在靶标和标记下使用裂解分析植物中的H3K4me3修饰

摘要

靶标下裂解（CUT&Tag）是一种有效的染色质表观基因组分析策略。该协议提出了一种改进的CUT&Tag策略，用于分析植物中的组蛋白修饰。

摘要

染色水平上的表观基因组调控，包括DNA和组蛋白修饰，转录因子的行为以及非编码RNA及其招募的蛋白质，导致基因表达的时间和空间控制。靶标下裂解（CUT&Tag）是一种酶系留方法，其中特异性染色质蛋白首先通过其特异性抗体识别，然后抗体系留蛋白A-转座酶（pA-Tn5）融合蛋白，该蛋白通过镁离子的活化 原位 裂解靶染色质。在这里，我们提供我们之前发表的CUT&Tag方案，使用从异体四倍体棉叶中分离出的完整细胞核进行修饰。这种循序渐进的方案可用于植物的表观基因组学研究。此外，还对植物核分离进行了实质性修改，并提出了批评性意见。

引言

转录因子结合DNA位点和与组蛋白修饰标记相关的开放染色质在调节基因表达方面起着关键的功能作用，是表观遗传学研究的主要焦点¹。传统上，染色质免疫沉淀测定（ChIP）与深度测序（ChIP-seq）相结合已被用于全基因组鉴定特定染色质组蛋白修饰或具有特定蛋白质的DNA靶标，并在表观遗传学领域被广泛采用²。靶标下的切割和标记（CUT&Tag）技术最初由Henikoff实验室开发，用于捕获整个基因组中与蛋白质相关的DNA片段⁵。与 ChIP 相比，CUT&Tagcan 使用少量细胞和简化的程序以高分辨率和极低背景生成 DNA 文库³。迄今为止，已经建立了使用CUT&Tag分析具有特定组蛋白修饰的染色质区域的方法在动物细胞中^4，5。具体而言，单细胞CUT&Tag（scCUT&Tag）也已成功开发用于人体组织和细胞⁶。然而，由于细胞壁和次级代谢物的复杂性，CUT&Tag对植物组织来说在技术上仍然具有挑战性。

此前，我们报道了一种 CUT&Tag 方案，该方案使用从同种异体四倍体棉叶中分离出的完整核⁴。为了证明使用植物组织进行细胞核分离和DNA捕获的效率，本文介绍了分析程序。主要步骤包括完整细胞核分离、与抗体 原位 孵育染色质修饰、转座酶孵育、适配器整合和 DNA 文库制备。故障排除的重点是用于植物核分离和质量控制的CUT&Tag库准备。

在这项研究中，我们提出了一个针对植物的改进的CUT&Tag策略。我们不仅为棉花叶片中的H3K4me3分析提供了分步方案，而且还为植物细胞核分离提供了优化的方法，包括选择洗涤剂浓度以进行适当细胞裂解的策略和过滤细胞核的策略。此更新的协议中还包含带有关键注释的详细步骤。

方案

1. 准备转座酶和储备溶液（第1天）

注意:在这一部分中，寡核苷酸适配器与Tn5转座酶复合以产生活性转座酶。

1. 使用退火缓冲液（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA）将引物（引物A，引物B和引物C）稀释至100μM浓度（引物的顺序信息参见 表 1，工作溶液配方参见 表2 ）。储存在-20°C直至使用。
2. 在PCR管中设置以下两个反应:反应1（适配器AB），10μL100μM引物A，10μL100μM引物B;反应2（适配器AC），10 μL 100 μM引物A，10 μL 100 μM引物C。
3. 使用以下程序在PCR机器中退火适配器:加热盖子（102°C），75°C加热15分钟，60°C加热10分钟，50°C加热10分钟，40°C加热10分钟，25°C加热30分钟。
   注意:适配器部分是双链DNA分子（浓度= 50 pmol / μL）。
4. 在1.5 mL离心管中设置以下反应:10μLpA-Tn5转座酶（500ng / μL或7.5 pmol / μL），0.75μL适配器AB（50 pmol / μL），0.75μL适配器AC（50 pmol / μL），7μL偶联缓冲液。轻轻移取20倍以充分混合，并在30°C的水浴中孵育1小时。转座酶的最终浓度= 4 pmol / μL.储存在-20°C直至使用。
   注:适配器的摩尔比AB:适配器AC:转座酶=0.5:0.5:1。
5. 根据 表2 中提供的配方准备储备溶液，并高压灭菌或过滤储备溶液以进行灭菌。
6. 高压灭菌器和消毒剪刀，滤纸，不锈钢筛，研钵，杵等。

