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方法文章

单根骨骼肌纤维的分离用于全 mounts 神经肌肉接头的免疫荧光及形态计量分析

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⸱

DOI：

10.3791/62620

⸱

2021年8月14日

 ,  , 
1Developmental Biology Laboratory, Histology and Embryology Department, Faculty of Medicine, Universidad de la República, 2Cell and Molecular Neurobiology Laboratory, Clemente Estable Biology Research Institute (IIBCE), Ministerio de Educación y Cultura

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

准确检测神经肌肉接头组分的能力对于评估病理或发育过程引起的结构改变至关重要。本文详细介绍了一种简便的方法，可用于获取高质量的全装片神经肌肉接头图像，进而进行定量测量。

摘要

神经肌肉接头（NMJ）是运动神经与骨骼肌之间的一种特化接触位点。这一外周突触具有高度的形态和功能可塑性。在多种神经系统疾病中，NMJ 是早期的病理靶点，可导致神经传导失败、肌力减弱、萎缩，甚至肌纤维死亡。鉴于其重要性，定量评估 NMJ 各组分之间某些关系的可能性有助于理解其组装与拆解过程中的相关机制。在肌肉操作过程中，第一个难点是掌握技术技巧，以便快速识别并解剖肌肉，同时不损伤其肌纤维。第二个挑战是采用高质量的检测方法，获取可用于定量分析的 NMJ 图像。本文提供了一步一步解剖大鼠趾长伸肌和比目鱼肌的实验方案，并阐述了如何利用免疫荧光技术对完整神经肌肉接头的突触前和突触后结构进行可视化观察。实验结果表明，该技术可用于建立突触的显微解剖结构，并在生理或病理条件下识别其部分组分的细微变化。

引言

哺乳动物的神经肌肉接头（NMJ）是一种大型胆碱能三联突触，由运动神经元的神经末梢、骨骼肌纤维上的突触后膜以及终末施万细胞组成1,2,3。该突触具有高度的形态和功能可塑性4,5,6,7,8，即使在成年期，神经肌肉接头仍可发生动态的结构改变。例如，一些研究人员已证实，运动神经末梢在微米尺度上持续改变其形态9。另有报道指出，神经肌肉接头的形态会响应功能需求、使用方式的改变、衰老、运动或运动活动的变化4,10,11,12,13,14,15。因此，训练和缺乏使用构成了 改变神经肌肉接头某些特征的重要刺激因素，例如其大小、长度、突触小泡和受体的分布，以及神经末梢的分支情况14,16,17,18,19,20。

此外，已有研究表明，这一重要连接结构的任何改变或退化都可能导致运动神经元细胞死亡和肌肉萎缩21。人们还推测，神经与肌肉之间通信的异常可能是生理状态下与年龄相关的神经肌肉接头（NMJ）变化的原因，甚至可能在病理状态下导致其破坏。神经肌肉接头的解体在肌萎缩侧索硬化症（ALS）的发病过程中起着关键作用，ALS 是一种神经退行性疾病，是肌肉与神经相互作用受损的典型范例之一3。尽管已有大量关于运动神经元功能障碍的研究，但 ALS 中观察到的退行性变化究竟是由于运动神经元直接受损后扩展至皮质脊髓投射所致22，还是应被视为一种远端轴突病，即退化始于神经末梢并逐步向运动神经元胞体发展23,24，目前仍存在争议。鉴于 ALS 病理过程的复杂性，合理推测其可能涉及多种独立过程的共同作用。由于神经肌肉接头是肌肉与神经之间病理生理相互作用的核心，其稳定性丧失代表了疾病发生的关键环节，值得深入分析。

哺乳动物的神经肌肉系统在功能上被划分为离散的运动单位，每个运动单位由一个运动神经元及其轴突末梢所特异性支配的肌纤维组成。每个运动单位内的肌纤维具有相似或相同的结构和功能特性25。运动神经元的选择性募集能够优化肌肉对功能需求的响应。目前明确，哺乳动物的骨骼肌由四种不同类型的肌纤维构成。 某些肌肉以其最丰富的肌纤维类型特征命名。例如，比目鱼肌（位于后肢后侧，参与维持身体姿势）主要含有慢缩肌纤维（Ⅰ型），被公认为慢肌；而趾长伸肌 （EDL）则主要由具有相似快缩特性的肌纤维（Ⅱ型）构成，属于专司运动所需时相性动作的快肌。换言之，尽管成年肌肉在激素和神经影响下具有一定的可塑性，其肌纤维组成仍决定了执行不同活动的能力，如比目鱼肌持续进行低强度收缩，而EDL则表现出更快的单次收缩反应。不同类型肌纤维之间的其他可变特征还包括其结构（线粒体含量、肌浆网延伸程度、Z线厚度）、肌球蛋白ATP酶含量以及肌球蛋白重链的组成26,27,28,29。

