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利用D11 scFv-碱性磷酸酶融合蛋白和免疫荧光法直接检测组织中的异构左旋前列腺素

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DOI：

10.3791/62603

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2021年7月5日

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1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Department of Biochemistry, Vanderbilt University, 4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine, 6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

本文内容

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摘要

本文详细介绍了一种利用碱性磷酸酶偶联的ScFv D11抗体通过免疫荧光法检测组织中异左旋-γ-酮戊二酸（isolevuglandins）的详细方法。通过小鼠和人类的高血压模型，阐述了组织样本中异左旋-γ-酮戊二酸检测的逐步操作流程及相关基本原理。

摘要

异乐果醛（Isolevuglandins, IsoLGs）是一类由H2-异前列腺素经脂质过氧化生成的高活性γ-酮醛化合物，可交联蛋白质，导致炎症及包括高血压在内的多种疾病。检测组织中IsoLGs的积聚对于揭示其在疾病发生过程中的作用至关重要。然而，组织中IsoLGs的测定极为困难，目前可用的方法（包括质谱分析）均存在操作繁琐且成本高昂的问题。本文描述了一种新型方法 原位 使用碱性磷酸酶偶联的D11 ScFv及在重组噬菌体展示系统中产生的抗体检测组织中的异构前列腺素 E. coli 通过免疫荧光显微镜检测。为验证染色特异性，设置了四种对照：（1）使用与不使用D11的染色对照，（2）使用细菌周质提取物与碱性磷酸酶连接物进行染色，（3）无关scFv抗体染色，（4）染色前用IsoLG进行竞争性阻断对照。我们证实了碱性磷酸酶偶联的D11在伴或不伴高血压的人类及小鼠组织中均具有良好的检测效果。该方法有望成为研究IsoLGs在多种疾病过程中作用的重要工具。

引言

异左旋葡糖醛酸（Isolevuglandins，简称IsoLGs），也称为异酮醛（isoketals），是4-酮醛类化合物的同分异构体，由脂质过氧化反应产生，可与蛋白质上的伯胺发生反应并形成加合物1,2。研究表明，IsoLGs参与多种疾病的发生发展，包括心血管疾病、阿尔茨海默病、肺部和肝脏疾病以及多种癌症3。其中，IsoLGs在心血管疾病（CVD）中的作用研究最为广泛。心血管疾病是全球范围内重要的健康和经济负担，美国亦不例外。据估计，目前有9210万美国成年人至少患有一种类型的心血管疾病，到2030年，预计该比例将上升至美国成年人口的43.9%4。降低血压、控制胆固醇水平以及戒烟可有效降低心血管疾病事件的总体风险和发生率5。

高血压是心血管疾病的主要危险因素，影响约一半的美国人口6。先前的研究发现，炎症是高血压的潜在病因，异构前列腺素（IsoLGs）在其中发挥一定作用7。包括血管紧张素II、儿茶酚胺、醛固酮以及过量膳食盐在内的高血压刺激因素，可诱导抗原呈递细胞（如树突状细胞，DCs）中IsoLG的积聚，进而激活T细胞增殖并产生促炎性细胞因子，从而促进高血压的发生发展8,9。

此前，异前列腺素（IsoLGs）的检测方法包括免疫组织化学、质谱分析、酶联免疫吸附试验和流式细胞术10,11。为了便于检测IsoLGs，已开发出一种针对IsoLGs的单链可变区片段（scFv）重组抗体（D11）12。最初，该D11抗体包含一个11个氨基酸的E-tag，免疫组织化学检测时需使用二抗11。然而，由于生产商已停止供应E-tag，难以获得可靠的抗E-tag二抗。因此，我们建立了一种使用碱性磷酸酶标记的D11抗体（D11-AP）进行IsoLGs免疫荧光染色的可靠方案，并已在伴有或不伴有高血压的小鼠和人类组织中验证了该方法的有效性。

方案

范德堡大学机构动物护理和使用委员会批准了本手稿中描述的所有操作程序。小鼠的饲养和护理均遵循《实验动物护理和使用指南》。所有受试者在参与研究前均按照范德堡大学机构审查委员会的批准要求签署了书面知情同意书。所有操作程序均依照《赫尔辛基宣言》进行。

