磷酸钙转染法制备假型H5禽流感病毒及抗体中和活性测定

自1996年以来，A/goose/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒在家禽和野生鸟类中持续暴发流感，给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时，人类也会感染它，面临高死亡率1^，2。然而，高致病性禽流感病毒研究往往受到阻碍，因为它不能在生物安全3级实验室之外处理。为了解决这个问题，在H5 HPAI研究的一些实验中，假病毒被采用作为野生型病毒的替代品。假病毒足够安全，可以在生物安全2级实验室进行实践。

H5 HPAI 假病毒属于嵌合病毒，由替代病毒核心、带有流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜和报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒 （HIV）、逆转录病毒（如鼠白血病病毒 （MLV） 和水疱性口炎病毒 （VSV）³。具体来说，HIV-1包装系统被广泛用于产生流感假病毒，其中提供的主要基因是 gag 和 pol。HIVgag基因表达核心蛋白。pol基因表达整合酶和逆转录酶，这两者都是报告基因在转导细胞中表达所必需的。模仿替代病毒的基因组，报告基因以RNA形式被拥抱到假病毒核心中。报告基因将在宿主细胞中表达蛋白质。报告基因的基因表达水平可用于测量假病毒感染效率^3，4。主要报告基因是萤火虫荧光素酶，用于测量转导细胞中的相对发光单位（RLU）或相对荧光素酶活性（RLA）。其他报告基因如lacZ，Gaussia和Renilla荧光素酶也被使用，^{只是程度较小}5。

假病毒是研究针对H5 HAPI病毒的中和抗体的理想工具。为了测量中和抗体的效力，使用假病毒中和（PN）测定⁶。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒^7，8表面的糖蛋白。HA由用于受体结合的球状头部结构域和用于膜融合的干结构域组成。NA蛋白具有促进^{病毒释放的}唾液酸酶活性7^，8。PN 测定可以测量针对 HA 蛋白的中和抗体。针对HA头部和茎区域的中和抗体也可以通过病毒附着和进入测定来检测。与野生型病毒相比，假病毒中和实验具有更灵敏的检测值，可以在2级生物安全实验室中安全处理，并且在实践中通常更容易操作。

该协议详细介绍了H5 HPAI假病毒制备和PN测定的程序和关键步骤。此外，它还讨论了这些测定的故障排除、限制和修改。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒的A/Thailand/1（KAN）-1/2004（TH）毒株为例。为了获得测定中使用的免疫血清，该方案选择源自TH菌株的HA蛋白作为免疫原来免疫小鼠。

所有假病毒相关实验操作均在中国科学院上海巴斯德研究所（IPS，CAS）的ABSL2条件下进行。动物实验是根据机构动物护理和使用委员会批准的IPS，CAS动物方案进行的。

1. 磷酸钙转染假病毒包装

1. 在完整的DMEM培养基中制备HEK293FT细胞的单细胞悬液（每毫升9 x 10⁵）（表1）。将10mL单细胞悬液加入T75烧瓶中，在转染前将细胞在37°C，5%二氧化碳（CO₂）培养箱中孵育20小时。
   注意:建议HEK293FT低通道（<20通道）。确保细胞单层80-90%汇合。
2. 转染前2小时用10mL含有氯喹（100μM）的新鲜完全培养基替换培养基。
3. 如 表 2和 图1所示混合试剂和质粒DNA:ddH₂O，pCMV/R-HA，pCMV/R-NA，pHR-Luc，pCMV Δ 8.9，2.5 M CaCl₂和2x HEPES缓冲液。轻轻上下移液5次，将混合物在室温（RT）下孵育20分钟。
4. 将混合物转移到细胞上方的培养基中，轻轻摇动烧瓶。将细胞在细胞培养箱中孵育15小时。
5. 用 15 mL 新鲜的完整 DMEM 培养基替换培养基。将细胞在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育65小时。
   注意:培养基的颜色为浅橙色或微黄色，并且至少80%的细胞应在倒置光学显微镜下显示细胞病变效应（CPE）。
6. 收获上清液，并在4°C下以2095× g 离心20分钟。 收集上清液，等分，并将其储存在-80°C。

