成的 6 个高分辨率复合物结构37,38，揭示了这些转录因子识别并结合多种 DNA 序列的前所未知的能力，这对于理解其在不同生物学背景下的功能至关重要。这些技术还被应用于支持制药和生物技术公司研究团队在药物设计项目中的专有研究。例如，得益于这些流程带来的高效性，可在数天内完成对多个配体-靶标复合物的结构分析，这对药物研发过程中多轮药物化学优化具有重要价值。最后，我们还将该平台应用于基于 X 射线的大规模片段筛选39。

自动化晶体学流程图；实验设计、筛选、优化、数据收集。
图1：自动化晶体学流程。 EMBL HTX 实验室的集成化运行，结合 CrystalDirect 技术与 CRIMS 软件，并与 ESRF 的 MASSIF-1 光束线联动，同时实现 CRIMS 与 ISPyB 软件之间的自动化通信，从而支持从蛋白质到结构解析的全流程自动化、远程控制的晶体学研究。该流程整合了结晶筛选与优化、晶体的自动化挑取与冷冻冷却，以及数据的自动化收集与处理。所展示的结构模型对应于一种病原菌蛋白酶的三种不同构象状态，这些结构在应用该流程后以创纪录的时间被成功解析36。 请点击此处查看此图的放大版本。

讨论

本文所述的自动化晶体学流程可通过不同的资助项目向全球研究人员开放。目前，可通过申请iNEXT Discovery项目和INSTRUCT-ERIC获取晶体生长实验及CrystalDirect技术的资助使用权限，而欧洲同步辐射装置（ESRF）的大分子晶体学光束线则通过ESRF用户访问计划提供支持。该方法最大限度地缩短了晶体生长与数据收集之间的延迟，加快了那些需要基于衍射结果优化蛋白质表达与结晶条件的高难度项目的进展，同时使科研人员摆脱了与结晶、晶体操作和光束线运行相关的复杂操作，从而使晶体学技术更易于被非专业研究团队所使用。该流程还可用于快速筛选结晶添加剂、衍射相位确定试剂，或通过共结晶实验进行化合物筛选。尽管大多数晶体学项目均可能从该方法中受益，但某些样品可能需要特殊实验方案，无法适用于本文介绍的自动化流程或管道，例如需要微流控系统或高度专业化的结晶装置，或样品本身极不稳定而无法耐受运输的情况。

CrystalDirect 技术还可实现晶体自动浸泡17 ，用于小分子-靶标复合物的表征。具体操作是在晶体收获前，先用激光在结晶板上打一个小孔，然后在孔上加入含有目标化学物质（例如，用于相位解析的试剂或潜在配体）的溶液液滴，使该溶液与结晶液接触并扩散进入其中，最终到达晶体。化学溶液可用水、DMSO 或其他有机溶剂配制。经过一定孵育时间后，可按上述方法收获晶体并进行衍射分析。该方法已应用于基于结构的药物设计中配体-蛋白复合物的快速表征，以及大规模化合物和片段筛选。在后一种情况下，可快速分析包含数百至数千个片段的片段库。本文未展示的特定 CRIMS 接口有助于晶体浸泡实验的设计与自动追踪；同时，CRIMS 软件与 Global Phasing Ltd（英国）开发的 Pipedream 软件套件之间的整合，能够并行地对数百个数据集进行自动数据处理、相位解析、配体识别和结构精修，从而简化数据分析与解释过程32,33。例如，该流程最近被用于鉴定结合到引起人类非洲锥虫病的关键酶——布氏锥虫法呢基焦磷酸合酶（Trypanosoma brucei farnesyl pyrophosphate synthase）活性位点及多个别构位点的片段。

本文介绍的流程有助于加快结构生物学领域的研究进展，并使大分子晶体学技术为更多研究团队所用。此外，这些流程通过促进大规模化合物和片段筛选，有助于推动转化研究，加速药物发现进程，从而助力开发针对更多靶点的更有效、更安全的药物。

披露

JAM 是关于 CrystalDirect 系统的一项专利的共同发明人

致谢

我们感谢欧洲分子生物学实验室（EMBL）与欧洲同步辐射装置（ESRF）联合结构生物学组（JSBG）在ESRF大分子晶体学光束线的使用和运行方面提供的支持。我们感谢Matthew Bowler在ESRF的MASSIF-1光束线数据收集方面提供的支持，感谢Thomas Schneider以及EMBL汉堡团队在德国汉堡DESY同步辐射装置PetraIII的P14光束线数据收集方面提供的出色支持。CrystalDirect样品采集系统是与EMBL格勒诺布尔仪器团队合作开发的。本项目得到了欧盟“地平线2020”计划（H2020）下iNEXT项目（资助号653706）和iNEXT Discovery项目（资助号871037）以及奥弗涅-罗讷-阿尔卑斯大区Booster计划的资助支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CrystalDirect 晶体挑取系统Arinax自动化晶体挑取与冷冻
CrystalDirect 结晶板MitegenSKU: M-XDIR-96-296 孔结晶微孔板
Formulator 16Formulatrix用于自动配制结晶筛选试剂
Mosquito 结晶机器人SPT Labtech用于结晶实验的制备
Tecan Evo 液体处理工作站Tecan用于结晶溶液的配制
Spine PucksMitegenSKU: M-SP-SC3-1适用于自动化同步辐射样品交换器的 SPINE 兼容型低温载样托盘
UniPucksMitegenSKU: M-CP-111-021适用于自动化同步辐射样品交换器的通用低温载样托盘

参考文献

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