1. 编码D11-碱性磷酸酶融合蛋白及阴性对照载体的质粒制备

  1. 构建pCANTAB5E质粒的修饰版本13,14 其中单链可变区片段（scFv）在其3'端连接至编码细菌碱性磷酸酶（AP）的序列。
    注意：在scFv序列的NotI限制性酶切位点下游紧接的位置，该修饰质粒不再含有E-tag的编码序列，而是编码接头序列GGSGGHMGSGG，随后为碱性磷酸酶（AP）的序列（GenBank登录号AXY87039.1，T16-K464）15,16在AP下游，质粒编码8xHis和DYKDDDDK标签。在标签的3'端，编码序列以Amber终止密码子结束。该修饰后的质粒称为pCANTAB5-AP。
  2. 将 D11 scFv（GenBank 登录号 AAW28931.1）克隆至 pCANTAB5-AP 载体的 SfiI/NotI 限制性酶切位点中。
  3. 使用 SfiI/NotI 限制性酶切位点将 D20 scFv 克隆至 pCANTAB5-AP 载体中。
    注意：D20 scFv 是一种阴性对照，用于评估无关 scFv 的组织结合模式。该 scFv 最初通过噬菌体展示技术筛选获得，因其能够与一种称为 A2 的糖类结构发生相互作用。
  4. 生成一个 "空" 通过完全移除质粒中的scFv片段并替换为 "AP接头" 由氨基酸GGGGSGRAGSGGGGS组成的编码序列。
  5. 将所有质粒转化至感受态TG1细胞中 E. coli 在含有100 µg/mL氨苄青霉素和2%葡萄糖的2xYT培养基（2xYTAG）中，于30 °C在0.5%琼脂平板上过夜培养细菌。
    注意：含有 supE 基因的菌株（如 TG1） E. coli）不能100%抑制琥珀终止密码子。据估计，抑制效率在0.8%至20%之间，因此仍有大量产物在BAP下游正常终止，这正是这些实验所预期的结果。17. TG1 E. coli 主要出于实际原因，例如减少时间和成本、与pCANTAB蛋白表达系统的兼容性，以及在实验室中常用于噬菌体展示。在BAP之后的琥珀终止密码子下游是geneIII的序列。在噬菌体展示中，geneIII融合蛋白通常只需极低水平的表达即可实现预期功能，因为scFv-geneIII融合蛋白会干扰特定的geneIII蛋白，从而影响其重新感染幼稚细菌的能力。因此，在病毒颗粒组装过程中必须存在无融合的geneIII蛋白，才能产生具有功能的噬菌体，即细菌内部的scFv-geneIII蛋白产物通常相对稀少。D11-AP、D20-AP、空载体以及本文所使用的所有构建体均会受到偶发性geneIII融合蛋白表达的类似影响。然而，这些蛋白在行为上仍表现出可观测的差异。
  6. 挑选单菌落，接种于5 mL新鲜的2xYTAG培养基中，30 °C、150 rpm振荡培养过夜。
  7. 通过离心在 3,000 x g 下沉淀细胞 g 室温孵育10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于2 mL含85% 2xYTAG和15%甘油的溶液中。
  8. 将甘油菌种保存于 -80 °C 冰箱中。

2. 蛋白质表达与周质提取物的制备

注意：制备周质提取物是噬菌体展示中蛋白表达的常用方法，主要因为二硫键的形成对scFv和抗体的生成至关重要。该方法避免了包涵体（常存在于裂解液中）的产生，并确保蛋白正确折叠。pCANTAB载体在D11-BAP融合蛋白的scFv区域上游含有gIII信号序列。该信号序列可确保蛋白被转运至细菌的周质空间，随后信号序列被切除。周质空间提供氧化性环境，这对于二硫键的正确形成至关重要。采用渗透休克法获取周质提取物，因其可充分破坏外膜，使周质蛋白释放到周围培养基中，同时保持细菌细胞的完整性。

  1. 将含有相关质粒的 TG1 E. coli 甘油菌种接种于 60 mL 的 2xYTAG 培养基中，在 30 °C、150 rpm 振荡条件下过夜培养。
  2. 为诱导蛋白表达，于 3,000 × g 离心 10 分钟收集菌体，重悬于 60 mL 的 2xYTA 培养基中，并在 30 °C、150 rpm 振荡条件下过夜培养。
    注：从 2xYTAG 培养基转换为 2xYTA 培养基有助于充分诱导蛋白表达18。当细菌培养基中含有葡萄糖时，由于细菌优先利用葡萄糖（因其代谢所需能量较少），乳糖操纵子（lac promoter）受到抑制。在更换培养基去除葡萄糖后，细菌依赖 2xYT 培养基提供的碳源进行生长。酵母提取物（2xYT 中的 Y 组分）含有多种碳水化合物，其中包括乳糖，因此可激活 lac 启动子驱动目标蛋白的表达。使用 pCANTAB 载体时无需添加 IPTG，否则可能导致蛋白过度表达，形成包涵体，从而产生无功能的蛋白。
  3. 通过渗透休克法提取周质蛋白。
    1. 于 3,000 × g 离心 10 分钟收集菌体。
    2. 重悬于 20 mL 的 1×TES 缓冲液（0.2 M Tris-HCl pH 8.0，0.5 mM EDTA，0.5 M 蔗糖）中，冰上孵育 1 小时。
    3. 再次于 3,000 × g 离心 10 分钟，重悬于 15 mL 的 0.05 M Tris 缓冲液（pH 7.6）中。
  4. 将此悬浮液冰上孵育 1 小时，随后于 5,000 × g 离心 10 分钟以澄清裂解物。
  5. 将上清液转移至新离心管中，于 -20 °C 保存，待后续纯化或直接用于实验时取用。
  6. 通过 ELISA 检测 D11-BAP 酶活性以评估细胞裂解效果。取 3–5 µL 周质提取物加入 1 mL 的 pNPP 底物溶液中，观察接下来 10 分钟内是否发生颜色变化（由无色-淡黄变为深黄色）。
    ​注：可通过与未加任何裂解液的 pNPP 管或加入 naïve TG1 菌体裂解液的 pNPP 管进行平行比色。可用 405 nm 波长处的吸光度值进行定量分析。