2.检测流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达

1. 通过血凝素 （HA） 测定检测 HA 蛋白表达。
   1. 将 50 μL PBS 加入 96 孔圆底板的第 2-12 列 A、B 和 C 行中。
      注意:行 A、B 和 C 属于 3 个独立的重复测试，第 12 列用作阴性对照。
   2. 将 100 μL 假病毒加入第 1 列的孔中。将 50 μL 从第 1 列转移到第 2 列中，通过上下移液 5 次充分混合，进行两次稀释直至最后一列 11，然后丢弃第 11 列中多余的 50 μL。
   3. 向每个孔中加入 50 μL 0.5% 红细胞，轻轻上下移液两次。将板在室温下孵育30-60分钟或直到阴性对照的红细胞在孔底部形成规则斑点。
   4. 观察并记录假病毒的HA滴度。
      注意:假病毒的HA单位是病毒的最高稀释因子，可导致红细胞100%血凝。
2. 通过蛋白质印迹测定检测 HA 和 NA 蛋白表达。
   注意:所有蛋白质印迹步骤均根据分子克隆手册（^第 4版）进行。
3. 通过 HIV-1 p24 ELISA 试剂盒检测 HIV-1 p24 蛋白表达（材料表）。
   1. 将 50 μL 裂解缓冲液加入 450 μL 假病毒样品中。充分混合。
   2. 向微孔板的每个孔中加入 300 μL 洗涤缓冲液。倒置击打板以完全去除洗涤缓冲液。重复洗涤5次。
   3. 分别向每个孔中加入 200 μL 标准品和样品。将它们在37°C孵育过夜或2小时。
   4. 吸出板的内容物并按照步骤2.3.2中所述洗涤板。
      注意:将测定板的一个孔留空以用作底物空白。
   5. 向每个孔中加入 200 μL p24 检测器抗体。将它们在37°C孵育1小时。如步骤2.3.2所述吸出并洗涤板。
   6. 向每个孔中加入100μL链霉亲和素-过氧化物酶工作溶液，并在37°C下孵育30分钟。如步骤2.3.2所述吸出并洗涤板。
   7. 向每个孔中加入 100 μL 亚状态工作溶液，包括底物空白孔，并在 37 °C 下孵育 30 分钟。
      注意:蓝色将在井中形成。
   8. 向每个孔中加入 100 μL 终止缓冲液。
      注意:蓝色将立即变为黄色。
   9. 在15分钟内读取450nm处的光密度。记录假病毒的 p24 滴度

3.假病毒滴定

1. 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 10⁴ ），将1250、2500、5000、10000、20000和40000个细胞添加到96孔平底板的不同孔中。将细胞在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育20小时。
2. 从-80°C冰箱中取出假病毒，在冰上解冻，涡旋假病毒。
3. 向 96 孔圆底板的每个孔中加入 6 个 AU（6x HA 单位）假病毒，并用高达 120 μL 的完整 DMEM 补充每个孔。
4. 上下移液混合物 5 次以充分混合。将混合物板在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育1小时。
5. 将 100 μL 混合物转移到 96 孔板中的细胞中。病毒感染后将细胞培养板放回培养箱中48小时，60小时和72小时。
6. 将板从培养箱中取出并进行荧光素酶测定（材料表）。
7. 小心地从板的孔中取出培养基。用 200 μL PBS 冲洗细胞并尽可能多地去除 PBS。
   注意:翻转板并通过将其反向拍打在吸收纸上来丢弃上清液。如果测试细胞系无法牢固地附着在底部，请小心地取出培养基抽吸物。
8. 向每个孔中加入 50 μL 裂解缓冲液，并摇动培养板数次。将板在-80°C下储存过夜。
   注意:将 1 体积的 5x 裂解缓冲液与 4 体积的水混合，制成 1x 裂解缓冲液。使用前将1x裂解缓冲液平衡至室温。摇动平板以确保细胞完全被裂解缓冲液覆盖。单次冻融过程可以帮助细胞完全裂解。
9. 取出板，在室温下平衡2小时。
   注意:细胞应完全裂解。
10. 轻轻摇动板数次，并将所有细胞裂解物转移到不透明的 96 孔板中。
11. 向每个孔中加入 50 μL 底物，轻轻摇动板数次，并彻底混合底物和裂解缓冲液。
12. 使用光度计测量5分钟内产生的光。记录假病毒的荧光素酶滴度。
    注意:当添加适当的底物时，光通过化学反应作为副产物发射，其中荧光素通过荧光素酶转化为氧化荧光素。产生的光量与荧光素酶的量成正比。

