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利用靶向切割与标签化技术对植物中H3K4me3修饰进行分析

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DOI：

10.3791/62534

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2022年4月22日

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1College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, 2Central Laboratory, State Key Laboratory for Managing Biotic and Chemical Threats to the Quality and Safety of Agro-products, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, 3State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Cotton Hybrid R & D Engineering Center (the Ministry of Education), College of Agriculture, Nanjing Agricultural University, 4Hainan Institute of Zhejiang University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

靶点切割与标签化（CUT&Tag）是一种高效的染色质表观基因组分析策略。本方案介绍了一种优化的CUT&Tag方法，用于植物中组蛋白修饰的分析。

摘要

染色质水平的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰、转录因子行为以及非编码RNA与其招募蛋白的相互作用，可实现基因表达的时间和空间控制。靶位点切割与标签化（CUT&Tag）是一种染色质蛋白锚定技术，该方法首先通过特异性抗体识别目标染色质蛋白，随后抗体结合蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，由该融合蛋白对目标染色质进行切割 原位 通过镁离子的激活。在此，我们提供我们先前发表的CUT& 使用异源四倍体棉花叶片中分离的完整细胞核进行标签化实验的改良方案。该逐步操作流程可用于植物表观基因组学研究。此外，还提供了针对植物细胞核分离的大量改良步骤及关键性评注。

引言

转录因子结合的DNA位点以及与组蛋白修饰标记相关的开放染色质区域在调控基因表达中发挥关键功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点1。传统上，染色质免疫沉淀实验（ChIP）结合深度测序（ChIP-seq）被广泛用于全基因组范围内特异性组蛋白修饰或特定蛋白质结合DNA靶标的鉴定，是表观遗传学领域广泛应用的技术2。靶位点切割与标签化（Cleavage under targets and tagmentation, CUT&Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获全基因组中与蛋白质结合的DNA片段5。与ChIP相比，CUT&Tag能够在细胞用量较少的情况下，通过更简化的实验流程，生成高分辨率且背景信号极低的DNA文库3。迄今为止，利用CUT&Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法已在动物细胞中建立4,5。特别是单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）技术也已成功应用于人类组织和细胞6。然而，由于植物细胞壁结构复杂且含有多种次生代谢物，CUT&Tag在植物组织中的应用仍面临较大的技术挑战。

此前，我们报道了一种CUT&利用异源四倍体棉花叶片中分离的完整细胞核进行标签化实验方案4为展示利用植物组织进行细胞核分离和DNA捕获的效率，本文呈现了相应的分析流程。主要步骤包括完整细胞核的分离、 原位 染色质修饰抗体孵育、转座酶孵育、接头整合及DNA文库构建。问题排查重点针对CUT&植物细胞核分离及质量控制的标签文库制备

本研究中，我们提出了一种适用于植物的优化 CUT&Tag 技术。我们不仅提供了棉花叶片中 H3K4me3 分析的逐步实验方案，还优化了植物细胞核分离的方法，包括选择合适浓度的去污剂以实现有效细胞裂解的策略，以及过滤细胞核的策略。本更新版方案还包含了带有关键注释的详细操作步骤。

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方案

1. 准备转座酶和储备溶液（第1天）

注意：在此步骤中，寡核苷酸接头与 Tn5 转座酶结合以形成具有活性的转座酶。

  1. 使用退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将引物（引物A、引物B和引物C）稀释至100 µM浓度（引物序列信息参见表1，工作溶液配方参见表2）。保存于-20 °C，待用。
  2. 在PCR管中设置以下两个反应：反应1（接头AB），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物B；反应2（接头AC），10 µL 100 µM 引物A，10 µL 100 µM 引物C。
  3. 在PCR仪中使用以下程序对接头进行退火：加热盖（102 °C），75 °C 15分钟，60 °C 10分钟，50 °C 10分钟，40 °C 10分钟，25 °C 30分钟。
    注：接头为部分双链DNA分子（浓度 = 50 pmol/µL）。
  4. 在1.5 mL离心管中设置以下反应：10 µL pA-Tn5转座酶（500 ng/µL 或 7.5 pmol/µL），0.75 µL 接头AB（50 pmol/µL），0.75 µL 接头AC（50 pmol/µL），7 µL 偶联缓冲液。轻轻吹打混匀20次，于30 °C水浴中孵育1小时。最终转座酶浓度 = 4 pmol/µL。保存于-20 °C，待用。
    ​注：接头AB : 接头AC : 转座酶的摩尔比 = 0.5 : 0.5 : 1。
  5. 根据表2提供的配方配制储备液，并通过高压灭菌或过滤方式对储备液进行灭菌。
  6. 对剪刀、滤纸、不锈钢筛网、研钵、研杵等器具进行高压灭菌和消毒。

