原位 探索小鼠巨核细胞生成过程——基于透射电子显微镜技术

摘要

此处，我们介绍一种用于分析巨核细胞超微结构的实验方案 原位 采用透射电子显微镜（TEM）观察。收集小鼠骨髓，经固定、环氧树脂包埋后切成超薄切片。经对比染色后，在120 kV电压下用TEM显微镜观察骨髓结构。

摘要

巨核细胞的分化与成熟与其骨髓微环境中的细胞及细胞外成分密切相关。这些过程的特征是巨核细胞胞质中逐步形成若干关键结构，包括多倍体且多叶状的细胞核、一种称为分界膜系统（DMS）的内部膜网络，以及将在循环血小板中出现的致密颗粒和α颗粒。本文描述了一种标准化的方案，用于 原位 利用透射电子显微镜（TEM）对小鼠巨核细胞进行超微结构研究，可识别其在骨髓中的成熟阶段及细胞密度的关键特征。骨髓经冲洗后，依次进行固定、乙醇脱水、塑料树脂包埋，并制备成横切面样本。分别制备半薄切片和超薄切片用于组织学观察和透射电镜观察。该方法适用于任何骨髓细胞，可在任何电子显微镜设施中应用，且具有所需样本量小的优势，可在同一只小鼠上联合多种成像技术。

引言

巨核细胞是定位于骨髓中的特化大型多倍体细胞，负责血小板的生成¹。它们由造血干细胞经过复杂的成熟过程发育而来，在此过程中，巨核细胞前体细胞体积逐渐增大，同时胞质和细胞核发生显著的形态学变化²。在成熟过程中，巨核细胞会形成多种可区分的结构特征，包括：多叶状细胞核、细胞表面膜内陷形成的分界膜系统（DMS）、由肌动蛋白细胞骨架网络包围的无细胞器分布的周边区，以及多种细胞器，如α颗粒、致密颗粒、溶酶体和多个高尔基复合体。在超微结构水平上，一个主要的改变是胞质被分界膜系统（DMS）分隔为界限分明的不同区域³。这种丰富的膜结构储备将在血小板生成初期支持长条状胞质突起的延伸，随后这些突起在循环系统中重塑为血小板。巨核细胞分化与成熟过程中的任何缺陷都可能影响血小板的数量和/或功能。

薄层透射电子显微镜（TEM）数十年来一直是首选成像方法，可提供高质量的巨核细胞超微结构图像，这些图像深化了我们对血小板生成生理学的理解。^4,5本文重点介绍一种标准化的透射电子显微镜（TEM）方法，可用于捕捉血小板生成过程中发生的事件 原位 在原生骨髓微环境中，该方法也可作为分析任何骨髓细胞类型的依据。我们提供了从不成熟到完全成熟巨核细胞发育....

方案

所有动物实验均按照欧洲标准 2010/63/EU 以及斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，CREMEAS）的规定进行。实验方案在图1中进行了示意图展示。

1. 骨髓采集与固定（ 图1A）

警告：本实验涉及致癌、致突变和/或有毒物质，须在化学通风橱中进行。请佩戴适当的防护装备，如手套和护目镜。

1. 配制固定液，其中包含2.5%戊二醛的卡考基酸盐缓冲液（见补充文件）。
2. 骨髓采集
   1. 使用12至18周龄的成年C57BL/6小鼠，性别不限。通过CO₂窒息法处死小鼠，并行颈椎脱位。
   2. 用一把细剪刀在大腿周围剪开皮肤，用镊子剥离皮肤。去除足部末端，然后在髋部与大腿之间剪开。在膝关节处剪断，分离胫骨与股骨，并用解剖刀去除胫骨和股骨上附着的组织。
   3. 用锋利的剃须刀片切除骨骺。用镊子夹住股骨，使用装有卡考基酸盐缓冲液的5 mL注射器（配21 G针头），将骨髓冲洗至含有2 mL卡考基酸盐缓冲液的15 mL离心管中....

