Haemophilus influenzae 可诱导呼吸道炎症。本文将重点介绍如何利用流式细胞术和共聚焦显微镜来界定吞噬细胞和淋巴细胞对该细菌的免疫应答。
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本文内容
摘要
摘要
Haemophilus influenzae（Hi）是一种常见于多种呼吸系统疾病中的细菌。可采用多种不同的检测方法或技术来评估呼吸道对该细菌的免疫和炎症反应。流式细胞术和共聚焦显微镜是基于荧光的技术，能够对生物学反应进行详细表征。 可用于实验的Hi抗原形式多样，包括细胞壁组分、灭活或失活的菌体制剂以及活菌。Hi是一种营养要求较高的细菌，需要富集培养基，但在标准实验室条件下通常易于培养。用于Hi刺激的组织样本可来源于外周血、支气管镜检查或切除的肺组织（例如接受肺癌手术治疗的患者）。利用流式细胞术可全面评估巨噬细胞和中性粒细胞的功能，检测参数包括吞噬作用、活性氧物质生成以及细胞内细胞因子的产生。淋巴细胞功能（如T细胞和NK细胞功能）也可通过流式细胞术进行特异性评估，主要检测其细胞内细胞因子的产生情况。Hi感染可强烈诱导中性粒细胞（NETs）和巨噬细胞（METs）产生胞外诱捕网。共聚焦显微镜被认为是评估NET和MET表达的最理想方法，也可用于检测蛋白酶活性。针对Haemophilus influenzae的肺部免疫反应可通过流式细胞术和共聚焦显微镜进行评估。
引言
Haemophilus influenzae（流感嗜血杆菌，Hi）是一种常见的共生细菌，存在于大多数健康成年人的咽部。Hi 可能具有多糖荚膜（分为 A-F 型，例如 B 型或 HiB），也可能无荚膜，称为非分型流感嗜血杆菌（NTHi）1。该细菌在黏膜上的定植始于儿童早期，并且定植的菌株会不断更替2。此细菌还能够侵入上、下呼吸道；在此过程中，可能引发免疫反应的激活和炎症反应3,4。这种炎症反应可导致临床疾病，并参与多种重要呼吸道疾病的发生，包括鼻窦炎、中耳炎、支气管炎、囊性纤维化、肺炎和慢性阻塞性肺疾病（COPD）。其中大多数疾病由 NTHi 菌株引起2。本文将介绍利用流式细胞术和共聚焦显微镜评估呼吸道对 Hi 免疫反应的方法。
以下所述方法改编自已建立的成熟技术，并经过修改以评估对Hi的炎症反应。选择适当的Hi抗原形式是该评估的关键部分。抗原制备物的范围可从细胞壁组分到活细菌。为了建立并标准化检测方法，最初使用外周血样本可能非常有帮助。
流式细胞术能够从单个样本中在细胞水平上测量多种参数和进行功能检测。与酶联免疫吸附试验（ELISA）或ELISp....
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方案
本研究已获得莫纳什医疗人类研究伦理委员会的批准。本方案遵循人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 抗原制备
注意：可使用三种不同的抗原制剂来评估针对流感嗜血杆菌（Hi）的免疫反应。这些制剂分别为：1）亚细胞组分（通常来自细菌细胞壁）；2）灭活的死菌；3）活菌。在开始任何实验之前，需确定每种抗原制剂的用途。
- 亚细胞组分
- 从各种来源获取亚细胞组分，包括商业制备物、自行研发的组分和/或来自其他研究人员的材料。
注意：通常可使用来源于细菌细胞壁的亚细胞组分，包括外膜蛋白（如P6）和脂寡糖（LOS）11,12。这些亚细胞组分通常由专业中心制备，其具体制备方法不在本文讨论范围内。建议直接联系该领域的专家以获取这些组分。
- 从各种来源获取亚细胞组分，包括商业制备物、自行研发的组分和/或来自其他研究人员的材料。
- 灭活/杀死的细菌
- 从适当的样本（例如痰液或支气管镜样本）中获取细菌。通过适当的微生物学实验室确认菌株为H. influenzae。对H. influenzae样本进行分型，确认其为无荚膜型（由专业的微生物学实验室完成）。
- 为获得具有代表性的抗原，使用多种NTHi菌株（至少5种，每种数量大致相等）制备....
