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小鼠新鲜骨髓外植体中血小板形成过程的动力学

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DOI：

10.3791/62501

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2021年5月20日

 ,  ,  ,  , 
1Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS

本文内容

摘要

本文详细介绍了骨髓外植体方法，从样本制备到显微镜玻片分析，用于评估在生理环境中已分化的巨核细胞形成前血小板的能力。

摘要

巨核细胞生成的最后阶段会导致成熟巨核细胞形成细胞质突起，即所谓的前血小板（proplatelets）。通过体外（in vitro）分化的巨核细胞，人们对前血小板的形成已有较多了解；然而，越来越多的证据表明，传统的培养系统并不能真实再现发生在骨髓内部的分化/成熟过程。在本论文中，我们介绍了一种最初由 Thiéry 和 Bessis 于1956年描述的组织块培养法，用于观察在天然微环境中成熟的巨核细胞，从而避免潜在的人为假象和误读。新鲜骨髓通过冲洗小鼠股骨获得，切成0.5 mm的横截面，置于含生理缓冲液的培养腔中，在37 °C下孵育。巨核细胞逐渐在组织块边缘可见，并可在倒置显微镜耦合摄像系统下连续观察长达6小时。随着时间推移，巨核细胞形态发生改变，部分细胞呈球形，另一些则形成粗大的突起，或延伸出大量具有广泛分支的细长前血小板。可同时进行定性和定量分析。该方法的优点在于操作简单、可重复性强且快速高效，因组织块中含有大量巨核细胞，通常在6小时内约有一半细胞形成前血小板，而体外培养的小鼠巨核细胞则需4天。除了用于突变小鼠的研究外，该方法另一个有价值的应用是可直接评估药理学试剂对前血小板延伸过程的影响，而不会干扰可能在培养过程中发生的分化过程。

引言

骨髓外植技术最初由 Thiéry 和 Bessis 于 1956 年建立，用于描述大鼠巨核细胞胞质突起的形成，这是血小板生成的初始事件1利用相差显微镜和电影摄影技术，这些作者表征了成熟圆形巨核细胞向 "类似鱿鱼的" 具有细胞质突起的血小板生成细胞，其突起表现出伸长和收缩的动态运动。这些突起逐渐变细，最终呈丝状，沿突起及其末端可见少量肿胀。这些典型的巨核细胞突起，经获得 体外 在液体培养基中，这些细胞与固定骨髓中观察到的血小板具有一定的相似性，其中巨核细胞通过窦状壁向血循环中延伸出长长的突起2,31994年促血小板生成素（TPO）的发现与克隆，使得在培养中能够分化出可形成前血小板突起的巨核细胞，这些突起与骨髓外植体中所描述的结构相似。4,5,6然而，在培养条件下，巨核细胞的成熟效率要低得多，尤其是与骨髓中成熟的巨核细胞相比，培养的巨核细胞其复杂的内部膜网络发育不全，从而阻碍了对血小板生成机制的研究7,8.

我们在此详细介绍了基于Thiéry和Bessis方法的骨髓外植体模型，用于实时观察在天然微环境中完全成熟的鼠源巨核细胞的血小板前体形成过程，从而避免了可能的 体外 伪影与误读。结果以野生型成年小鼠为例，展示了巨核细胞延伸前血小板的能力、前血小板的形态及其结构复杂性。我们还引入了一种快速定量策略，用于质量验证，以确保巨核细胞记录过程中的数据准确性和稳健性。本方案为该方法的最新版本 此前已作为书籍章节出版9.

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方案

所有动物实验均按照欧洲标准 2010/63/EU 以及斯特拉斯堡大学动物实验伦理区域委员会（Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale Strasbourg，CREMEAS）的规定进行。

1. 试剂的准备

  1. 按照表1所述配制试剂。
    1. 配制储备液I时，分别溶解每种粉末。确保配制液的渗透压高于295 mOsm/L。该溶液可在4 °C保存一年。
    2. 配制台氏缓冲液时，按表1所述配制溶液，用蒸馏水定容至100 mL，并加入0.1 g无水D(+)蔗糖。根据需要使用1 N HCl调节pH至7.3，并将渗透压调节至295 mOsm/L。为防止细菌生长，加入青霉素G至终浓度10 U/mL，以及硫酸链霉素至终浓度0.29 mg/mL。将最终溶液经0.22 µm滤膜过滤。

2. 实验装置的准备

  1. 实验当天，将台氏液缓冲液在 37 °C 下预热，并打开显微镜加热腔，使温度升至 37 °C。
  2. 准备好所有必要的工具，例如计时器、孵育腔、5 mL 注射器、21 G 针头、镊子、剃刀刀片、巴斯德吸管、载玻片和 15 mL 离心管（图 1A）。