对于啮齿类动物的神经肌肉接头（NMJs），不同肌肉之间存在显著差异28,29。在大鼠比目鱼肌和趾长伸肌（EDL）中进行的形态计量学分析显示，突触面积与肌纤维直径之间存在正相关关系（即比目鱼肌慢肌纤维的突触面积大于EDL快肌纤维），但两种肌肉中神经肌肉接头面积与纤维大小的比值相似30,31。此外，就神经末梢而言，1型纤维的终板绝对面积低于2型纤维，而以纤维直径进行标准化后，1型纤维神经末梢的面积则最大32。

然而，很少有研究聚焦于通过形态计量分析来展示神经肌肉接头（NMJ）某些组分变化的证据33,34。因此，鉴于NMJ在机体功能中的重要性，且其形态学和生理学在多种病理状态下会发生改变，优化不同类型肌肉的解剖方案以获得足够质量的样本，从而实现对完整NMJ结构的可视化，显得尤为重要。同时，还有必要评估在不同实验情境或条件下（如衰老或运动）突触前或突触后发生的改变35,36,37,38。此外，该方法还可用于揭示NMJ组分中更为细微的改变，例如在肌萎缩侧索硬化症（ALS）中所报道的终末神经末梢处神经丝蛋白磷酸化的异常39。

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方案

所有动物实验均按照中国国家法律 N° 18611 号实验动物护理规范。该方案已获机构伦理委员会（CEUA IIBCE，方案编号 004/09/2015）批准。

1. 肌肉解剖（第1天）

注意：开始之前，配制40 mL浓度为0.5%、pH 7.4的多聚甲醛（PFA）溶液，溶剂为杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）。可选步骤：配制20 mL浓度为4%的PFA溶液。将溶液分装为5 mL每份，于-20 °C冷冻保存。解剖当天，取出一份4% PFA溶液融化，并加入35 mL DPBS，得到40 mL浓度为0.5%的PFA溶液。

  1. 快速肌（EDL）的分离
    1. 处死一只大鼠。将动物腹部朝上放置。使用手术刀从脚趾之间向后肢方向做初始切口。
      注：本实验中采用腹腔注射90:10 mg/kg的氯胺酮与赛拉嗪混合物处死大鼠，但也可使用其他麻醉方式。
    2. 向上剥离皮肤，直至暴露大鼠膝关节。
    3. 为找到EDL肌，沿足部肌腱向上追踪至环状韧带。该韧带环绕两条肌腱。使用显微剪刀（或类似工具）在两条肌腱之间的韧带上剪开。通过提起两条肌腱来识别EDL肌腱，选择能使脚趾向上移动的一条。
    4. 用显微剪刀切断肌腱。然后用精细生物镊夹住肌腱，开始缓慢地将EDL肌从胫前肌、腓骨短肌和腓骨长肌中分离出来40（见图1A）。
      注：确保在分离过程中不损伤肌肉。操作时可剪除其余外侧肌肉，以在其中开辟通路（EDL肌并非位于表层），同时夹持并提起EDL肌进行分离。
    5. 为完全分离该肌肉，用显微剪刀切断连接于大鼠膝部的肌腱。
    6. 将分离出的肌肉浸入5 mL的0.5%多聚甲醛（PFA）溶液中，于4 °C下固定24小时。可选步骤：将肌肉用订书钉固定于一块纸板上，并翻转使肌肉面朝下，然后完全浸入8 mL固定液中。此步骤有助于在固定过程中保持肌肉的伸展状态。
  2. 慢缩肌（soleus）的分离
    1. 翻转动物（此时腹部朝下）。透过皮肤，用手术刀切断跟腱。
    2. 借助生物镊和显微剪刀，将腓肠肌从骨骼上分离，形成一个“肌肉盖”。比目鱼肌位于该肌肉盖的内侧，因其呈红色且具有扁平形态而易于识别。
    3. 用一对生物镊伸入并提起位于腓肠肌上方的比目鱼肌肌腱（见图1B）。
    4. 用显微剪刀切断肌腱。在提起整块肌肉的同时，剪断一些较弱的附着点（如神经血管结构）。最后，为完全游离比目鱼肌，用显微剪刀切断参与构成跟腱的比目鱼肌肌束。
    5. 重复步骤1.1.6以固定分离出的比目鱼肌。

2. 单肌纤维分离制备（第2天）

  1. 固定24小时后，在分离肌纤维之前，用6 mL DPBS溶液冲洗肌肉，每次10分钟，共冲洗3次。
  2. 为分离肌纤维，将一块肌肉置于显微镜载玻片上。在体视显微镜下，用一对生物镊子轻轻夹住其中一端的肌腱，再用另一把生物镊子从肌腱处开始缓慢夹捏，以分离肌纤维。随后，缓慢牵拉被夹捏的组织 向上朝向对侧肌肉肌腱进行分离。需要重复此操作数次，直至获得多个细小且分离的肌束。
  3. 将它们小心地放置在预处理过的载玻片（硅烷化）上。必须保持所有纤维排列有序，避免相互重叠。此时，将纤维室温晾干24小时。

