利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

摘要

靶点切割与标签化（CUT&Tag）是一种高效的染色质表观基因组分析策略。本方案介绍了一种优化的CUT&Tag方法，用于植物中组蛋白修饰的分析。

摘要

染色质水平的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为以及非编码RNA与其招募蛋白的相互作用，可实现基因表达的时间和空间控制。靶位点切割与标签化（CUT&Tag）是一种染色质蛋白锚定技术，该方法首先通过特异性抗体识别目标染色质蛋白，随后抗体结合蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，由该融合蛋白对目标染色质进行切割 原位 通过镁离子的激活。在此，我们提供我们先前发表的CUT& 使用异源四倍体棉花叶片中分离的完整细胞核进行标签化实验的改良方案。该逐步操作流程可用于植物表观基因组学研究。此外，还提供了针对植物细胞核分离的大量改良步骤及关键性评注。

引言

转录因子结合的DNA位点以及与组蛋白修饰标记相关的开放染色质区域在调控基因表达中发挥关键功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点¹。传统上，染色质免疫沉淀实验（ChIP）结合深度测序（ChIP-seq）被广泛用于全基因组范围内特异性组蛋白修饰或特定蛋白质结合DNA靶标的鉴定，是表观遗传学领域广泛应用的技术²。靶位点切割与标签化（Cleavage under targets and tagmentation, CUT&Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获全基因组中与蛋白质结合的DNA片段⁵。与ChIP相比，CUT&Tag能够在细胞用量较少的情况下，通过更简化的实验流程，生成高分辨率且背景信号极低的DNA文库³。迄今为止，利用CUT&Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法已在动物细胞中建立^4,5。特别是单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）技术也已成功应用于人类组织和细胞⁶。然而，由于植物细胞壁结构复杂且含有多种次生代谢物，CUT&Tag在植物组织中的应用仍面临较大的技术挑战。

此前，我们报道了一种CU....

方案

1. 准备转座酶和储备溶液（第1天）

注意：在此步骤中，寡核苷酸接头与 Tn5 转座酶结合以形成具有活性的转座酶。

1. 使用退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将引物（引物A、引物B和引物C）稀释至100 µM浓度（引物序列信息参见表1，工作溶液配方参见表2）。保存于-20 °C，待用。
2. 在PCR管中设置以下两个反应：反应1（接头AB），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物B；反应2（接头AC），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物C。
3. 在PCR仪中使用以下程序对接头进行退火：加热盖（102 °C），75 °C 15分钟，60 °C 10分钟，50 °C 10分钟，40 °C 10分钟，25 °C 30分钟。
   注：接头为部分双链DNA分子（浓度 = 50 pmol/µL）。
4. 在1.5 mL离心管中设置以下反应：10 µL pA-Tn5转座酶（500 ng/µL 或 7.5 pmol/µL），0.75 µL 接头AB（50 pmol/µL），0.75 µL 接头AC（50 pmol/µL），7 µL 偶联缓冲液。轻轻吹打混匀20次，于30 °C水浴中孵育1小时。最终转座酶浓度 ....

结果

图1 描述了CUT&Tag实验流程。图2 显示了完整细胞核的DAPI染色结果。“细胞核分离”步骤的目标是获得足量完整的细胞核，以用于后续的CUT&Tag反应。图3 显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。在实验设置中，需平行设立IgG阴性对照组。与IgG对照组相比，使用H3K4me3抗体样品拉下的DNA片段主要集中于约280至500个碱基对之间。图4 显示了抗H3K4me3抗体组与IgG阴性对照组相比所获得的下一代测序结果。

讨论

本文中，我们介绍了CUT&Tag技术，该技术通过简化的操作流程，仅需少量细胞即可实现高分辨率、极低背景的DNA文库构建，相较于染色质免疫沉淀（ChIP）具有显著优势。我们在棉花叶片中成功实现了H3K4me3的图谱分析，表明最初为动物细胞设计的CUT&Tag技术同样适用于植物细胞。在植物细胞核中进行CUT&Tag实验时，ChIP实验常用的Tris缓冲体系⁸以及动物CUT&Tag中使用的HEPES缓冲体系均有效^4,9。完整植物细胞核的分离是CUT&Tag在植物中成功应用的关键步骤。在先前报道的细胞核分离方法中⁴，研磨组织的溶液在细胞裂解前需通过两层Miracloth滤布过滤。我们发现，当使用相对较老的叶片（例如两个月大的棉花植株叶片）或棉纤维（例如20-DPA纤维）时，该方法获得足够细胞核的效率降低，原因是Miracloth会截留大部分研磨后的组织。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
Anti-H3K4me3	Millipore	07-473
Normal rabbit IgG	Millipore	12-370
化学试剂
牛血清白蛋白（BSA）			配制10 mg/mL BSA储存液，-20°C保存
皂苷（~50%（TLC））	Sigma-Aldrich	D141	配制5%皂苷储存液（将200 mg皂苷（~50%纯度）溶于2 mL DMSO中）。注意：使用0.22微米滤膜过滤除菌，-20°C保存
二甲基亚砜（DMSO）
氯仿
乙二胺四乙酸（EDTA）			配制0.5 M EDTA（pH = 8.5）储存液。注意：配制100 mL 0.5 M EDTA（pH = 8.5）需约2 g氢氧化钠（NaOH）颗粒调节pH
乙醇
GlycoBlue共沉淀剂（15 mg/mL）	Invitrogen	AM9516
氯化镁（MgCl2）			配制1 M MgCl2储存液
蛋白酶抑制剂混合物	Calbiochem	539133-1SET
氯化钾（KCl）			配制1 M KCl储存液
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v:v:v）
氯化钠（NaCl）			配制5 M NaCl储存液
亚精胺			配制2 M亚精胺储存液，-20°C保存
十二烷基硫酸钠（SDS）			配制10% SDS储存液。注意：勿高压灭菌，使用0.22微米滤膜过滤除菌
Tris碱			配制1 M Tris（pH = 8.0）储存液
Triton X-100			配制20% Triton X-100储存液
酶
CUT&Tag用高活性pG-Tn5/pA-Tn5转座酶	Vazyme	S602/S603	检查与Tn5融合的蛋白A或蛋白G对抗体的亲和力。通常，蛋白A和蛋白G具有广泛的抗体结合能力，但蛋白A对兔源抗体亲和力较高，蛋白G对鼠源抗体亲和力较高。请根据所用抗体选择合适的转座酶产品。
TruePrep扩增酶	Vazyme	TD601
仪器设备
离心机	Eppendorf	5424R
PCR仪	Applied Biosystems	ABI9700
旋转摇床	MIULAB	HS-25
NanoDrop One 分光光度计	Thermo Scientific	ND-ONE-W