3. 小鼠骨髓的分离

  1. 采用 CO2 窒息法及颈椎脱位法对 8–12 周龄的 C57BL/6 小鼠实施安乐死。该操作应由具备资质且熟练的人员迅速完成。
  2. 为避免微生物污染，取出股骨前先将小鼠尸体浸入 70% (v/v) 乙醇中。解剖时使用经 70% 乙醇消毒的器械。收集双侧股骨，并清除附着的组织。快速浸入乙醇后，将其置于含有 2 mL Tyrode's 缓冲液的 15 mL 离心管中。
  3. 使用锋利的剃须刀片切除骨骺，并用装有 2 mL Tyrode's 缓冲液的 5 mL 注射器冲洗骨髓。操作时将 21 G 针头插入股骨远端（膝关节侧）开口处，缓慢推动活塞，以获取完整的骨髓柱状组织（图 1B，C）。骨髓收集过程应尽可能短暂（不超过 10 分钟）。

4. 骨髓切片及放入孵育腔室

  1. 使用 3 mL 塑料移液管小心轻柔地将完整的骨髓转移至载玻片上。重要的是，样本必须被缓冲液覆盖，以防止干燥（图 1D）。
    注意：避免反复流动，以尽量减少可能导致组织解离的剪切力。
  2. 在体视显微镜（10×）下，切除因冲洗时受压而可能受损的骨髓末端。然后使用锋利的剃须刀片切割横截面。切片应足够薄以便详细观察，但需确保巨核细胞不会因受压而受损（通常厚度约为 0.5 mm）（图 1E、F）。
    注意：切片需在放大镜下使用锋利的剃须刀片进行，以调整其厚度至约 0.5 mm。仅选择厚度均匀的切片。该操作并不复杂，但其标准化需要一定经验。
  3. 使用塑料移液管将 10 个切片收集至含有 Tyrode 缓冲液的 1 mL 离心管中（图 1G）。
  4. 小心地将切片转移至直径为 13 mm 的孵育腔室中（图 1H）。
  5. 吸除缓冲液，并调整体积至 30 µL 含 5% 小鼠血清的 Tyrode 缓冲液。
    注意：此步骤可加入药理学试剂，以评估其对血小板前体形成的影响。
  6. 将切片适当间隔放置。用尺寸为 22 × 55 mm 的盖玻片密封自粘式腔室。粘贴时倾斜盖玻片，以避免产生气泡（图 1I）。
  7. 将腔室置于 37 °C 的加热腔中。从此时起启动计时器（T = 0 h）。实验在 37 °C 下持续进行 6 小时（T = 6 h）。

5. 骨髓外植体的实时观察

  1. 使用倒置相差显微镜（放大倍数为40倍物镜）并连接视频摄像机，观察骨髓外植体。在开始观察前，让细胞孵育30分钟。观察过程中需不断调节焦距，因为巨核细胞处于运动状态。
    注意：也可采用其他观察模式（例如微分干涉差（DIC）显微镜，或利用内源性荧光标记巨核细胞的小鼠进行荧光显微镜观察），但相差显微镜最有利于清晰显示巨核细胞细长的突起结构，从而实现精确量化。孵育30分钟后，骨髓细胞逐渐迁移至外植体边缘，形成单层细胞。孵育1小时后，可通过细胞体积较大及细胞核多叶状等特征识别巨核细胞（图1J，K）。孵育3小时后，巨核细胞数量增加，部分细胞出现细长突起。
  2. 录制视频以记录巨核细胞的形态转变过程。

6. 血小板前体延伸的巨核细胞的定量分析

  1. 绘制示意图以定位孵育室中的每个切片区域（图 1K）。
  2. 孵育 1 小时后，识别各切片边缘可见的巨核细胞（即巨大的多叶核细胞），并在示意图上标出其位置。在 3 小时和 6 小时后重复此操作。
    注意：根据示意图，可随时间轻松定位每个巨核细胞，并分析其形态学变化（如大小、形变、前血小板突起等）。另一种方法是使用特定的导航软件。

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结果

定性结果。 实验开始时，所有细胞均聚集在骨髓区域。30分钟后，细胞在组织块边缘变得清晰可见。巨核细胞因其体积较大而可被识别，随后可随时间观察其动态变化（如大小、形态、运动性、前血小板突起的延伸及血小板释放）（图2A）。小型巨核细胞直径在20至30 µm之间，细胞核呈多叶状；而成熟的圆形巨核细胞体积更大（直径> 30 µm），胞质扩张。偶尔可见少量深色巨核细胞（图2C），代表死亡细胞，其比例不应超过0.5%。若该比例高于此值，则提示样本制备存在问题。通过调节焦距可清晰观察细胞核的形态。

定量结果。巨核细胞的计数按6.2节所述进行人工计数，并在培养室封闭后3小时和6小时根据其形态进行分类。图2A总结了四种主要的巨核细胞类别：（1）小型巨核细胞，（2）大型巨核细胞，（3）具有粗大突起的巨核细胞，（4）具有细长且分支状突起的巨核细胞。后者为...