2. 细胞核分离（第2天）

  1. 将离心机预冷至 4 °C。每 1 g 起始材料（棉花叶片），准备 25 mL 核分离缓冲液 A（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）、20 mL 核分离缓冲液 B（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）、50 mL 核洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%）和 1 mL 抗体缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，1 mg/mL BSA，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%，0.05% w/v 狄戈辛）。将试管置于冰上备用。
  2. 将新鲜叶片（约 1 g）在液氮中研磨成细粉，并转移至含有 25 mL 预冷核分离缓冲液 A 的 50 mL 离心管中。
  3. 轻轻混匀缓冲液，将离心管置于冰上孵育 5 分钟，并轻轻振荡以使材料均匀分散。
  4. 在 4 °C 下以 500 rcf 离心 5 分钟，形成细胞沉淀。
  5. 倾去上清液，用 20 mL 含 0.5% Triton X-100 的预冷核分离缓冲液 B 重悬沉淀。轻轻倒置离心管，确保沉淀完全重悬。
    注意：20 mL 核分离缓冲液 B 适用于 1 g 起始材料，可根据样品量按比例调整。
    1. 进行预实验，测试不同浓度 Triton X-100 的效果（例如，每 100 mg 研磨组织使用 2 mL 核分离缓冲液 B，分别含 0.1%、0.25%、0.5% 和 1% Triton X-100）。合适的 Triton X-100 浓度表现为裂解后低速离心（< 500 rcf，4 分钟）后底部出现白色/灰色核沉淀，上清液呈深绿色。
  6. 使用两层筛网组合过滤所得细胞裂解液：上层为 500 目筛网，用于去除较大组织碎片；下层为 1000 目筛网，用于收集细胞核。
    注意：应根据植物细胞核的大小选择合适的筛网孔径。
  7. 在筛网背面使用无菌滤纸吸收裂解液中的细小细胞碎片。
  8. 将残留在 1000 目筛网上层的含核裂解液转移至四个新的 1.5 mL 离心管中。
  9. 在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟，收集细胞核。
  10. 用移液器吸头尽可能吸除上清液，并用核洗涤缓冲液洗涤沉淀。
  11. 加入 800 µL 核洗涤缓冲液，轻轻倒置离心管以重悬沉淀。再次在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟。
  12. 共进行 3 次洗涤。
  13. （可选）对细胞核进行 DAPI 染色后在显微镜下观察。
    1. 从步骤 2.11 中取 100 µL 核悬液转移至新的 1.5 mL 离心管中。加入 900 µL 核洗涤缓冲液和 2 µL DAPI 储存液（1 mg/mL），使 DAPI 的终工作浓度为 2 µg/mL。室温避光孵育 30 分钟。
    2. 染色完成后，在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟收集细胞核。
    3. 用移液器吸头尽可能吸除上清液，用 800 µL 核洗涤缓冲液洗涤 3 次。
    4. 尽可能吸除上清液，用 100 µL 核洗涤缓冲液重悬细胞核。
    5. 使用荧光显微镜 DAPI 通道观察细胞核。
  14. 合并两个离心管中的细胞核（每个 1.5 mL 管中核体积约为 50 µL）。在 4 °C 下以 300 rcf 离心 4 分钟。用移液器吸头尽可能吸除残留缓冲液。

3. 抗体孵育

  1. 用1 mL抗体缓冲液在1.5 mL离心管中重悬每份50 µL的细胞核。
  2. 在1.5 mL离心管中设置以下反应：IgG对照组设两个生物学重复，每管加入150 µL细胞核（约含1 µg染色质）和2 µL IgG（1 mg/mL）；H3K4me3检测组设两个生物学重复，每管加入150 µL细胞核和2 µL抗H3K4me3抗体（1 mg/mL）。
  3. 轻轻混匀溶液，并将离心管置于4 °C、12 rpm的水平摇床上过夜杂交。
  4. 将离心机预冷至4 °C。在50 mL离心管中新鲜配制50 mL免疫沉淀（IP）洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05% w/v皂苷），并将该管置于冰上静置。
  5. 在4 °C、300 rcf条件下离心5分钟，弃去每管中的抗体缓冲液。
  6. 向每管中加入800 µL IP洗涤缓冲液，轻轻混匀，然后将离心管置于室温、12 rpm的水平摇床上孵育5分钟。
  7. 洗涤后，在4 °C、300 rcf条件下离心4分钟，用移液器吸头吸除上清液。
    注意：为避免扰动细胞核沉淀，每管中残留约50–80 µL缓冲液。
  8. 重复步骤3.6–3.7两次。
  9. 第三次洗涤后，在4 °C、300 rcf条件下离心2分钟，尽可能彻底去除残留缓冲液。