4. ELISA 法测定 D11-AP 滴度

  1. 在4 °C下，用25 µL/孔的磷酸盐缓冲液（PBS）（1.8 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, 2.7 mM KCl, 137 mM NaCl, pH 7.4）包被一块384孔聚苯乙烯板，过夜2PO4，10 mM Na2HPO4，2.7 mM KCl，137 mM NaCl）溶液，其中含有5 µg/mL小鼠血清白蛋白（MSA）（阴性对照）或5 µg/mL异构亮氨酸/小鼠血清白蛋白（IsoLG/MSA）（阳性对照）。
  2. 弃去孔内液体，轻拍至干燥。用含0.1%吐温的磷酸盐缓冲液（PBS-T）洗涤一次。弃去孔内液体，轻拍至干燥。
  3. 用 PBS-T 作为封闭液加入孔板（每孔 120 µL），室温孵育 1 小时。
  4. 弃去孔内液体并轻拍干燥。每孔加入25 µL用PBS-T稀释的D11-AP周质提取物，进行1:2系列稀释。设一孔仅含PBS-T作为阴性对照。
    注意：周质提取物的典型稀释范围为 1:8 - 1:4096。对于 25 µL 的检测体系，起始建议使用 50 µL 原始样品 "1:8" 浓度：6.25 µL 周质提取物和 43.75 µL PBS-T。然后，取出 25 µL 该溶液，加入到下一个含有 25 µL PBS-T 的孔中，并用移液器吹打混匀，进行 2 倍稀释。此时该孔中的溶液含有 "1:16" 稀释。重复进行2倍稀释，以制备所述的1:2稀释系列。
  5. 室温孵育1.5小时。
  6. 弃去孔内液体，轻拍至干燥。用 PBS-T 缓冲液洗涤 5 次。弃去液体，轻拍至干燥。
  7. 将1 g pNPP溶于1 L 930 mM二乙醇胺溶液中（用98%贮存液按1:10比例稀释于H₂O中）制备pNPP溶液2O)，含 0.5 mM MgCl2 用 HCl 调节至 pH 9.5。
  8. 每孔加入25 µL pNPP溶液以显色碱性磷酸酶（AP）。室温孵育1小时，使用适配的酶标仪测定各孔在405 nm处的吸光度。
  9. 将IsoLG/MSA孔产生的信号与MSA孔产生的噪声进行比较，确定信号至少比噪声高5倍的稀释倍数范围。
  10. 将该D11-AP信号稀释系列绘制成图，确定曲线的线性范围，并建立可观察到50%信号的稀释比例。
    ​注意：如果该稀释比例相当于约1:1,000，则D11-AP溶液可用于免疫组化/免疫荧光实验，浓度为1:10。

