本方法描述了通过流式细胞术从小鼠股骨、胫骨和骨盆骨中纯化巨核细胞-红细胞祖细胞（MEP）和巨核细胞祖细胞（MKp）。
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摘要
摘要
骨髓巨核细胞是大型多倍体细胞，负责血小板的生成。它们通过巨核细胞生成过程由造血干细胞发育而来。该过程的最后阶段较为复杂，通常涉及双潜能巨核-红系祖细胞（MEP）和单潜能巨核细胞祖细胞（MKp）。这些细胞群体出现在 真正有效的 巨核细胞，因此对其分离和表征有助于对巨核细胞形成进行稳健且无偏倚的分析。本方案详细介绍了从小鼠骨髓中收集造血细胞、通过磁性耗竭法富集造血祖细胞，以及最终获得高度纯化的MEP和MKp细胞群体的细胞分选策略。首先，从小鼠股骨、胫骨以及髂嵴中收集骨髓细胞，其中髂嵴含有较高数量的造血祖细胞。使用髂嵴可显著提高每只小鼠获得的总细胞数，从而更符合动物实验的伦理要求。本研究优化了使用450 nm磁珠进行的磁性谱系耗竭法，可实现高效流式细胞分选。最后，本方案介绍了对两种高度纯化的巨核细胞祖细胞群体——MEP（Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9暗淡）和 MKp（Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9明亮的）。该技术易于实施，可提供充足的细胞材料用于：i）进行分子表征，以更深入地了解其身份和生物学特性；ii） 体外 分化实验，将有助于更深入地理解巨核细胞成熟机制，或 iii) 体外 与微环境相互作用的模型。
引言
血小板由巨核细胞产生。这些大型多倍体细胞位于骨髓中，与其他所有血细胞一样，均起源于造血干细胞（HSC）1。骨髓中巨核细胞的经典生成途径始于HSC，涉及一系列不同祖细胞的生成，这些祖细胞逐步限制其分化潜能2。首个标志向巨核细胞谱系定向分化的祖细胞是巨核-红系祖细胞（MEP），这是一种双能祖细胞，可同时生成红系细胞和巨核细胞3,4,5。随后，MEP产生一种单能祖细胞/前体细胞（MKp），进一步分化为成熟的巨核细胞，进而生成血小板。这些祖细胞的生成机制，以及它们向巨核细胞分化和成熟的过程十分复杂，目前仅部分阐明。此外，MEP群体在分化潜能方面的异质性及其细胞内在的定向分化程度仍不明确。为了深入解析这些过程，获得（或能够获取）高纯度的MEP和MKp细胞群体，以进行精细的分子水平和单细胞分析，显得至关重要。
多项研究已证实，小鼠中特定的细胞表面标志物组合可用于鉴定巨核细胞系定向的前体细胞6,7,8。基于这些发现，我们建立了....
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方案
涉及动物的实验方案均依照斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，批准号：E67-482-10）的伦理规范执行。
1. 小鼠骨骼采集
- 根据机构指南对动物实施安乐死。
注意：本论文中展示的数据来自8至12周龄的C57Bl/6小鼠。所获得的细胞数量以及所述细胞群体的频率可能因小鼠年龄和品系而异。 - 用70%乙醇喷洒小鼠尸体。
- 使用剪刀在皮肤上垂直于脊柱方向做0.5–1 cm的切口，并将皮肤向身体四周撕开。向下拉脱下肢部位的皮肤，彻底去除皮肤。
- 将动物腹面朝下放置于解剖垫上。用手指沿暴露的脊柱从上至下滑动，以定位骨盆。为找到髂嵴，需在后肢附近的腰部区域（骨盆骨的前上部）识别出一个小突起。图1A、B展示了小鼠解剖结构的示意图。
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结果
通过流式细胞术对鉴定为MEP和MKp的细胞进行表型分析。使用与CD41a和CD42c结合的荧光抗体对细胞进行标记，CD41a和CD42c是巨核细胞系和血小板谱系的经典标志物。MKp细胞群体表达这两种标志物，而MEP细胞群体表面尚未检测到这些标志物的表达（图4Ai，4Aii）。多倍体是巨核细胞的特征之一。对分选后的细胞群体进行DNA含量分析，结果显示MEP细胞群体主要为2N，MKp细胞中有少量为4N，但这些细胞群体中未显著检测到更高倍性的细胞（图4Aiii）。
为了确认分选后细胞群体的身份，进行了多项分化实验，以评估其向巨核细胞系和红系分化的能力。首先，通过半固体集落形成实验定量分析巨核系祖细胞（CFU-MK）和红系祖细胞（BFU-E）。CFU-MK在MEP和MKp细胞群中均被检测到，但在其他测试的细胞群中未检测到（图4B）。BFU-E在MKp细胞群中未检测到，但在MEP细.......