2. 细胞核分离（第2天）

1. 将离心机预冷至4°C。 对于每1克起始材料（棉花叶），准备25毫升核分离缓冲液A（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA），20 mL核分离缓冲液B（10 mM Tris pH 8.0，50 mM NaCl，1 mM EDTA），50 mL核洗涤缓冲液（10 mM Tris pH 8.0， 150 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%），1 mL抗体缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，1 mM EDTA，150 mM NaCl，0.5 mM亚精胺，1 mg / mL BSA，蛋白酶抑制剂鸡尾酒0.1%，0.05%w / v地黄素）。让管子放在冰上直到使用。
2. 在液氮中将新鲜叶子（〜1克）研磨成细粉，然后转移到含有25 mL冷冻核分离缓冲液A的50 mL管中。
3. 轻轻混合缓冲溶液，并将管在冰上孵育5分钟，轻轻摇动以均匀分散材料。
4. 在4°C下在500 rcf下离心5分钟以形成细胞沉淀。
5. 倾析上清液并用20mL冷却核分离缓冲液B重悬沉淀，并补充0.5%Triton X-100。轻轻翻转管以完全重悬沉沉淀。
   注:20 mL核隔离缓冲液B适用于1g起始材料，该体积可相应地缩放。
   1. 进行先导测定以测试Triton X-100串联浓度的影响（例如，2 mL核分离缓冲液B，每个具有0.1%，0.25%，0.5%和1%Triton X-100用于100mg研磨组织）。Triton X-100的适当浓度通过底部白色/灰色核的积累和低速（<500 rcf 4分钟）裂解和离心后深绿色的上清液来表示。
6. 用两个筛子的组合过滤得到的细胞裂解物:顶部的500目筛子以除去较大的组织碎片，底部的1000目筛子以收集细胞核。
   注意:根据植物的细胞核大小，为筛子选择合适的网孔尺寸。
7. 在筛子的背面使用无菌滤纸，以吸收裂解物中的小细胞碎片。
8. 将1000目筛顶侧含有裂解物的剩余原子核转移到四个新鲜的1.5mL离心管中。
9. 在4°C下在300 rcf下离心4分钟以收集细胞核。
10. 使用移液器吸头尽可能多地除去上清液，并用核洗涤缓冲液洗涤沉淀。
11. 加入800μL核洗涤缓冲液并轻轻倒置管以重悬沉淀。在4°C下以300 rcf再次旋转管4分钟。
12. 总共进行3次洗涤。
13. （可选）在显微镜下对细胞核进行成像以进行DAPI染色。
    1. 从步骤2.11开始，在核洗涤缓冲液中转移100μL核悬浮液。到一个新的1.5 mL管。加入900μL核洗涤缓冲液和2μLDAPI储备溶液（1mg / mL），使DAPI的最终工作浓度为2μg/ mL。在室温下将管在黑暗中孵育30分钟。
    2. 染色后，在4°C下在300 rcf下离心4分钟以收集细胞核。
    3. 使用移液器吸头尽可能多地去除上清液。用800μL核洗涤缓冲液洗涤3次。
    4. 尽可能多地除去上清液，并用100μL核洗涤缓冲液重悬细胞核。
    5. 使用DAPI通道在荧光显微镜下对细胞核进行成像。
14. 将来自两个管的细胞核（每个1.5mL管中体积约50μL的细胞核）混合。在4°C下在300 rcf下离心4分钟。 使用移液器吸头尽可能多地去除剩余的缓冲液。

3. 抗体孵育

1. 将每个50μL细胞核重悬于1.5mL管中，并加入1mL抗体缓冲液。
2. 在1.5mL管中设置以下反应:每个管中具有150μL细胞核（〜1μg染色质）和2μLIgG（1mg / mL）的IgG对照组的两个生物重复，每个管中具有150μL细胞核和2μL抗H3K4me3抗体（1mg / mL）的H3K4me3测定组的两个生物学重复。
3. 轻轻混合溶液，并将管留在水平振荡器上，在4°C和12rpm下杂交过夜。
4. 将离心机预冷至4°C。 在50 mL离心管中制备新鲜的50mL免疫沉淀（IP）洗涤缓冲液（10mM Tris pH 8.0，150mM NaCl，0.5mM精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05%w / v地黄素）。让管子放在冰上。
5. 在4°C下以300 rcf离心管4分钟。 从每个试管中取出抗体缓冲液。
6. 向每管中加入800μLIP洗涤缓冲液并轻轻混合。将试管放在卧式振荡器上，在室温和12rpm下放置5分钟。
7. 洗涤后，在4°C下以300 rcf离心管4分钟。 使用移液器吸头除去上清液。
   注意:为避免对细胞核沉淀的任何干扰，请与细胞核一起留下〜50-80μL缓冲液。
8. 重复步骤 3.6.-3.7。再来两次。
9. 第三次洗涤后，在4°C下以300 rcf离心2分钟。 尽可能删除剩余的缓冲区。