4. 转座酶孵育

  1. 通过将1 mL IP洗涤缓冲液与30 µL 5 M NaCl混合，新鲜配制1 mL转座酶孵育缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05% w/v皂苷）。
  2. 为准备用于孵育的Tn5转座酶混合液，将1 µL转座酶加入每150 µL转座酶孵育缓冲液中。
    ​注意：首先根据反应数量配制转座酶溶液混合液，然后取150 µL分装至各管中。
  3. 用150 µL转座酶溶液重悬细胞核。
  4. 将各管置于水平摇床上，室温下以12 rpm振荡2–3小时，每10–15分钟混匀一次。
  5. 转座酶孵育结束后，在4 °C下以300 rcf离心4分钟，弃去各管中的转座酶孵育缓冲液。
  6. 用IP洗涤缓冲液洗涤各管：向每管中加入800 µL IP洗涤缓冲液，轻轻混匀后，将各管置于水平摇床上，室温下以12 rpm振荡5分钟。
  7. 在4 °C下以300 rcf离心4分钟，用移液器吸头吸除上清液。
  8. 重复步骤4.6–4.7两次。
  9. 第三次洗涤后，在4 °C下以300 rcf离心2分钟，尽可能彻底去除残留缓冲液。

5. 标签化反应（Tagmentation）

  1. 通过将 2 mL IP 洗涤缓冲液与 60 µL 5 M NaCl 和 20 µL 1 M MgCl2 混合，新鲜配制 2 mL 剪切缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，300 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物 0.1%，10 mM MgCl2，0.05% w/v 狄高辛素）。
  2. 用 300 µL 剪切缓冲液重悬细胞核。
  3. 混匀溶液，并在 37 °C 水浴中孵育 1 小时以进行片段化。
  4. 加入 10 µL 0.5 M EDTA（终浓度约 15 mM）和 30 µL 10% SDS（终浓度 1%），终止片段化反应。

6. DNA 提取与 NGS 文库构建

  1. 加入300 µL CTAB DNA提取缓冲液，具体方法见参考文献7。将离心管置于65 °C水浴中孵育30分钟，每约10分钟颠倒混匀一次。
  2. 向每个离心管中加入600 µL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1），充分混匀。
  3. 将相分离凝胶管在4 °C、13,000 rcf条件下预离心2分钟。将上述溶液转移至相分离凝胶管中。
  4. 在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。
  5. 将上清液（约600 µL）转移至新的1.5 mL离心管中。
  6. 向每个离心管中加入600 µL氯仿，充分混匀。
  7. 在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。
  8. 将上清液（约600 µL）转移至新的1.5 mL离心管中。
  9. 加入12 µL 100%乙醇和2 µL GlycoBlue共沉淀剂，充分混匀后于-20 °C保存1小时。
  10. 在4 °C、13,000 rcf条件下离心10分钟。
  11. 弃去上清液，用75%（v/v）乙醇洗涤DNA沉淀，在4 °C、13,000 rcf条件下离心5分钟。
  12. 弃去上清液，将DNA沉淀空气干燥后溶于25 µL ddH2O中。
  13. 按以下步骤设置PCR反应体系：总体积50 µL，加入24 µL DNA、11 µL ddH2O、10 µL 5x TAE缓冲液、2 µL P5引物（10 µM）、2 µL P7引物（10 µM）和1 µL TruePrep Amplify酶。PCR程序：72 °C延伸3分钟，98 °C变性30秒；随后进行14个循环（98 °C变性30秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸5分钟。
    注意：第一步72 °C延伸3分钟不可省略。文库过度扩增将导致NGS中PCR重复序列比例升高。当每反应使用约1 µg染色质时，H3K4me3的PCR循环数应从12–14个循环开始。
  14. 取2 µL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳。
  15. 使用商品化的DNA纯化磁珠纯化PCR产物。
  16. 使用荧光计和琼脂糖凝胶电泳对文库进行定量。
    注意：通过qPCR测定，文库的有效浓度应>2 nM，以确保测序质量。
  17. 进行高通量测序（NGS）及数据分析。

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结果

图1 描述了CUT&Tag实验流程。图2 显示了完整细胞核的DAPI染色结果。“细胞核分离”步骤的目标是获得足量完整的细胞核，以用于后续的CUT&Tag反应。图3 显示了PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果。在实验设置中，需平行设立IgG阴性对照组。与IgG对照组相比，使用H3K4me3抗体样品拉下的DNA片段主要集中于约280至500个碱基对之间。图4 显示了抗H3K4me3抗体组与IgG阴性对照组相比所获得的下一代测序结果。