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结果
代表性结果展示了如何通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估/定量NTHi诱导的炎症免疫反应。结果解读的关键在于比较对照样本与刺激样本之间的荧光强度差异。通常需要进行多次预实验以优化样本染色条件。可同时检测的不同荧光颜色数量取决于流式细胞仪/共聚焦显微镜所配备的通道数目。本文展示了以下三项检测的结果：1）活性氧（ROS）的产生；2）人肺组织中细胞内细胞因子的染色；3）原位酶谱法（in situ zymography）检测肺组织蛋白水解活性。
图1展示了单核细胞产生活性氧（ROS）的示意图。ROS的检测基于DHR123被氧化后产生荧光的原理。通过流式细胞术对细胞进行设门，并测定其中位荧光强度。将刺激样本的中位荧光强度与对照样本进行比较。
图2展示了来源于人肺组织的淋巴细胞胞内细胞因子的产生情况。在进行流式细胞术检测以评估炎症介质（例如淋巴细胞产生的细胞因子）的产生之前，需要将肺组织分解为单细胞悬液。肺.......
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讨论
此处列出的方法采用基于荧光的流式细胞术和共聚焦显微镜技术，可结合使用以获得关于流感嗜血杆菌（Hi）引起的肺部炎症反应的详细信息。
确定用于实验的流感嗜血杆菌（Hi）抗原制剂的适当配方至关重要，建议在此过程中咨询微生物学家的专业意见。活体Hi可诱导更强的免疫反应，而灭活的Hi制剂及其组分则更具标准化，且更易于储存。PI仅能标记死亡细菌。22；其他染料如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）也可用于标记活细菌，以进行吞噬作用检测23应进行一系列预实验以优化合适的抗原。使用活的非典型流感嗜血杆菌（NTHi）时，最佳感染复数（MOI）为100:1；MOI过低可能无法诱导明显的免疫反应，而MOI过高则可能对细胞产生毒性。然而，绘制剂量-反应曲线可提供有用信息，尤其在技术初始优化阶段具有重要价值。24作为阳性对照，采用 commercially 获得的灭活形式 金黄色葡萄球菌 抗原也可用于实验，并如上所述用PI标记，以进行ROS/吞噬作用.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者谨此感谢莫纳什医疗中心临床免疫科工作人员在本研究工作中提供的协助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化铵 | Sigma Aldrich | 213330 | |
| 布雷菲德菌素 | Sigma Aldrich | B6542 | |
| CD28 | Thermofisher | 16-0289-81 | |
| CD49d | Thermofisher | 534048 | |
| DAPI prolong gold | Thermofisher | P36931 | |
| DHR123 | Sigma Aldrich | 109244-58-8 | |
| 无菌尼龙滤膜（Filcon） | Becton Dickinson | 340606 | |
| 明胶底物（Enzchek） | Molecular probes | E12055 | |
| MACS 混合管旋转仪 | Miltenyi Biotec | 130-090-753 | |
| Medimachine | Becton Dickinson | 目录编号不可用 | |
| Medicons 50 µm | Becton Dickinson | 340592 | |
| Pansorbin | Sigma Aldrich | 507858 | |
| 碘化丙啶 | Sigma Aldrich | P4170 | |
| 皂苷 | Sigma Aldrich | 8047152 | |
| Superfrost 载玻片 | Thermofisher | 11562203 |
参考文献
- Smith-Vaughan, H. C., Sriprakash, K. S., Leach, A. J., Mathews, J. D., Kemp, D. J. Low genetic diversity of Haemophilus influenzae type b compared to nonencapsulated H. influenzae in a population in which H. influenzae is highly endemic. Infection and Immunity. 66, 3403-3409 (1998).
- Murphy, T. F. Haemophilus and Moxarella infections.
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