3. 免疫荧光

  1. 一抗孵育（第3天）
    注意：所有步骤均在室温下进行，除非另有说明。去除不同溶液而不使纤维从载玻片上脱落的最有效方法是使用胰岛素注射器。
    1. 开始免疫染色过程时，用防水笔在干燥的分离肌纤维周围画圈，以形成防水屏障。
    2. 为水化肌纤维，加入200 µL蒸馏水孵育5分钟，然后更换为200 µL DPBS继续孵育5分钟。此时开始免疫荧光标记。
    3. 用300 µL封闭缓冲液（BB，含50 mM甘氨酸、1% BSA和1% Triton X-100）孵育纤维30分钟。
    4. 将BB替换为按厂家推荐浓度稀释的一抗。使用BB稀释抗体。本实验使用400 µL SMI 32或SMI 31抗体，识别非磷酸化（Nf）或磷酸化（Phos-Nf）的神经丝蛋白H ，稀释比例为1:800，用于检测NMJ的突触前成分。
      注意：若需识别整个突触前成分而非评估神经丝蛋白磷酸化状态，可选择先前已成功使用的抗突触素（synapsin）、突触素蛋白（synaptophysin）或SV2a的抗体。
    5. 将纤维与一抗稀释液在4 °C下孵育过夜（也可选择在37 °C孵育1小时）。两种情况下，均需使用湿盒进行孵育。
  2. 免疫荧光：二抗孵育（第4天）
    1. 去除一抗，用500 µL DPBS清洗纤维3次，每次10分钟，最后一次用BB清洗。
    2. 去除最后一次清洗液，加入用BB稀释的荧光标记二抗。本实验使用500 µL山羊抗小鼠Alexa Fluor 488抗体，按1:1000稀释。为观察NMJ的突触后成分，在二抗稀释液中加入1:300的α-银环蛇毒素（Btx） 生物素-XX偶联物。
      ​注意：Btx-生物素XX 经链霉亲和素检测后可增强信号，获得更高的信噪比图像。此外，链霉亲和素与不同荧光染料偶联可增加共标记实验中的颜色组合。也可直接使用荧光标记的Btx，获得质量相当的图像。
    3. 将二抗和Btx在室温下避光孵育2小时，或在37 °C避光孵育1小时。
    4. 去除二抗和Btx，用500 µL DPBS清洗3次，每次10分钟，最后一次用BB冲洗。
    5. 加入500 µL用BB按1:1000稀释的链霉亲和素Alexa Fluor 555，在室温下孵育1小时。此时，如需对细胞核进行复染，可加入终浓度为1 µg/mL的DAPI（二脒基苯基吲哚）探针。
    6. 去除孵育液，用500 µL DPBS清洗纤维3次，每次10分钟。然后进行封片。
  3. 封片
    1. 在载玻片上涂抹4个透明指甲油小点，位置如同正方形的四个顶点，静置干燥1-2分钟。这些点将支撑盖玻片，有助于避免组织被压碎。
    2. 去除最后一次DPBS清洗液，加入足量封片介质（约200 µL）覆盖纤维，避免干燥。
      注意：配制10 mL封片介质时，使用Tris-HCl 1.5 M pH 8.8与甘油按4:1（v:v）混合。
    3. 使用200 µL移液器吸头小心地将封片介质均匀铺展于纤维上，确保所有纤维完全浸没。在放置盖玻片前，去除气泡。
    4. 将盖玻片轻轻覆盖在样品上，尽量避免产生气泡。此操作可借助镊子完成。

