此处，我们介绍一种用于分析巨核细胞超微结构的实验方案 原位 采用透射电子显微镜（TEM）观察。收集小鼠骨髓，经固定、环氧树脂包埋后切成超薄切片。经对比染色后，在120 kV电压下用TEM显微镜观察骨髓结构。
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摘要
摘要
巨核细胞的分化与成熟与其骨髓微环境中的细胞及细胞外成分密切相关。这些过程的特征是巨核细胞胞质中逐步形成若干关键结构，包括多倍体且多叶状的细胞核、一种称为分界膜系统（DMS）的内部膜网络，以及将在循环血小板中出现的致密颗粒和α颗粒。本文描述了一种标准化的方案，用于 原位 利用透射电子显微镜（TEM）对小鼠巨核细胞进行超微结构研究，可识别其在骨髓中的成熟阶段及细胞密度的关键特征。骨髓经冲洗后，依次进行固定、乙醇脱水、塑料树脂包埋，并制备成横切面样本。分别制备半薄切片和超薄切片用于组织学观察和透射电镜观察。该方法适用于任何骨髓细胞，可在任何电子显微镜设施中应用，且具有所需样本量小的优势，可在同一只小鼠上联合多种成像技术。
引言
巨核细胞是定位于骨髓中的特化大型多倍体细胞，负责血小板的生成1。它们由造血干细胞经过复杂的成熟过程发育而来，在此过程中，巨核细胞前体细胞体积逐渐增大，同时胞质和细胞核发生显著的形态学变化2。在成熟过程中，巨核细胞会形成多种可区分的结构特征，包括：多叶状细胞核、细胞表面膜内陷形成的分界膜系统（DMS）、由肌动蛋白细胞骨架网络包围的无细胞器分布的周边区，以及多种细胞器，如α颗粒、致密颗粒、溶酶体和多个高尔基复合体。在超微结构水平上，一个主要的改变是胞质被分界膜系统（DMS）分隔为界限分明的不同区域3。这种丰富的膜结构储备将在血小板生成初期支持长条状胞质突起的延伸，随后这些突起在循环系统中重塑为血小板。巨核细胞分化与成熟过程中的任何缺陷都可能影响血小板的数量和/或功能。
薄层透射电子显微镜（TEM）数十年来一直是首选成像方法，可提供高质量的巨核细胞超微结构图像，这些图像深化了我们对血小板生成生理学的理解。4,5本文重点介绍一种标准化的透射电子显微镜（TEM）方法，可用于捕捉血小板生成过程中发生的事件 原位 在原生骨髓微环境中，该方法也可作为分析任何骨髓细胞类型的依据。我们提供了从不成熟到完全成熟巨核细胞发育过程的超微结构示例，这些巨核细胞将胞质突起延伸至窦状毛细血管的微循环中6我们还介绍了一种简便的方法，用于量化不同巨核细胞成熟阶段，以评估骨髓的再生能力及血小板生成潜力。
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方案
所有动物实验均按照欧洲标准 2010/63/EU 以及斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，CREMEAS）的规定进行。实验方案在图1中进行了示意图展示。
1. 骨髓采集与固定（ 图1A）
警告：本实验涉及致癌、致突变和/或有毒物质，须在化学通风橱中进行。请佩戴适当的防护装备，如手套和护目镜。
- 配制固定液，其中包含2.5%戊二醛的卡考基酸盐缓冲液（见补充文件）。
- 骨髓采集
- 使用12至18周龄的成年C57BL/6小鼠，性别不限。通过CO2窒息法处死小鼠，并行颈椎脱位。
- 用一把细剪刀在大腿周围剪开皮肤，用镊子剥离皮肤。去除足部末端，然后在髋部与大腿之间剪开。在膝关节处剪断，分离胫骨与股骨，并用解剖刀去除胫骨和股骨上附着的组织。
- 用锋利的剃须刀片切除骨骺。用镊子夹住股骨，使用装有卡考基酸盐缓冲液的5 mL注射器（配21 G针头），将骨髓冲洗至含有2 mL卡考基酸盐缓冲液的15 mL离心管中。操作时，将针头斜面插入骨髓腔开口，缓慢推动活塞，直至骨髓完全排出。