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讨论

本文中，我们介绍了CUT&Tag技术，该技术通过简化的操作流程，仅需少量细胞即可实现高分辨率、极低背景的DNA文库构建，相较于染色质免疫沉淀（ChIP）具有显著优势。我们在棉花叶片中成功实现了H3K4me3的图谱分析，表明最初为动物细胞设计的CUT&Tag技术同样适用于植物细胞。在植物细胞核中进行CUT&Tag实验时，ChIP实验常用的Tris缓冲体系8以及动物CUT&Tag中使用的HEPES缓冲体系均有效4,9。完整植物细胞核的分离是CUT&Tag在植物中成功应用的关键步骤。在先前报道的细胞核分离方法中4，研磨组织的溶液在细胞裂解前需通过两层Miracloth滤布过滤。我们发现，当使用相对较老的叶片（例如两个月大的棉花植株叶片）或棉纤维（例如20-DPA纤维）时，该方法获得足够细胞核的效率降低，原因是Miracloth会截留大部分研磨后的组织。在...

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披露

所有作者均与上述提及产品的任何贸易公司无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了以下资助：国家自然科学基金委员会（NSFC，31900395，31971985，31901430）、中央高校基本科研业务费、海南崖州湾种子实验室（JBGS，B21HJ0403）、中国海南省自然科学基金（320LH002）以及 JCIC-MCP 项目。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体
Anti-H3K4me3Millipore07-473
Normal rabbit IgGMillipore12-370
化学试剂
牛血清白蛋白（BSA）配制10 mg/mL BSA储存液，-20°C保存
皂苷（~50%（TLC））Sigma-AldrichD141配制5%皂苷储存液（将200 mg皂苷（~50%纯度）溶于2 mL DMSO中）。注意：使用0.22微米滤膜过滤除菌，-20°C保存
二甲基亚砜（DMSO）
氯仿
乙二胺四乙酸（EDTA）配制0.5 M EDTA（pH = 8.5）储存液。注意：配制100 mL 0.5 M EDTA（pH = 8.5）需约2 g氢氧化钠（NaOH）颗粒调节pH
乙醇
GlycoBlue共沉淀剂（15 mg/mL）InvitrogenAM9516
氯化镁（MgCl2）配制1 M MgCl2储存液
蛋白酶抑制剂混合物Calbiochem539133-1SET
氯化钾（KCl）配制1 M KCl储存液
苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，v:v:v）
氯化钠（NaCl）配制5 M NaCl储存液
亚精胺配制2 M亚精胺储存液，-20°C保存
十二烷基硫酸钠（SDS）配制10% SDS储存液。注意：勿高压灭菌，使用0.22微米滤膜过滤除菌
Tris碱配制1 M Tris（pH = 8.0）储存液
Triton X-100配制20% Triton X-100储存液
酶
CUT&Tag用高活性pG-Tn5/pA-Tn5转座酶VazymeS602/S603检查与Tn5融合的蛋白A或蛋白G对抗体的亲和力。通常，蛋白A和蛋白G具有广泛的抗体结合能力，但蛋白A对兔源抗体亲和力较高，蛋白G对鼠源抗体亲和力较高。请根据所用抗体选择合适的转座酶产品。
TruePrep扩增酶VazymeTD601
仪器设备
离心机Eppendorf5424R
PCR仪Applied BiosystemsABI9700
旋转摇床MIULABHS-25
NanoDrop One 分光光度计Thermo ScientificND-ONE-W

参考文献

  1. Abascal, F., et al. Perspectives on ENCODE. Nature. 583 (7818), 693-698 (2020).
  2. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  3. Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature Communications. 10 (1), 1930(2019).
  4. Tao, X., Feng, S., Zhao, T., Guan, X. Efficient chromatin profiling of H3K4me3 modification in cotton using CUT&Tag. Plant Methods. 16, 120(2020).
  5. Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature Protocols. 15 (10), 3264-3283 (2020).
  6. Bartosovic, M., Kabbe, M., Castelo-Branco, G. Single-cell CUT&Tag profiles histone modifications and transcription factors in complex tissues. Nature Biotechnology. , (2021).
  7. Paterson, A. H., Brubaker, C. L., Wendel, J. F. A rapid method for extraction of cotton (Gossypium spp.) genomic DNA suitable for RFLP or PCR analysis. Plant Molecular Biology Reporter. 11 (2), 122-127 (1993).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3 (1), 11(2007).
  9. Ouyang, W., et al. Rapid and low-input profiling of histone marks in plants using nucleus CUT&Tag. Frontiers in Plant Science. 12, 634679(2021).
  10. Swift, J., Coruzzi, G. M. A matter of time - How transient transcription factor interactions create dynamic gene regulatory networks. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 1860 (1), 75-83 (2017).
  11. Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: a method for assaying chromatin accessibility genome-wide. Current Protocols in Molecular Biology. 109, 21-29 (2015).

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CUT Tag Tn5 DNA

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