4. 免疫血清制备

注意:免疫血清将用于细胞相关实验，实验操作应在无菌条件下进行。

1. 准备12只八周龄的雌性BALB / c小鼠。将小鼠平均分为两组。
   注意:一组是DDV组，另一组是阴性对照组。
2. DDV 组免疫:在第 0 周和第 3 周用编码 A/Thailand/（KAN-1）/2004 （TH） HA 蛋白的密码子优化 DNA 质粒肌内注射两次，在第 6 周用 512 个 HAU TH 病毒样颗粒 （VLP） 腹膜内增强一次。
3. 对照组免疫:在第 0 周和第 3 周用 100 μg 空载体质粒 DNA 肌内注射两次，并在第 6 周用 HIV-1 gag VLP 腹膜内增强一次。
4. 最后一次免疫后2周收集小鼠血液。
   注意:在这里，小鼠在采血时用戊巴比妥钠（65mg / kg）麻醉。从下颌下静脉采集血液后，立即用CO₂对小鼠实施安乐死。
5. 将血液在室温下保持2小时，然后4°C过夜。在4°C下以900× g 离心10分钟并收集上清液。通过在56°C下放置30分钟来灭活血清。
6. 将免疫血清储存在-80°C冰箱中使用。
   注意:有关描述小鼠免疫主要程序的流程图，请参阅 补充图1 。

5. 假病毒中和 （PN） 测定

1. 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 10⁴ ），并向96孔平底板的每个孔中加入100μL细胞悬液。将细胞在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育20小时。
2. 从-80°C冰箱中取出假病毒和血清，在冰上解冻，彻底涡旋。
3. 将血清在完全培养基中稀释 20 倍，然后将 100 μL 完整的 DMEM 培养基添加到第 2-10 列的 96 孔圆底板的孔中。
4. 将 200 μL 稀释的血清加入第 2 列的孔中，将 100 μL 从第 2 列转移到第 3 列，将血清稀释为 1:20、1:40、1:80 等，从第 2 列依次稀释至 1:10240，然后从第 10 列丢弃 100 μL。
5. 向第 11 列的孔中加入 100 μL DMEM 完全培养基作为阴性对照。
6. 向每个孔中加入 100 μL 假病毒，彻底上下移液混合物 5 次，并将混合物板在 37 °C、5% CO₂ 中孵育 1 小时。
7. 将 100 μL 混合物从 96 孔圆底板转移到 96 孔细胞培养板的相应孔中。将板放回培养箱（37°C，5%CO₂）中60小时。
8. 将板从培养箱中取出。按照步骤3.7-3.12中所述进行荧光素酶测定。

6. 假病毒附着测定

1. 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升4 x 10⁴ ），并在96孔平底板中的每个孔中加入100μL细胞悬液。将细胞在37°C，5%CO₂ 下孵育20小时。
2. 将假病毒与含有1%BSA的DMEM中的血清在4°C孵育过夜。
   注意:混合物的体积为100μL。
3. 在4°C下用每孔100μL含有1%BSA的DMEM封闭MDCK细胞1小时。
4. 将假病毒和血清混合物（100μL）接种到MDCK单层上，并在4°C下孵育2小时。
5. 用含有1%BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除任何未结合的病毒。
6. 在室温下用 100 μL 荧光素酶裂解缓冲液裂解细胞 30 分钟。
7. 如上所述，使用HIV-1 p24 ELISA试剂盒定量细胞上结合病毒的数量（第2.3节）。