4. 转座酶孵育

1. 通过将1 mL的IP洗涤缓冲液与30μL5M NaCl混合，制作新鲜的1mL转座酶培养缓冲液（10mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，0.5mM亚精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，0.05%w / v地黄素）。
2. 为了制备用于孵育的Tn5转座酶混合物，将1μL转座酶加入到每150μL转座酶培养缓冲液中。
   注意:首先根据反应次数制备转座酶溶液混合物，然后向每个试管中加入150μL等分试样。
3. 用150μL转座酶溶液重悬细胞核。
4. 将试管放在卧式振荡器上，在室温下以12rpm的速度放置2-3小时，每10-15分钟混合一次。
5. 转座酶孵育后，在4°C下以300 rcf离心管4分钟。 除去每个试管中的转座酶孵育缓冲液。
6. 用IP清洗缓冲液清洗试管。为此，向每个试管中加入800μLIP洗涤缓冲液，轻轻混合，并将试管在室温下以12rpm的水平振荡器放置5分钟。
7. 在4°C下在300 rcf下离心4分钟。 使用移液器吸头除去上清液。
8. 重复步骤 4.6.-4.7。再来两次。
9. 第三次洗涤后，在4°C下以300 rcf离心2分钟。 尽可能删除剩余的缓冲区。

5. 标签

1. 通过将2 mL IP洗涤缓冲液与60μL5 M NaCl和20μL1 M _MgCl2混合，新鲜制作2mM标签缓冲液（10mM Tris pH 8.0，300mM NaCl，0.5mM精胺，蛋白酶抑制剂混合物0.1%，10mM _MgCl2，0.05%w / v洋地黄素）。
2. 用300μL标记缓冲液重悬细胞核。
3. 混合溶液并在37°C水浴中孵育1小时以进行标记。
4. 用10μL0.5 M EDTA（终浓度〜15mM）和30μL10%SDS（终浓度1%）停止标记。

6. DNA提取和NGS文库构建

1. 加入300μLCTAB DNA提取缓冲液，如上所述⁷。将管子在65°C水浴中孵育30分钟。反转以每~10分钟混合一次。
2. 向每个管中加入600μL苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）。彻底混合。
3. 在4°C下以13，000 rcf预离心相锁凝胶管2分钟。 将上述溶液转移到锁相凝胶管中。
4. 在4°C下在13，000 rcf下离心10分钟。
5. 将上清液（〜600μL）转移到新的1.5mL管中。
6. 向每个试管中加入600μL氯仿。彻底混合。
7. 在4°C下在13，000 rcf下离心10分钟。
8. 将上清液（〜600μL）转移到新的1.5ml管中。
9. 加入12μL100%乙醇和2μL糖蓝共沉淀剂。充分混合并在-20°C下储存1小时。
10. 在4°C下在13，000 rcf下离心10分钟。
11. 倾析上清液。使用75%（v / v）乙醇洗涤DNA沉淀，并在4°C下以13，000 rcf离心5分钟。
12. 倾析上清液。风干DNA沉淀，并将DNA重悬于25μL的ddH ₂ O中。
13. 按如下方式设置 PCR 反应。对于总共50μL的反应，加入24μL DNA，11μLdH2O，10μL5x TAE缓冲液，2μLP5引物（10μM），2μLP7引物（10μM）和1μLTruePrep扩增酶。PCR程序:72°C持续3分钟，98°C持续30秒;然后在98°C下循环14次30秒，60°C持续30秒，72°C持续30秒，然后在72°C下循环5分钟。
    注意:不能跳过前72° C延长3 分钟。文库的过度放大将导致NGS中PCR重复性水平高。在每次反应中使用~1μg染色质时，在H3K4me3的PCR反应中从12-14个PCR循环开始。
14. 将2μLPCR产物加载到1.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。
15. 使用商业DNA纯化磁珠纯化PCR产物。
16. 用荧光计和琼脂糖凝胶电泳定量文库。
    注:qPCR应>2 nM库的有效浓度，以确保良好的质量。
17. 执行下一代测序 （NGS） 和数据分析。