- 通过快速浸入固定液进行骨髓固定。
- 冲洗后立即用塑料移液器将骨髓柱转移至1 mL新鲜戊二醛固定液（按步骤1.1预先配制）中，在室温下固定60分钟。
注意：为保持组织完整性，从骨骼解剖到固定步骤的整个过程应在10分钟内完成。固定时应确保固定液处于室温，以避免热休克。
- 冲洗后立即用塑料移液器将骨髓柱转移至1 mL新鲜戊二醛固定液（按步骤1.1预先配制）中，在室温下固定60分钟。
2. 将骨髓包埋于琼脂糖中
注意：骨髓组织的内聚性不足以在不同的洗涤步骤中维持其完整性，材料容易丢失。为解决此问题，可在脱水前用琼脂凝胶包裹骨髓。
- 按照补充文件中所述方法制备琼脂糖溶液。
- 用卡考基利酸盐缓冲液清洗1.3节中固定的骨髓组织，并使用塑料移液器小心将其转移至载玻片上。使用预热的移液器，迅速在骨髓柱上滴加一滴2%液态琼脂。
注意：琼脂在冷却时会迅速凝固。为确保骨髓组织被均匀覆盖，琼脂溶液在滴加到载玻片之前必须始终保持温热状态。 - 迅速将载玻片置于冰上，直至琼脂完全凝固（1–2分钟）。
- 在显微镜下，使用锋利的剃须刀片切除并弃去骨髓柱两端部分，以避免这些区域可能存在的组织压缩。将骨髓组织块转移至含有1 mL卡考基利酸盐缓冲液的1.5 mL微量离心管中。
3. 将骨髓包埋在树脂中
警告：树脂组分具有毒性，其中一些为致癌物，必须在化学通风橱中小心操作。使用适当防护装备，如手套和护目镜。四氧化锇在室温下极易挥发，其蒸气对眼睛、鼻子和喉咙有严重危害。2% 四氧化锇在丢弃前必须加入两倍体积的植物油进行中和处理。
- 按照补充文件中所述方法制备环氧树脂。
- 树脂包埋
注意：在连续的锇酸、醋酸铀酰和乙醇溶液孵育过程中，始终将样品保留在同一微量离心管中。使用巴斯德吸管吸除上清液。每次更换溶液时，所用溶液体积应至少为样品体积的10倍。- 用1%锇酸（溶于卡可基酸盐缓冲液）在4 °C下后固定组织块1小时，随后用卡可基酸盐缓冲液洗涤一次，再用蒸馏水洗涤一次。
- 用4%醋酸铀酰（溶于蒸馏水）染色1小时，然后用蒸馏水洗涤两次。
- 通过梯度乙醇溶液进行脱水：在75%乙醇中处理4次，每次5分钟；随后在95%乙醇中处理3次，每次20分钟；最后在100%乙醇中处理3次，每次20分钟。此步骤期间，从冰箱中取出一注射器环氧树脂备用。
注意：可在100%乙醇中暂停流程，最长可暂停1小时。 - 为实现环氧树脂在骨髓内的均匀渗透和聚合，先将组织块在两批丙酮氧化物中依次孵育，每次15分钟。
- 加入等体积的100%丙酮氧化物与环氧树脂混合液，孵育1小时。将样品置于室温下缓慢旋转摇床上。
- 更换为100%环氧树脂，继续在搅拌条件下孵育过夜。
- 再次加入100%环氧树脂，继续在搅拌条件下孵育2小时。
- 在显微镜下将骨髓组织块放入平底硅胶模具中。调整组织块方向，以便后续对整个骨髓进行横切。用环氧树脂充满模具后，置于60 °C下孵育48小时。
注意：所有溶液（乙醇和丙酮氧化物除外）均需通过0.22 µm滤膜过滤，以避免样品污染。为确保树脂充分聚合，在填充模具时应避免产生气泡。
4. 超薄切片（图1B）
注意：透射电子显微镜需要超薄组织切片，电子可穿透这些切片，从而生成细胞内部、细胞器（颗粒、内质网、高尔基体）的结构与排列以及细胞内膜系统分布的投影图像。
- 将样品块安装在超薄切片机的样品台上，固定于样品夹持器中。使用旋转的金刚石或钨钢铣刀，以45˚角修块，去除组织周围多余的树脂。
- 将样品安装到配备有水槽的金刚石刀片的超薄切片机上。分别切出500 nm和100 nm厚度的横切面，用于组织学和透射电镜（TEM）分析。用环形工具从水面上收集漂浮的切片。