5. 免疫荧光

  1. 使用切片机切割小鼠和人源石蜡包埋组织的连续切片（厚度为 5 µm），并将切片置于温水浴（37 °C）中。将组织切片贴附于载玻片上，室温下干燥过夜。
    注：本研究中主动脉组织来源于小鼠。正常血压和高血压患者的结肠组织切片来自范德堡合作人类组织网络（Vanderbilt Cooperative Human Tissue Network）。
  2. 将载玻片浸入二甲苯中，每次 5 分钟，共三次，以脱去组织中的石蜡。
  3. 依次用 H2O 配制的 95%、70% 和 50% 乙醇各洗涤两次，对组织进行再水化。
  4. 用含 0.1% Tween20 的 Tris 缓冲盐水（TBS）洗涤载玻片三次，每次快速冲洗：将 TBST 加入玻片架中，充分浸没玻片后弃去 TBST。
    注：再水化后的玻片可在 4 °C 的 TBST 中保存，但不得超过一周，之后需进行抗原修复。
  5. 为进行热诱导抗原修复，将玻片放入预热（80–95 °C）的柠檬酸钠缓冲液（10 mM 柠檬酸钠，0.05% Tween 20，pH 6.0）中，置于压力锅内，高温加压 4 分钟，总抗原修复时间为 20 分钟。
  6. 从压力锅中取出玻片，室温下冷却 20 分钟。
  7. 用 TBST 快速洗涤玻片三次。
    注：抗原修复后的玻片可在 TBST 中保存，但不得超过一周，之后需进行染色。
  8. 加入溶解于 TBST 的 2% BSA 溶液以封闭非特异性结合位点。用一层石蜡膜覆盖玻片，室温孵育 15 分钟。
  9. 弃去封闭液。
  10. 向每张玻片上加入 200 µL 以 TBST 1:10 稀释的 D11-AP 溶液，并用石蜡膜覆盖。
  11. 将玻片置于湿化孵育盒中，室温孵育 3 小时，以减少抗体溶液的蒸发。
  12. 用 TBST 洗涤玻片三次。
  13. 根据实验目的，分别使用比色法或荧光法碱性磷酸酶显色试剂进行免疫组织化学或免疫荧光显色。用 TBST 洗涤一次，以去除多余的显色剂并防止进一步显色。
  14. 对于免疫荧光实验，使用 1 µg/mL 的 Hoechst 核染液在 PBS 中对玻片进行复染。用 TBST 洗涤一次，以去除未结合的复染液。
  15. 使用封片介质加盖盖玻片。
  16. 使用倒置光学显微镜观察免疫组织化学结果，或使用共聚焦荧光显微镜观察免疫荧光结果。

6. 阴性对照

注意：可进行四项阴性对照实验，以确认 D11-AP 染色对 IsoLG 的特异性。阴性对照实验应在相同的染色批次中、在相同条件下进行。

  1. 在第一个阴性对照实验中，将组织与用 TBST 稀释的 D11-AP 或仅用 TBST 进行孵育。
  2. 将组织与用 TBST 稀释的 D11-AP 以及不含 D11-AP（AP Linker）的细菌周质提取物（用 TBST 稀释）共同孵育。
  3. 使用 IsoLG/MSA 或未加合的 MSA 进行竞争性实验，方法如前所述12。
    1. 按照先前所述方法制备异构前列腺素（IsoLG）及其与小鼠血清白蛋白（MSA）的加合物，摩尔比为 8 IsoLG : 1 MSA（8:1 IsoLG/MSA）19。
    2. 用 TBST 将 D11-AP 按 1:10 比例稀释。
    3. 将稀释后的 D11-AP 与 50 µg/mL 的 IsoLG/MSA 或未加合的 MSA 在室温下孵育 1 小时。
    4. 将 D11-AP 与 IsoLG/MSA 或 D11-AP 与未加合的 MSA 分别加入组织中进行染色。
  4. 使用无关的 scFv 抗体 D20 对组织进行染色，作为最后一组阴性对照。

结果

在代表性实验中，使用与碱性磷酸酶偶联的 D11 scfv（D11-AP）通过免疫荧光检测经血管紧张素 II 处理的小鼠与正常假手术小鼠，以及高血压患者与非高血压患者体内存在的异前列腺素（IsoLGs）。小鼠以 490 ng/kg/min 的剂量接受血管紧张素 II 处理两周，通过与假手术小鼠相比收缩压升高确认高血压模型建立10。为确保 D11-AP 的特异性，组织样本在有或无 D11-AP 的条件下进行染色。如 D11-AP 染色结果所示，与对照小鼠相比，血管紧张素 II 诱导的高血压小鼠主动脉中 IsoLGs 浓度显著升高（图 1）。未使用 D11-AP 染色的阴性对照显示背景染色或自发荧光信号极低。

采用 D11-AP 检测高血压（HTN）患者和血压正常人（NTN）肠道组织中存在的异前列腺素（IsoLGs）。高血压状态根据医院记录确定，即收缩压高于 140 mmHg 且舒张压高于 80 mmHg。开发 D11-AP 免疫荧光方案的研究人员对人类组织样本的高血压状态设盲。组织切片在有或无 D11-AP 的条件下进行染色，以验证抗体特异性，并评估背景染色或自发荧光情况。如图 2所示，我们发现来自 HTN 患者的组织中 IsoLGs 浓度较 NTN 患者显著升高。未使用 D11-AP 的染色样本显示背景染色和自发荧光极低。由于肠上皮细胞内源性表达碱性磷酸酶，未加 D11-AP 的组织切片仅出现有限荧光信号，表明本方案中所用的抗原修复方法足以灭活组织中的内源性碱性磷酸酶。结合小鼠实验结果，这些数据进一步表明，与血压正常状态相比，该免疫荧光方案可有效显示高血压状态下 IsoLGs 水平的升高。