结果

图 1 描述了 CUT&Tag 工作流程。 图2 显示了完整细胞核的DAPI染色。"原子核分离"步骤的目标是获得足够量的完整原子核，以进行随后的CUT&Tag反应。 图3 显示了琼脂糖凝胶对PCR产物的电泳。设置实验时需要并行IgG阴性对照。与IgG对照组相比，用H3K4me3抗体样品提取的大部分DNA片段范围为约280至500个碱基对。 图4 显示了与IgG阴性对照组相比，抗H3K4me3抗体的下一代测序结果。

图 1...

讨论

在这里，我们描述了CUT&Tag，这是一种以高分辨率和极低背景生成DNA文库的技术，与染色质免疫沉淀（ChIP）相比，使用少量细胞，程序简化。我们在棉花叶片中成功分析H3K4me3表明，CUT&Tag最初是为动物细胞设计的，也可以用于植物细胞。通常用于ChIP测定⁸ 的Tris缓冲系统和用于动物CUT&Tag的HEPES缓冲系统都适用于使用植物核的CUT&^Tag4，9。完整植物核的分离是CUT&Tag在植物中成功应用的关键步骤。在先前报道的细胞核分离方法⁴中，研磨组织的溶液在细胞裂解前通过两层Miracloth过滤。我们发现，当使用相对老化的叶子（例如，来自2个月大的棉花植物的叶子）和棉纤维（例如，20-DPA纤维）时，获得足够细胞核的效率降低，因为Miracloth保留了大部分研磨的组织。在该视频实验方案中，通过500目（孔径为20μM）不锈钢筛过滤细胞裂解物，优化了植物核分离。这种改变的操作显着提高了去除较大组织碎片和获得...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体
抗 H3K4me3	Millipore	07-473
正常兔 IgG	Millipore	12-370
化学品
牛血清白蛋白 （BSA）			制备 10 mg/ml BSA 储备液。储存在 -20°C;C
洋地黄皂苷（~50% （TLC）	Sigma-Aldrich	D141	制备 5% 洋地黄皂苷原液（200 mg 洋地黄皂苷 [~50% 纯度] 至 2 mL DMSO）。注意：使用 0.22 微米过滤器进行消毒。储存在 -20°C;C
二甲基亚砜 （DMSO）
氯仿
乙二胺四乙酸 （EDTA）			制备 0.5 M EDTA （pH = 8.5） 储备液。注意：制备 100 mL 的 0.5-M EDTA（pH = 8.5）需要大约 2 g 氢氧化钠 （NaOH） 沉淀来调节 pH
乙醇
GlycoBlue 共沉淀剂 （15 mg/mL）	Invitrogen	AM9516
氯化镁 （MgCl2）			制备 1 M MgCl2 储备液
蛋白酶抑制剂混合物	Calbiochem	539133-1SET
氯化钾 （KCl）			制备 1 M KCl 储备溶液
苯酚：氯仿：异戊醇 （25：24：1，v：v：v）
氯化钠 （NaCl）			制备 5 M NaCl 储备溶液
亚精胺			制备 2 M 亚精胺储备液，储存在 -20°C。
十二烷基硫酸钠 （SDS）			制备 10% SDS 储备液。注意：不要高压灭菌;使用 0.22 微米过滤器消毒
Tris 碱			制备 1 M Tris （pH = 8.0） 储备溶液
Triton X-100			制备 20% Triton X-100 储备溶液
Enzyme
高活性 pG-Tn5/pA-Tn5 转座酶用于 CUT&标签	Vazyme	S602/S603	检查与 Tn5 融合的蛋白 A 或蛋白 G 的抗体亲和力。一般来说，蛋白 A 和 G 具有广泛的抗体亲和力。然而，蛋白 A 对兔抗体的亲和力相对较高，而蛋白 G 对小鼠抗体的亲和力相对较高。选择与您的抗体相匹配的合适转座酶产品。
TruePrep 扩增酶	Vazyme	TD601
设备
离心机	Eppendorf	5424R
PCR 机	Applied Biosystems	ABI9700
轨道摇床	MIULAB	HS-25
NanoDrop One  分光光度计	Thermo Scientific	ND-ONE-W