4. 显微镜观察与形态计量分析

  1. 使用激光共聚焦显微镜对分离的肌纤维样本进行成像。
  2. 以1微米为间隔，对整个突触区域采集一系列光学切片（30 µm Z堆栈）。设置堆栈时，请参考Btx信号。每种肌肉条件下至少采集15-20个NMJ，图像分辨率为2048像素 × 2048像素。选择该方法是为了获得足够光学质量和分辨率的图像，以进行形态计量分析。
  3. 进行测量时，可使用任意分析软件对堆栈图像的投影图进行处理。
    注意：尽管本文所述的形态计量分析为手动完成，但目前已开发出两种基于Image J的工具，可用于研究神经肌肉接头突触前和突触后形态的多个不同方面33,34。
  4. 为获得NMJ总面积值，使用Photoshop 磁性套索工具选择终板的外边界（染色区域的外部轮廓，见图2），并在直方图窗口中确定所选像素的数量。随后，可根据共聚焦软件提供的比例尺将像素面积转换为平方微米。
  5. 使用相同的套索工具选择内边界（终板内染色区域的轮廓，见图2），并按照上述方法（步骤4.4）确定整个结构中的未染色区域（或空白区域）。通过从总面积中减去空白区域，即可得到每个NMJ的突触后面积值。
  6. 突触前面积的获取方法与NMJ总面积类似，定义为具有抗神经丝蛋白免疫荧光信号的区域。
    注意：上述所有参数用于计算突触后密度指数（突触后面积/总面积）和NMJ覆盖度（突触前面积/突触后面积）。较高的突触后密度指数表明终板更致密或更紧凑，而较低的NMJ覆盖度则反映神经末梢与终板之间的相互作用显著减弱（两者均与去神经化过程相符合）。在本示例中，由于在神经末梢水平检测到了磷酸化与非磷酸化的神经丝蛋白形式，因此还计算了磷酸化/非磷酸化突触前信号比值以及磷酸化/非磷酸化覆盖度比值。

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结果

本方案提供了一种简单的方法，用于分离并免疫染色两种不同类型的肌肉（快肌和慢肌，见图1）。通过使用正确的标记物和/或探针，可从定量角度检测和评估神经肌肉接头（NMJ）的各个组分，以分析疾病进展或特定药物处理所引起的一些形态学变化。在本研究中，NMJ的突触前和突触后组分分别使用抗-Nf 或抗-Phos-Nf 抗体以及Btx进行荧光标记（图2，上图）。免疫染色后获得的每张高分辨率共聚焦图像均用于测定方案部分中所述的形态计量参数和指数（Table 1），具体参数见图2底部图示中的描述。

为了证明这种整体神经肌肉接头（NMJ）制备方法能够完美保留突触结构，从而可视化渐进性神经系统疾病对其产生的影响，我们采用该方案对表达人源基因 SOD1G93A（一种肌萎缩侧索硬化症模型）的转基因大鼠的分离肌纤维进行了免疫染色（图3）。将突...

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讨论

本文介绍了一种详细的操作方案，用于分离两种大鼠骨骼肌（一种为慢缩肌，另一种为快缩肌）、肌纤维的分离，以及通过免疫荧光检测突触前和突触后标志物，以定量评估 NMJ 的变化及其组装/去组装过程。该类方案可用于啮齿类动物模型41,42，以评估生理或病理过程中的 NMJ 变化，例如在 ALS hSOD1G93A 大鼠的运动神经元变性模型中的应用。

为了获得成功且有益的结果，需要注意一些要点。例如，本方案所述的方法允许立即使用解剖得到的肌肉组织。然而，当需要更长时间保存肌肉时，可使用含0.05%叠氮化钠的DPBS溶液，并在4 °C条件下保存，可使肌肉组织保持良好状态长达4周。采用此方法时，在开始染色流程前必须用DPBS进行充分洗涤（每次10分钟，共5次）。另一个有助于获得高质量图像的方法是将PFA浓度降低至0.5%，因为这可以减少肌肉组织的自发荧光。此时应相应延长固定时间，可在4 °C条件下固定长达24小时。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

非常感谢CSIC和PEDECIBA为本工作提供的经费支持；感谢Natalia Rosano对稿件的修改；感谢Marcelo Casacuberta制作视频；感谢Nicolás Bolatto为视频配音。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
配备冷光源照明的体视显微镜NikonSMZ-10A
摇摆式平台Biometra (WT 16)042-500
盖玻片（24 × 32 mm）DeltalabD102432
优质（加号）载玻片PORLABPC-201-16
镊子F.S.T11253-20
Uniband LA-4C 剪刀 125 mmE.M.S77910-26
一次性外科刀片 #10Sakira Medical1567
一次性无菌注射器（1 ml）Sakira Medical1569
Super PAP 笔E.M.S71310
100 μl 或 200 μl 移液器Finnpipette9400130
共聚焦显微镜ZeissLSM 800 - AiryScan
NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H 大鼠Taconic2148-M
1× PBS（Dulbecco）Gibco21600-010
多聚甲醛Sigma158127
吐温-100（Triton X-100）SigmaT8787
甘氨酸Amresco167
牛血清白蛋白（BSA）Bio Basic INC.9048-46-8
甘油Mallinckrodt5092
TrisAmresco497
纯化抗神经丝蛋白重链（NF-H）磷酸化抗体BioLegend801601前称 Covance # SMI 31P
纯化抗神经丝蛋白重链（NF-H）非磷酸化抗体BioLegend801701前称 Covance # SMI-32P
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG（H+L）Thermo ScientificA11029
α-银环蛇毒素，生物素-XX偶联物InvitrogenB1196
链霉亲和素-Alexa Fluor 555 偶联物InvitrogenS32355
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）SigmaD8417

参考文献

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