基于甲基纤维素的三维水凝胶培养巨核细胞以促进细胞成熟并研究刚度与空间限制的影响

摘要

目前公认，细胞的三维环境在其行为、成熟和/或分化过程中可能发挥重要作用。本方案描述了一种三维细胞培养模型，旨在研究物理限制和机械约束对巨核细胞的影响。

摘要

三维环境所导致的限制性条件和力学约束正日益被视为影响细胞行为的重要决定因素。因此，三维培养技术已被开发出来，以更接近地模拟 体内 情况。巨核细胞由骨髓（BM）中的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）分化而来。骨髓是人体最柔软的组织之一，被包裹在骨内。由于骨在细胞尺度上几乎不可延展，巨核细胞因此同时处于低刚度和高度受限的环境中。本方案介绍了一种通过免疫磁珠分选法分离小鼠谱系阴性（Lin-）HSPCs，并在由甲基纤维素构成的三维（3D）培养基中将其分化为成熟巨核细胞的方法。甲基纤维素对巨核细胞无反应性，其刚度可调节至与正常骨髓相当的水平，或提高以模拟病理性纤维化骨髓。本方案还详细描述了后续细胞分析所需的巨核细胞回收步骤。尽管在三维环境中血小板前体的延伸受到抑制，但本文将说明如何将巨核细胞重悬于液体培养基中，并定量评估其延伸血小板前体的能力。相较于在液体环境中培养的巨核细胞，在三维水凝胶中培养的巨核细胞具有更强的形成血小板前体的能力。该三维培养体系能够：i）促进祖细胞向更高成熟阶段的巨核细胞分化；ii）重现可能在 体内 但在传统的液体培养中容易被忽视，以及 iii) 研究由三维环境提供的机械信号所诱导的转导通路。

引言

细胞在体内经历复杂的三维微环境，并受到化学信号与力学物理信号之间相互作用的影响，包括来自组织的刚度以及邻近细胞和周围基质造成的空间限制 ^1,2,3刚度和空间限制对细胞行为的重要性直到最近几十年才被认识到。2006年，Engler 等人的开创性研究 ⁴ 强调了机械环境在细胞分化中的重要性。作者证明，细胞基质刚度的变化可引导干细胞向不同的分化谱系定向。自此，机械信号对细胞命运和行为的影响日益受到重视并被广泛研究。. 尽管骨髓是机体最柔软的组织之一，但它具有被骨骼限制在内的三维结构组织。骨髓的硬度虽然在技术上难以精确测量，但估计介于15至300 Pa之间 ^{5, 6}在基质中，细胞彼此之间紧密相邻。此外，其中大多数细胞正向窦状血管迁移，以进入血液循环。这些条件对邻近细胞产生了额外的机械约束，细胞必须适应这些力学作用力。力学信号是一个重要的参数，其对巨核细胞分化和血小板前体形成的影响直到最近才开始被研究。尽管巨核细胞能够分化 体外 在传统液体培养中，它们无法达到所观察到的成熟程度 体内，部分原因在于缺乏来自三维环境的机械信号刺激

方案

所有实验均应遵循机构关于实验动物护理和使用的指导方针。视频中展示的所有方案均严格遵守欧洲法律以及法国血液机构（Etablissement Français du Sang，EFS）评审委员会的建议。该方案的首个版本最初于2018年发表在《分子生物学方法》（Methods in Molecular Biology）⁸。

注意：图1 展示了整个流程的示意图。该流程包括：1）骨组织解剖、骨髓获取及骨髓细胞的机械分离；2）使用磁珠分选法分离谱系阴性（Lin-）细胞；3）在液体培养基或甲基纤维素水凝胶中接种细胞；4）将三维凝胶中培养生成的巨核细胞重新悬浮，以在液体培养基中观察血小板前体的形成。

1. 从成年小鼠中采集骨骼

注意：本节中需尽量减少微生物污染。

1. 准备一个15 mL离心管用于收集骨骼，管中加入含1%总体积青霉素-链霉素-谷氨酰胺（PSG）抗生素混合液（青霉素10000 U/mL，链霉素100000 µg/mL，L-谷氨酰胺29.2 mg/mL）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）。
   注意： 若使用的所有小鼠基因型相同，可将所有骨骼汇集至同一离心管中，每只小鼠加入1 mL含1% PSG的DMEM。抗生素对于防止骨骼取....