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讨论

这里我们介绍一种简单且低成本的方法 体外 评估在骨髓中生长的巨核细胞延伸前血小板效率的方法。小鼠骨髓外植体模型具有四个主要优势。第一，该方法无需高级技术操作技能。第二，获得延伸前血小板的巨核细胞所需时间较短，外植体方法仅需6小时，而从小鼠前体细胞开始的传统培养方法至少需要4天。第三，由于所需组织量较少且实验结果具有可重复性，该方法将所需实验小鼠数量降至最低（通常每实验条件仅需6只小鼠），从而使实验在经济和伦理上均具高效性。最后但同样重要的是，该方法的优势在于使用了在其天然环境中完全发育成熟的巨核细胞，这可能在揭示那些在其他条件下可能被掩盖的表型方面具有重要价值 体外 由培养条件可能带来的假象所致。这一点此前已在巨核细胞受限的小鼠中有所记载 MYH9 失活过程中，关于血小板前体形成的研究发现了相互矛盾的结果 体外 （形成增加）10 和 体内 （形成减少）分化的巨核细胞11这些看似矛盾的结果可通过肌球蛋白IIA在受限环境中对正常巨核细胞分化具有必要性来解释，...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者感谢 Jean-Yves Rinckel、Julie Boscher、Patricia Laeuffer、Monique Freund、Ketty Knez-Hippert 提供的技术支持。本研究得到了法国国家研究署（ANR）项目基金 ANR-17-CE14-0001-01 和 ANR-18-CE14-0037 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5 mL 注射器TerumoSS+05S1
21 号针头BD Microlance301155
CaCl2.6H2OSigma21108
Coverwall 培养室Electron Microscopy Sciences70324-02深度：0.2 mm
HEPESSigmaH-3375pH 调至 7.5
人血清白蛋白VIALEBEX授权药品编号：n° 340095644699520% (200 mg/mL - 100 mL)
KClSigmaP9333
MgCl2.6H2OSigmaBVBW8448
显微盖玻片Electron Microscopy Sciences72200-4022 mm × 55 mm
显微镜Leica Microsystems SA, Westlar, GermanyDMI8 - 514341空气镜
显微镜相机Leica Microsystems SA, Westlar, GermanyK5 CMS GmbH -14401137图像分辨率：420 万像素
小鼠血清BioWestS2160-010
NaClSigmaS7653
NaH2PO4.H2OSigmaS9638
NaHCO3SigmaS5761
PSG 100×Gibco, Life Technologies1037-01610,000 单位/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素和 29.2 mg/mL 谷氨酰胺
剃刀刀片Electron Microscopy Sciences72000
蔗糖 D (+)SigmaG8270

参考文献

  1. Thiery, J. P., Bessis, M. Mechanism of platelet genesis; in vitro study by cinemicrophotography. Reviews in Hematology. 11 (2), 162-174 (1956).
  2. Becker, R. P., De Bruyn, P. P. The transmural passage of blood cells into myeloid sinusoids and the entry of platelets into the sinusoidal circulation: A scanning electron microscopic investigation. American Journal of Anatomy. 145 (2), 183-205 (1976).
  3. Muto, M. A scanning and transmission electron microscopic study on rat bone marrow sinuses and transmural migration of blood cells. Archivum Histologicum Japonicum. 39 (1), 51-66 (1976).
  4. Cramer, E. M., et al. Ultrastructure of platelet formation by human megakaryocytes cultured with the Mpl ligand. Blood. 89 (7), 2336-2346 (1997).
  5. Kaushansky, K., et al. Promotion of megakaryocyte progenitor expansion and differentiation by the c-Mpl ligand thrombopoietin. Nature. 369 (6481), 568-571 (1994).
  6. Strassel, C., et al. Hirudin and heparin enable efficient megakaryocyte differentiation of mouse bone marrow progenitors. Experimental Cell Research. 318 (1), 25-32 (2012).
  7. Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
  8. Scandola, C., et al. Use of electron microscopy to study megakaryocytes. Platelets. 31 (5), 589-598 (2020).
  9. Eckly, A., et al. Characterization of megakaryocyte development in the native bone marrow environment. Methods in Molecular Biology. 788, 175-192 (2012).
  10. Eckly, A., et al. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation. Blood. 113 (14), 3182-3189 (2009).
  11. Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
  12. Ortiz-Rivero, S., et al. C3G, through its GEF activity, induces megakaryocytic differentiation and proplatelet formation. Cell Communication and Signaling. 16 (1), 101(2018).
  13. Junt, T., et al. Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow. Science. 317 (5845), 1767-1770 (2007).
  14. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  15. Malara, A., et al. Extracellular matrix structure and nano-mechanics determine megakaryocyte function. Blood. 118 (16), 4449-4453 (2011).
  16. Balduini, A., et al. Adhesive receptors, extracellular proteins and myosin IIA orchestrate proplatelet formation by human megakaryocytes. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 6 (11), 1900-1907 (2008).

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