- 将500 nm厚的切片置于载玻片上，将100 nm厚的切片置于带有底层滤纸的200目细栅铜网上。每种条件准备五张铜网：先染色两张，其余三张作为备用。
5. 组织学用甲苯胺蓝染色
注意：组织学切片染色至关重要，原因有三：1）确认已切到组织而非包埋树脂，2）检查包埋质量，3）快速评估骨髓样本。若结果不理想，需在组织块中切得更深。
- 将半薄切片载玻片置于加热板上（60 °C）烘干。
- 在载玻片上加入过滤后的1%甲苯胺蓝/1%硼酸钠水溶液，于加热板（60 °C）上加热1-2分钟。用蒸馏水冲洗载玻片，并在加热板上晾干。
- 用一滴聚（甲基丙烯酸丁酯-共-甲基丙烯酸甲酯）封片剂将切片封固于盖玻片上，在光学显微镜下观察。
6. 透射电镜观察的重金属染色（图1C）
注意：作为对照，使用接种环将网格的上侧翻转至每种后续溶液的100 µL液滴中。使用前，每种溶液均经0.22 µm滤膜过滤。每次更换溶液时，轻轻将网格一侧接触滤纸，以去除多余的液体。
- 用蒸馏水配制的4%醋酸铀染色5分钟。
- 用蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。
- 用柠檬酸铅染色3分钟。
- 用蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。
- 将载网底面接触滤纸放置，使其自然干燥。
注意：重金属在二氧化碳存在下会发生反应。为减少沉淀物生成，染色过程中应避免空气流动，不要说话，保持环境安静，并关闭空调。
7. 透射电子显微镜（TEM）（图1E）
注意：样品在透射电子显微镜（TEM）中引入并以120 kV进行观察。
- 首先在低倍镜下（< 500x）观察切片，以评估样品的整体状况（如树脂中是否存在空洞、切片是否有褶皱或压缩、染色后是否出现沉淀物等）。
- 然后在较高倍数下（约 2000x，可区分成熟阶段）观察切片。对整个横截面中各成熟阶段的巨核细胞进行人工计数（参见“代表性结果”部分了解如何通过形态学识别各个阶段）。
注意：网格中的每个方格定义为一个观察区域（对于 200 目铜网，每个方格面积为 16000 µm²）。 - 为评估巨核细胞数量，仅对完全被切片覆盖的方格进行定量分析。为此，采用基于区域筛查的模型：从切片一端到另一端依次观察第一排方格，再以相同方式观察下一排，依此类推。通过该方法，系统而完整地逐格筛查整个骨髓横截面。
- 对每个方格，记录 I、II 或 III 期巨核细胞的数量。
注意：分析颗粒、DMS 结构、胞质区域大小以及核多叶化等特征时，需要更高的放大倍数。
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结果
骨髓组织学
在光学显微镜下观察骨髓的甲苯胺蓝组织学切片，是快速分析组织整体结构的关键步骤，可用于评估组织致密性、微血管连续性以及巨核细胞的大小和形态等特征（图1D）。该步骤在制备超薄切片前进行，以确定是否需要对骨髓组织块进行更深层的切片。由于成熟巨核细胞体积巨大且细胞核呈分叶状，使用40倍物镜即可清晰观察。这有助于快速、全面地评估组织中成熟巨核细胞的密度及其相对于微血管的空间定位。此类半薄切片已足以检测巨核细胞增殖与成熟过程中的异常情况。
骨髓超微结构
根据不同的超微结构特征，小鼠巨核细胞可分为4个阶段，代表其成熟过程中的连续阶段（图2A）。I期巨核细胞直径为10–15 µm，具有一个占据细胞大部分区域的大细胞核，核内含有丰富的核糖体和粗面内质网。在透射电子显微镜（TEM）分析中，出现最早可检测到的DMS前体结构（...