D11-AP 被分离并保存在细菌周质提取物中。使用 D11-AP 以及含有 AP 连接子但不含 D11 的周质提取物对小鼠和人类组织进行染色，以确保周质提取物中可能存在的其他因素（如过量或未偶联的碱性磷酸酶）不会导致在 D11-AP 处理的组织中观察到的染色信号（图 3）。与使用周质提取物染色的组织相比，使用 D11-AP 染色的组织显示出更强的染色信号。这些结果证实，组织染色是由 D11-AP 引起的，而非由周质提取物中可能存在的未偶联细菌碱性磷酸酶所导致，后者可能引起 IsoLGs 的假阳性染色或增加背景染色。

通过在染色组织前将D11-AP与IsoLG加合的MSA或未加合的MSA预先孵育，进行竞争性对照实验，以验证D11-AP对IsoLG的特异性。如果D11-AP对IsoLG具有特异性，则抗体会结合IsoLG-MSA，导致可用于组织染色的D11-AP减少；而与未加合MSA孵育的D11-AP应表现出与正常D11-AP相似的染色效果。在使用经IsoLG竞争物预先孵育的D11-AP染色的组织中，我们发现染色信号较未经任何预孵育的D11-AP染色组织明显减弱（图4）。而在使用经未加合MSA预孵育的D11-AP染色的组织中，染色结果与使用普通D11-AP染色的组织相似。这些结果表明D11-AP对IsoLG具有特异性，因为当D11-AP与IsoLG/MSA预孵育时组织染色减少，而与未加合MSA预孵育时则无此现象。在最后的阴性对照实验中，小鼠组织分别用D11-AP或无关的scFv抗体D20进行染色。染色结果显示，与D20相比，D11-AP在小鼠主动脉中产生强烈的染色信号，表明D11-AP在高血压主动脉中对IsoLG具有特异性（图5）。

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图1：高血压与正常血压小鼠主动脉的免疫荧光染色。使用血管紧张素II和假处理的小鼠动脉分别用D11-AP（D11）染色和不染色，以显示异构前列腺素（IsoLGs）的存在。（A）经血管紧张素II处理的小鼠动脉，使用D11-AP（绿色）和细胞核复染（品红色）；（B）对照假处理小鼠动脉，使用D11-AP染色；（C）经血管紧张素II处理的小鼠动脉，未使用D11-AP染色；（D）对照假处理小鼠动脉，未使用D11-AP染色（比例尺 = 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：高血压与非高血压患者人肠道组织的免疫荧光染色。对高血压（HTN）患者和非高血压（NTN）患者的组织分别使用和不使用D11-AP（D11）进行染色，以显示HTN患者中IsoLGs的存在情况。（A）HTN组织使用D11-AP（绿色）及细胞核复染（品红色）染色，（B）NTN组织使用D11-AP染色，（C）HTN组织未使用D11-AP染色，（D）NTN组织未使用D11-AP染色（比例尺 = 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：使用含或不含D11-AP的周质提取物染色的小鼠和人类组织。 使用含或不含D11-AP的周质提取物对小鼠和人类组织进行染色。图像显示，仅用不含D11-AP的周质提取物处理的组织染色信号微弱，表明染色主要归因于D11-AP的结合，而非周质提取物中可能存在的其他组分。(A) 用D11-AP（绿色）和细胞核复染（品红色）染色的Ang小鼠主动脉，(B) 用周质提取物染色的Ang小鼠主动脉，(C) 用D11-AP染色的假手术小鼠主动脉，(D) 用周质提取物染色的假手术小鼠主动脉，(E) 用D11-AP染色的高血压患者肠组织，(F) 用周质提取物染色的高血压患者肠组织，(G) 用D11-AP染色的正常血压患者肠组织，(H) 用周质提取物染色的正常血压患者肠组织 （比例尺 = 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：Ang小鼠与Sham小鼠血管中的竞争性对照。 在该竞争性对照实验中，D11-AP预先与IsoLG加合的MSA或非加合的MSA共同孵育。未进行任何预孵育的D11-AP作为对照。这些结果表明D11-AP对IsoLG具有特异性，因为在使用IsoLG-MSA作为竞争物时，组织染色信号较D11-AP对照组明显减弱。这种减弱是由IsoLG而非MSA引起，因为使用非加合MSA预孵育后的染色结果与D11-AP对照组相似。血管组织染色结果：血管紧张素II（A）和Sham（B）小鼠主动脉用D11-AP（绿色）及核复染（品红色）染色；血管紧张素II（C）和Sham（D）小鼠主动脉在D11-AP与IsoLG-MSA孵育后染色；血管紧张素II（E）和Sham（F）小鼠主动脉在D11-AP与非加合MSA孵育后染色（比例尺 = 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：使用D11和无关scFv抗体D20染色的小鼠主动脉。 小鼠组织使用D11-AP染色，并与无关对照抗体D20进行比较，D20特异性识别糖蛋白A2。D11-AP（绿色）染色及细胞核复染（品红色）（A）显示出强烈的免疫荧光信号，而D20（绿色）染色及细胞核复染（品红色）（B）信号较弱，表明D11-AP对IsoLGs具有特异性（比例尺 = 100 µm）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