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讨论
本文所述方法可用于提取和纯化小鼠MEP和MKp。在优化该实验方案时，一个重要的参数是获得足够数量的细胞，以适用于大多数基于分子和细胞的检测。通常用于提取造血细胞的小鼠骨骼采集方法，一般包括获取每只小鼠的股骨和胫骨。而骨盆骨作为另一重要的造血组织来源，却常常被忽视。未采集髂嵴的主要原因在于人们对小鼠骨骼内部解剖结构了解不足，以及常规操作中通常通过横切或紧靠股骨头上方切断后肢进行采集。此外，人们通常认为由于髂嵴骨内存在骨小梁，骨髓细胞难以有效冲洗出来，而胫骨和股骨中央部分则无此结构。本方案针对上述两个问题进行了改进，提出了一种标准化、可靠且高效的实验方法，可对包括骨盆骨在内的每根后肢骨进行充分冲洗。特别是，使用髂骨可获得每只小鼠105 ± 7 × 106个细胞，而传统方法通常仅获得42 ± 5 × 106个细胞。该方法的主要优势在于，为获得特定数量的目标细胞所需的小鼠数量显著减少，从而提供了更具伦理性和成本效益的实验条件。因此，该方法也适用于任何需要骨髓细胞悬液的研究，例如造血干细胞的分离10，或在半固体条件下分析造血祖细胞行为
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披露
作者声明不存在竞争性财务利益。
致谢
作者谨此感谢Monique Freund、Catherine Ziessel和Ketty提供的技术协助。本工作由ARMESA（医学与公共卫生研究与发展协会）以及授予Henri.de la.Salle的ANR-17-CE14-0001-01号基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 21号针头 | BD Microlance | 301155 | |
| 7AAD | Sigma-Aldrich | A9400 | |
| Gr-1-biotin抗体 | eBioscience | 13-5931-85 | 磁珠耗竭 |
| B220-biotin抗体 | eBioscience | 13-0452-85 | 磁珠耗竭 |
| Mac-1-biotin抗体 | eBioscience | 13-0112-85 | 磁珠耗竭 |
| CD3e-biotin抗体 | eBioscience | 13-0031-85 | 磁珠耗竭 |
| CD4-biotin抗体 | eBioscience | 13-9766-82 | 磁珠耗竭 |
| CD5-biotin抗体 | eBioscience | 13-0051-85 | 磁珠耗竭 |
| CD8a-biotin抗体 | eBioscience | 13-0081-85 | 磁珠耗竭 |
| TER119-biotin抗体 | eBioscience | 13-5921-85 | 磁珠耗竭 |
| CD127-biotin抗体 | eBioscience | 13-1271-85 | 磁珠耗竭 |
| CD45-FITC抗体 | eBioscience | 11-0451-85 | 细胞分选 |
| CD45-PE抗体 | eBioscience | 12-0451-83 | 细胞分选 |
| TER119-APC抗体 | eBioscience | 17-5921-83 | 细胞分选 |
| CD45-PECy7抗体 | eBioscience | 25-0451-82 | 细胞分选 |
| CD45-biotin抗体 | eBioscience | 13-0451-85 | 细胞分选 |
| CD9-FITC抗体 | eBioscience | 11-0091-82 | 细胞分选 |
| 抗体 c-kit-APC | eBioscience | 17-1171-83 | 细胞分选 |
| Sca-1-PE抗体 | eBioscience | 12-5981-83 | 细胞分选 |
| CD16/32-PE抗体 | eBioscience | 12-0161-83 | 细胞分选 |
| CD150-PECy7抗体 | eBioscience | 25-1502-82 | 细胞分选 |
| 培养基 StemSpan-SFEM | Stemcell technologies | #09650 | |
| 解剖垫 | Fisher Scientific | 10452395 | |
| DPBS | Life Technologies | 14190-094 | |
| 乙醇 | vWR Chemicals | 83813.360 | |
| 镊子 | Euronexia | P-120-AS | |
| 玻璃巴斯德移液管 | Dutscher | 42011 | |
| 磁铁： DynaMag-5 | Thermo Fisher Scientific | 12303D | |
| 磁珠：Dynabeads 羊抗大鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Megacult | Stemcell technologies | #04970 | |
| MethoCult SF M3436 | Stemcell technologies | #03436 | |
| 新生小牛血清 | Dutscher | 50750-500 | |
| 红细胞裂解液 | BD Bioscience | 555899 | |
| 手术刀 | Fisher Scientific | 12308009 | |
| 剪刀 | Euronexia | C-165-ASB | |
| 无菌1 mL注射器 | BD Bioscience | 303172 | |
| 无菌15 mL离心管 | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 无菌5 mL聚丙烯管 | Falcon | 352063 | |
| 无菌5 mL聚苯乙烯管 | Falcon | 352054 | |
| 带70µm细胞筛网盖的无菌管 | Falcon | 352235 | |
| 无菌培养皿 | Falcon | 353003 | |
| 链霉亲和素-APC-Cy7 | BD Biosciences | 554063 | 细胞分选 |
| 试管滚轴混合器 | Benchmark Scientific | R3005 |
参考文献
- Kaushansky, K. Historical review: megakaryopoiesis and thrombopoiesis. Blood. 111 (3), 981-986 (2008).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6774), 193-197 (....
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors
Posted by JoVE Editors on 7/28/2021. Citeable Link.
An erratum was issued for: Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors. A figure was updated.
Figure 2 was updated from:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Magnetic depletion of lineage committed (Lin) cells. (A) Schematic representation of the magnetic depletion protocol. First, unsorted bone marrow cells are labeled with the biotin-conjugated rat anti-mouse antibody cocktail. Cells are then incubated with anti-rat Ig coated magnetic beads and subsequently subjected to the magnetic depletion using a strong magnet. The magnet will retain the labeled magnetic Lin+ fraction against the tube walls, while the unlabeled non-magnetic Lin- negative fraction will be collected in a new tube. (B) Lineage committed cells can be identified using fluorescent conjugated streptavidin. Typical analysis of the lineage expression in cells prior to magnetic depletion (total bone marrow) and after magnetic depletion (Lin- Fraction) N = 21. Please click here to view a larger version of this figure.