结果

使用本方案获得的数据最初于2016年发表在《血液》杂志上⁹。

根据实验方案，细胞被接种于液体培养基或甲基纤维素水凝胶培养基中。在液体培养基中，细胞全部沉降至孔板底部，与坚硬的塑料表面接触，有时也与其他细胞接触。相比之下，包埋在甲基纤维素水凝胶中的细胞则在凝胶中均匀分布，并与邻近细胞相互隔离（图3A）。与液体培养相比，终浓度为2%的甲基纤维素凝胶使巨核细胞的平均直径略有增加（图3B），这与文献报道中较高的倍性水平一致⁹。相反，将甲基纤维素浓度再提高0.5%则会抑制巨核细胞的分化，表现为平均直径减小（图3B）。

液体培养中分化的巨核细胞与在其他条件下分化的巨核细胞在超微结构上存在明显差异 体内 在骨髓内。成熟巨核细胞的一个特征是存在复杂的胞质.......

讨论

在过去的十年中，力学生物学在生物学的许多领域引起了越来越多的关注。目前普遍认为，细胞周围的机械环境在其行为中确实发挥作用，这凸显了研究巨核细胞如何感知和响应细胞外机械信号的重要性。准确测量骨髓组织在体内的刚度具有挑战性in situ¹¹，特别是当考虑造血性红骨髓时，因为在大型哺乳动物中，红骨髓位于骨小梁内部，而较易获取的骨干骨髓主要由脂肪细胞（黄骨髓）组成¹²。对于小鼠的分离骨髓而言，尽管其骨干主要含有红骨髓，但另一个问题是骨髓一旦从骨中提取出来便不再保持结构完整性。然而，Shin 及其合作者利用原子力显微镜测定了小鼠骨干骨髓的刚度，得到的值为 E_marrow = 0.3 ± 0.1 kPa，表明骨髓属于体内最柔软的组织之一⁶。

本方案的关键在于比较巨核细胞在液体培养基与水凝胶中的行为差异。在液体环境中，细胞均沉降至孔板底部，接触坚硬的塑料表面，并可能与其他细胞接触。相比之下，嵌入甲基纤维素水凝胶中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
18号针头	Sigma-Aldrich	1001735825
21号针头	BD Microlance	301155
23号针头	Terumo	AN*2332R1
25号针头	BD Microlance	300400
4孔培养皿	Thermo Scientific	144444
5 mL 注射器	Terumo	SS+05S1
细胞夹	Microm Microtech	F/CLIPSH
带滤纸片的细胞沉降漏斗	Microm Microtech	F/JC304
细胞离心涂片机	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	无菌 Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液
EasySep 磁力架	Stem Cell Technologies	18000
EasySep 小鼠造血祖细胞分离试剂盒	Stem Cell Technologies	19856A	生物素标记抗体（CD5、CD11b、CD19、CD45R/B220、Ly6G/C(Gr-1)、TER119、7–4）和链霉亲和素包被的磁珠
EDTA	Invitrogen	15575-020
胎牛血清	Healthcare Life Science	SH30071.01
鲁尔锁扣 1 mL 注射器	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	或 BD MEDICAL 的 309628 型注射器
鲁尔锁扣注射器连接头	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
多聚赖氨酸包被载玻片	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 单位/mL 青霉素，10,000 μg/mL 链霉素，29.2 mg/mL 谷氨酰胺
大鼠血清	Stem Cell Technologies	13551
重组水蛭素	Transgène	rHV2-Lys47
重组人血小板生成素 (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 单位/mL
圆底 10 mL 塑料管	Falcon	352054
圆底 5 mL 聚苯乙烯管