D11 已被广泛用于检测细胞或组织中IsoLG加合蛋白，作为疾病中炎症或氧化应激的标志物8,9,20。此前，D11 含有E标签，免疫组化检测需要使用与HRP偶联的抗E标签二抗10,20,21。本文中，我们开发并优化了使用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体检测IsoLG加合蛋白的实验方案，取代了E标签，从而无需进行二抗孵育步骤。

为了确定 D11-AP 的特异性，我们进行了四项阴性对照实验。我们在不含 D11 的条件下执行该实验流程，结果仅出现微弱的显色反应。该结果具有两方面的意义：内源性碱性磷酸酶未参与显色反应，且观察到的染色结果是由 D11 引起，而非其他因素所致。接下来，我们在未加入 D11 的情况下，仅使用 AP 连接物对切片进行染色。该实验仅产生少量染色，表明周质提取物中的游离 AP 或其他因素并未导致在 D11 存在时所观察到的染色现象。为验证 D11 对 IsoLG 的特异性，我们在染色前将 D11-AP 与纯化的 IsoLG 预先孵育。结果显示显色减弱，表明 D11-AP 已与 IsoLG 蛋白结合，从而耗尽了可用于结合组织中 IsoLG 的游离 D11-AP。最后，为确认 D11-AP 是结合于 IsoLG 而非 IsoLG 所结合的 MSA 蛋白，我们使用仅含 MSA 的溶液对 D11-AP 进行预孵育。结果显示显色无变化，表明 D11-AP 并未结合 MSA，而是特异性结合于 IsoLG 蛋白。此外，开发该染色方案的研究人员对人类肠道组织的高血压状态设盲。在高血压患者与血压正常患者之间观察到的染色差异并非由偏倚所致，该现象此前已有报道22,23。

尽管我们采用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体替代E-tag标签来检测IsoLG加合蛋白的实验方案严谨且可靠，并省去了二抗孵育步骤，但仍存在一些局限性。其一，我们在周质提取物中使用了与碱性磷酸酶偶联的D11抗体，可能导致周质提取物或某些组织（如肠道）中内源性碱性磷酸酶产生非特异性染色24。然而，本方案开发的第一步即包括灭活组织中可能存在的内源性碱性磷酸酶25。最初我们测试了冷乙酸、BME和左旋咪唑26的灭活效率，但这些试剂均未能完全消除活性内源性碱性磷酸酶。已有研究使用加热方式使碱性磷酸酶失活27，因此我们测试了在不同缓冲液中通过加热灭活碱性磷酸酶的效果。结果发现，在柠檬酸盐缓冲液中对已封片并水化的载玻片进行加热处理，可基本消除大多数内源性碱性磷酸酶活性。最初我们使用化学发光/荧光底物进行显色，但在不使用该底物的情况下成像时，观察到较强的自发荧光。VectorRed是一种可在碱性磷酸酶存在下产生显色产物的底物，其信号可在Texas Red/TRITC荧光通道范围内被检测。使用该底物后，我们能够更清晰地观察到高于背景自发荧光的特异性信号。在染色过程中应谨慎操作，以尽量减少人为假象的产生。载玻片在水化后至成像前若发生组织干燥，会导致非特异性信号增强。D11-AP应分装保存于-20 °C，避免反复冻融。磷酸盐缓冲液（PBS）可能影响碱性磷酸酶的酶活性，因此不应作为洗涤缓冲液使用28。与所有基于抗体的方法一样，必须进行充分的验证和优化，以确保染色的特异性，并避免信号被过度或不足放大。