结果

骨髓组织学
在光学显微镜下观察骨髓的甲苯胺蓝组织学切片，是快速分析组织整体结构的关键步骤，可用于评估组织致密性、微血管连续性以及巨核细胞的大小和形态等特征（图1D）。该步骤在制备超薄切片前进行，以确定是否需要对骨髓组织块进行更深层的切片。由于成熟巨核细胞体积巨大且细胞核呈分叶状，使用40倍物镜即可清晰观察。这有助于快速、全面地评估组织中成熟巨核细胞的密度及其相对于微血管的空间定位。此类半薄切片已足以检测巨核细胞增殖与成熟过程中的异常情况。

骨髓超微结构
根据不同的超微结构特征，小鼠巨核细胞可分为4个阶段，代表其成熟过程中的连续阶段（图2A）。I期巨核细胞直径为10–15 µm，具有一个占据细胞大部分区域的大细胞核，核内含有丰富的核糖体和粗面内质网。在透射电子显微镜（TEM）分析中，出现最早可检测到的DMS前体结构（.......

讨论

在原生环境中直接观察巨核细胞对于理解巨核细胞生成及血小板形成至关重要。本文提供了一种结合骨髓灌洗与浸入式固定的透射电子显微镜方法，可用于解析 原位 骨髓中巨核细胞形态发生全过程的形态学特征。

骨髓冲洗是该方法的关键步骤，高质量冲洗的成功与否取决于操作者的熟练程度和训练水平。尽管操作较为精细，但骨髓冲洗是避免去除矿化骨组织的最佳方法，后者通常需要两周的EDTA脱钙处理，且常伴随巨核细胞形态学上的显著人工假象。此外，从胫骨和股骨获取完整未固定的骨髓样本的一个主要优势在于，可对同一只小鼠的样本联合应用多种成像技术。实际操作中，超微结构研究仅需一个骨髓样本，其余三个样本可用于其他补充性分析。第二个骨髓样本可用于制备新鲜骨髓外植体，以实时观察原代巨核细胞的血小板前体形成动态过程⁶第三个样本通常用于厚切片的免疫染色研究，以在三维水平上成像并分析巨核细胞在其天然微环境中的分布。最后一个样本可进行冷冻保存，用于后续的免疫胶体金电镜研究，以高分辨率检测蛋白质的亚细胞定位。⁴这些联合成像方.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2,4,6-三（二甲氨基甲基）苯酚（DMP-30）	Ladd Research Industries, USA	21310
低熔点琼脂糖 LM-3 型	Electron Microscopy Sciences, USA	1670-B
CaCl₂ 六水合氯化钙	Merck, Germany	2083
铜网 200 目细条型	Oxford Instrument, Agar Scientifics, England	T200-CU
二甲基胂酸钠三水合物	Merck, Germany	8.20670.0250
十二烯基琥珀酸酐（DDSA）	Ladd Research Industries, USA	21340
双刃不锈钢剃刀刀片	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	EM-72000
无水乙醇	VWR International, France	20821296
滤纸，直径 90 mm	Whatman, England	512-0326
平底包埋硅胶模具	Oxford Instrument, Agar Scientific, England	G3533
戊二醛 25%	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	16210
加热板 Leica EMMP	Leica Microsystems GmbH, Austria	705402
Histo 钻石刀 45°	Diatome, Switzerland	1044797
JEOL 2100 Plus 透射电子显微镜	JEOL, Japan	EM-21001BU
柠檬酸铅 - Ultrostain 2	Leica Microsystems GmbH, Austria	70 55 30 22
LX-112 树脂	Ladd Research Industries, USA	21310
MgCl₂ 六水合氯化镁	Sigma, France	M2393-100g
封片介质 - 聚（丁基甲基丙烯酸酯-共-甲基丙烯酸甲酯）	Electron Microscopy Sciences-EMS, USA	15320
纳迪克甲基酸酐（NMA）	Ladd Research Industries, USA	21350
四氧化锇 2%	Merck, Germany	19172
环氧丙烷（1.2-环氧丙烷）	Sigma, France	82320-250ML
0.9% 氯化钠注射液	C.D.M Lavoisier, France	MA 575 420 6
外科钢制手术刀片	Swann-Morton, England	.0508
四硼酸钠 - 硼砂	Sigma, France	B-9876
蔗糖	Merck, Germany	84100-1KG
注射器滤器 0.2µm	Pall Corporation, USA	514-4126
甲苯胺蓝	Ladd Research Industries, USA	N10-70975
修块机 EM TRIM2	Leica Microsystems GmbH, Austria	702801
超薄切片机 Ultracut UCT	Leica Microsystems GmbH, Austria	656201
醋酸铀酰	Ladd Research Industries, USA	23620