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讨论
在原生环境中直接观察巨核细胞对于理解巨核细胞生成及血小板形成至关重要。本文提供了一种结合骨髓灌洗与浸入式固定的透射电子显微镜方法，可用于解析 原位 骨髓中巨核细胞形态发生全过程的形态学特征。
骨髓冲洗是该方法的关键步骤，高质量冲洗的成功与否取决于操作者的熟练程度和训练水平。尽管操作较为精细，但骨髓冲洗是避免去除矿化骨组织的最佳方法，后者通常需要两周的EDTA脱钙处理，且常伴随巨核细胞形态学上的显著人工假象。此外，从胫骨和股骨获取完整未固定的骨髓样本的一个主要优势在于，可对同一只小鼠的样本联合应用多种成像技术。实际操作中，超微结构研究仅需一个骨髓样本，其余三个样本可用于其他补充性分析。第二个骨髓样本可用于制备新鲜骨髓外植体，以实时观察原代巨核细胞的血小板前体形成动态过程6第三个样本通常用于厚切片的免疫染色研究，以在三维水平上成像并分析巨核细胞在其天然微环境中的分布。最后一个样本可进行冷冻保存，用于后续的免疫胶体金电镜研究，以高分辨率检测蛋白质的亚细胞定位。4这些联合成像方...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
作者感谢Fabienne Proamer、Jean-Yves Rinckel、David Hoffmann、Monique Freund提供的技术协助。本工作由ARMESA（医学与公共卫生研究与发展协会）、欧盟通过欧洲区域发展基金（ERDF）以及H.d.S.获得的ANR-17-CE14-0001-01号资助项目支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（DMP-30） | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| 低熔点琼脂糖 LM-3 型 | Electron Microscopy Sciences, USA | 1670-B | |
| CaCl₂ 六水合氯化钙 | Merck, Germany | 2083 | |
| 铜网 200 目细条型 | Oxford Instrument, Agar Scientifics, England | T200-CU | |
| 二甲基胂酸钠三水合物 | Merck, Germany | 8.20670.0250 | |
| 十二烯基琥珀酸酐（DDSA） | Ladd Research Industries, USA | 21340 | |
| 双刃不锈钢剃刀刀片 | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | EM-72000 | |
| 无水乙醇 | VWR International, France | 20821296 | |
| 滤纸，直径 90 mm | Whatman, England | 512-0326 | |
| 平底包埋硅胶模具 | Oxford Instrument, Agar Scientific, England | G3533 | |
| 戊二醛 25% | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 16210 | |
| 加热板 Leica EMMP | Leica Microsystems GmbH, Austria | 705402 | |
| Histo 钻石刀 45° | Diatome, Switzerland | 1044797 | |
| JEOL 2100 Plus 透射电子显微镜 | JEOL, Japan | EM-21001BU | |
| 柠檬酸铅 - Ultrostain 2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 70 55 30 22 | |
| LX-112 树脂 | Ladd Research Industries, USA | 21310 | |
| MgCl₂ 六水合氯化镁 | Sigma, France | M2393-100g | |
| 封片介质 - 聚（丁基甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸甲酯） | Electron Microscopy Sciences-EMS, USA | 15320 | |
| 纳迪克甲基酸酐（NMA） | Ladd Research Industries, USA | 21350 | |
| 四氧化锇 2% | Merck, Germany | 19172 | |
| 环氧丙烷（1.2-环氧丙烷） | Sigma, France | 82320-250ML | |
| 0.9% 氯化钠注射液 | C.D.M Lavoisier, France | MA 575 420 6 | |
| 外科钢制手术刀片 | Swann-Morton, England | .0508 | |
| 四硼酸钠 - 硼砂 | Sigma, France | B-9876 | |
| 蔗糖 | Merck, Germany | 84100-1KG | |
| 注射器滤器 0.2µm | Pall Corporation, USA | 514-4126 | |
| 甲苯胺蓝 | Ladd Research Industries, USA | N10-70975 | |
| 修块机 EM TRIM2 | Leica Microsystems GmbH, Austria | 702801 | |
| 超薄切片机 Ultracut UCT | Leica Microsystems GmbH, Austria | 656201 | |
| 醋酸铀酰 | Ladd Research Industries, USA | 23620 |
参考文献
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