综上所述，我们开发了一种强大、严谨且稳健的优化方案，用于检测IsoLG加合蛋白，该方案采用与碱性磷酸酶偶联的D11抗体替代E-tag。本方案具有多项优势：首先，使用D11作为碱性磷酸酶融合蛋白成本更低。D11最初来源于一个噬菌体抗体文库，难以实现商业化，且纯化成本高昂。尽管E. coli周质提取物中的D11可作为低成本替代方案，但在大多数检测中效果不佳。其次，碱性磷酸酶融合策略使D11 scFv能够直接携带一个有效的报告分子15（碱性磷酸酶），无需额外纯化即可用于免疫检测，因为其底物可商业获得。第三，E. coli来源的碱性磷酸酶可形成二聚体29，因此当D11与碱性磷酸酶融合后也能形成二聚体，从而增强抗体的亲和力和结合活性30。最后，周质提取物中与碱性磷酸酶偶联的D11可通过Cibacron Blue Sepharose轻松纯化。D11具有较高的等电点（约pH 9.2），因此带正电荷，可通过π-阳离子相互作用与Cibacron Blue结合。而E. coli周质提取物中的大多数杂质则可被洗脱除去，随后使用高盐溶液（约1.5 M NaCl）将与碱性磷酸酶偶联的D11洗脱下来。洗脱后的D11-碱性磷酸酶偶联物在高盐溶液中于4–8 °C条件下具有良好的稳定性。因此，我们建立的这一方案不仅显著降低了D11抗体的使用成本，还省去了额外步骤以及对二抗孵育的需求。该方法有助于对IsoLGs进行可重复的定量检测，而IsoLGs在多种与氧化应激增强相关的疾病组织中会积累。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为K01HL130497、R01HL147818、R01HL144941和R03HL155041（授予A.K.）。我们感谢位于美国田纳西州纳什维尔的范德堡大学医学中心数字组织学共享资源平台（Digital Histology Shared Resource - Vanderbilt Health Nashville, TN）提供可视化支持和切片扫描服务，网址：https://www.vumc.org/dhsr/46298 。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1 ml TALON HiTrap 柱（钴-CMA）Cytiva28953766
200 证明乙醇Pharmco111000200
2xYT 粉末MP Biomedicals3012-032
384 孔透明平底聚苯乙烯微孔板ThermoFisher (NUNC)242757
4-硝基苯基磷酸二钠盐六水合物（pNPP）CarbosynthEN08508
5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸对甲苯胺盐（BCIP）CarbosynthEB09335
氨苄青霉素钠盐Research Products International (RPI)A40040
牛血清白蛋白RPIA30075
化学感受态 TG1 大肠杆菌Amid BiosciencesTG1-201
二乙醇胺，>98%Sigma-AldrichD8885
EDTASigma-AldrichED
Fluoromount-GSouthernBiotech0100-01封片介质
葡萄糖Research Products International (RPI)G32045
甘油Sigma-AldrichG7893
HistoclearNational DiagnosticsHS-200二甲苯替代品
Hoechst 33342ThermoFisherH3570储存液 = 10 mg/mL
盐酸（HCl），30%，Macron Fine ChemicalsThermoFisherMK-2624-212
咪唑Research Products International (RPI)I52000
MgCl2（无水）Sigma-AldrichM8266
小鼠血清白蛋白（MSA）Sigma-Aldrich/Calbiochem126674
硝基蓝四氮唑氯化物（NBT）CarbosynthEN13587
氯化钾（KCl）Sigma-AldrichP4504
磷酸二氢钾（KH2PO4）Sigma-AldrichP0662
高压锅CuisinartCPC-600
Slide-a-Lyzer 透析夹具，10K MWCO，3 mlThermoFisher66380
氯化钠（NaCl）Research Products International (RPI)S23020
柠檬酸钠Sigma-Aldrich1064461000
磷酸氢二钠（Na2HPO4）Research Products International (RPI)S23100
蔗糖Research Products International (RPI)S24065
Tris 碱Research Products International (RPI)T60040
Tris 缓冲盐水Boston Bio-Products25 mM Tris，2.7 mM KCl，137 mM NaCl，pH 7.4
Tris-HClResearch Products International (RPI)T60050
Tween20Sigma-AldrichP9416
Vector RedVector LabsSK-5105

参考文献

  1. Brame, C. J., Salomon, R. G., Morrow, J. D., Roberts, L. J. Identification of extremely reactive gamma-ketoaldehydes (isolevuglandins) as products of the isoprostane pathway and characterization of their lysyl protein adducts. Journal of Biological Chemistry. 274, 13139-13146 (1999).
  2. Brame, C. J., et al. Modification of proteins by isoketal-containing oxidized phospholipids. Journal of Biological Chemistry. 279, 13447-13451 (2004).
  3. May-Zhang, L. S., et al. Scavenging reactive lipids to prevent oxidative injury. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 61, 291-308 (2021).
  4. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139, 56(2019).
  5. Collins, D. R., et al. Global cardiovascular risk assessment in the primary prevention of cardiovascular disease in adults: Systematic review of systematic reviews. BMJ Open. 7, 013650(2017).
  6. Whelton, P. K., et al. 2017 ACC/AHA/AAPA/ABC/ACPM/AGS/APhA/ASH/ASPC/NMA/PCNA Guideline for the prevention, detection, evaluation, and management of high blood pressure in adults: Executive summary: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on clinical practice guidelines. Circulation. 138, 426-483 (2018).
  7. Patrick, D. M., Van Beusecum, J. P., Kirabo, A. The role of inflammation in hypertension: Novel concepts. Current Opinion in Physiology. 19, 92-98 (2021).
  8. Davies, S. S., et al. Isolevuglandins as mediators of disease and the development of dicarbonyl scavengers as pharmaceutical interventions. Pharmacology and Therapeutics. 205, 107418(2020).
  9. Dixon, K. B., Davies, S. S., Kirabo, A. Dendritic cells and isolevuglandins in immunity, inflammation, and hypertension. American Journal of Physiology-Heart and Circulation Physiology. 312, 368-374 (2017).
  10. Kirabo, A., et al. DC isoketal-modified proteins activate T cells and promote hypertension. Journal of Clinical Investigation. 124, 4642-4656 (2014).
  11. Yan, H. P., et al. Isolevuglandins as a gauge of lipid peroxidation in human tumors. Free Radical Biology and Medicine. 106, 62-68 (2017).
  12. Davies, S. S., et al. Localization of isoketal adducts in vivo using a single-chain antibody. Free Radical Biology and Medicine. 36, 1163-1174 (2004).
  13. Shen, Z., et al. Single-chain fragment variable antibody piezoimmunosensors. Analytical Chemistry. 77, 797-805 (2005).
  14. Hennig, E. E., Mernaugh, R., Edl, J., Cao, P., Cover, T. L. Heterogeneity among Helicobacter pylori strains in expression of the outer membrane protein BabA. Infections and Immunity. 72, 3429-3435 (2004).
  15. Martin, C. D., et al. A simple vector system to improve performance and utilisation of recombinant antibodies. BMC Biotechnology. 6, 46(2006).
  16. Han, Z., Karatan, E., Scholle, M. D., McCafferty, J., Kay, B. K. Accelerated screening of phage-display output with alkaline phosphatase fusions. Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 7, 55-62 (2004).
  17. Miller, J. Handbook for a short course in bacterial genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. (1992).
  18. Nair, R., et al. Yeast extract mediated autoinduction of lacUV5 promoter: An insight. New Biotechnology. 26 (6), 282-288 (2009).
  19. Davies, S. S., Amarnath, V., Roberts, L. J. Isoketals: Highly reactive γ-ketoaldehydes formed from the H2-isoprostane pathway. Chemistry and Physics of Lipids. 128 (1-2), 85-99 (2004).
  20. Ngwenyama, N., et al. Isolevuglandin-modified cardiac proteins drive CD4+ T-Cell activation in the heart and promote cardiac dysfunction. Circulation. 143 (12), 1242-1255 (2021).
  21. Prinsen, J. K., et al. Highly reactive Isolevuglandins promote atrial fibrillation caused by hypertension. Basic to Translational Science JACC. 5 (6), 602-615 (2020).
  22. Ferguson, J. F., et al. High dietary salt-induced dendritic cell activation underlies microbial dysbiosis-associated hypertension. JCI Insight. 5 (13), 126241(2019).
  23. Madhur, M. S., et al. Hypertension: Do inflammation and immunity hold the key to solving this epidemic. Circulation Research. 128 (7), 908-933 (2021).
  24. Estaki, M., DeCoffe, D., Gibson, D. L. Interplay between intestinal alkaline phosphatase, diet, gut microbes and immunity. World Journal of Gastroenterology. 20 (42), 15650-15656 (2014).
  25. Millán, J. L. Mammalian alkaline phosphatases: From biology to applications in medicine and biotechnology. , John Wiley and Sons. (2006).
  26. Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (8), 981-984 (1981).
  27. Goldstein, D. J., Rogers, C. E., Harris, H. Expression of alkaline phosphatase loci in mammalian tissues. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 77 (5), 2857-2860 (1980).
  28. Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Veterinary Pathology. 42 (4), 405-426 (2005).
  29. Coleman, J. E. Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).
  30. Harper, J. E., Toth, R. L., Mayo, M. A., Torrance, L. Properties of a panel of single chain variable fragments against Potato leafroll virus obtained from two phage display libraries. Journal of Virological Methods. 81 (1-2), 159-168 (1999).

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勘误


Formal Correction: Erratum: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence
Posted by JoVE Editors on 4/11/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Direct Detection of Isolevuglandins in Tissues using a D11 scFv-Alkaline Phosphatase Fusion Protein and Immunofluorescence. The Authors section was updated from:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

to:

Cassandra Warden1
Alan J. Simmons2
Lejla Pasic3
Ashley Pitzer4,6
Sean S. Davies4
Justin H. Layer5
Raymond L. Mernaugh3
Annet Kirabo4,6
1Vanderbilt Eye Institute, Vanderbilt University Medical Center
2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University
3Department of Biochemistry, Vanderbilt University
4Division of Clinical Pharmacology, Department of Medicine, Vanderbilt University Medical Center
5Division of Hematology and Oncology, Indiana University School of Medicine
6Department of Molecular Physiology and Biophysics, Vanderbilt University

标签

D11 scFv

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