7. 病毒进入评估

1. 在完整的DMEM培养基中制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升5 x 10⁴ ），并向96孔平底板的每个孔中加入100μL细胞悬液。测定前将细胞在37°C，5%CO₂ 下孵育20小时。
2. 将假病毒（100μL）接种到4°C的96孔板中的MDCK单层上6小时。
3. 用含有1%BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除未结合的假病毒。
4. 将100μL连续稀释的免疫血清或来自含有1%BSA的DMEM中的假疫苗接种小鼠血清添加到单层中，并将细胞在4°C孵育2小时。
5. 除去细胞上清液，并用含有1%BSA的PBS洗涤细胞培养板4次。
6. 向细胞中加入新鲜的DMEM，并在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育60小时。
7. 如步骤3.7-3.12中所述测量细胞的相对荧光素酶活性（RLA）。
   注意:如RLA所示，病毒进入表示为在没有血清的情况下获得的读数的百分比，该读数设置为100%。

流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达
为了确定病毒包装效率，首先通过HA测定检测流感假病毒储液（图2A）。每毫升流感假病毒的HA单位为643（表3）。蛋白质印迹测定和夹心ELISA测定用于测试HA，NA和HIV-1 p24蛋白表达。然后计算假病毒HA单位与gag p24量的比值。蛋白质印迹测定的结果表明有4种蛋白质类型:HA0，HA1，HA2和NA蛋白（补充图2）。这表明流感假病毒的包膜蛋白与野生型病毒的包膜蛋白相似。HA和Gag p24的比率在正常范围内，如表3所示9。

表3:H5假病毒的定量。

假病毒滴定
为了测量功能性病毒颗粒的浓度，检测了假病毒的相对荧光素酶活性（RLA）。RLA读数取决于许多变量。为了确定转导细胞量对RLA读数的影响，我们接种了96孔板每孔1250、2500、5000、10000、20000和40000的细胞（图2）。结果表明，当将5000个细胞接种在96孔板的孔中时，假病毒的RLA读数最高，平均值的标准误差最低（图4A）。为了确定孵育时间的影响，在病毒感染后48小时，60小时和72小时检测RLA读数。结果表明，当孵育60 h时，假病毒的RLA读数值更高，重复性更好，平均值的标准误差较低（图4B）。结果表明，它适合在96孔板的孔中接种5000个细胞，并在病毒感染后60小时检测RLA读数。

PN 检测
通过PN测定法测量对照组和DDV组免疫血清的中和滴度（图5）。 如图5A所示，DDV组免疫血清对假病毒A/泰国/1（KAN）-1/04株表现出较高的中和滴度。相比之下，对照组的血清没有表现出任何中和活性（图5B）。与传统的血清学检测（HI和MN检测）相比，PN检测更敏感（数据未显示）。

附着中和测定
一些中和抗体会阻碍病毒附着在唾液酸受体上。这些抗体针对HA头部，在通过商业疫苗免疫或感染流感病毒后占主导地位。为了鉴定这些抗体的中和活性，进行附着中和测定（图3）。与对照血清相比，免疫血清的中和活性是有效的，这表明免疫血清中有很多针对HA头的抗体（图6A）。

病毒进入评估
该测定用于鉴定在流感病毒感染期间阻碍病毒包膜和内体膜融合的抗体。这些抗体针对HA茎结构域，通常效力较低。为了测量这些抗体的中和滴度，进行附着后测定（图3）。免疫血清和对照血清之间存在显着差异，这表明免疫血清中存在针对HA茎区域的抗体（图6B）。

图1:钙介导转染的流程图。 该流程图用于描述钙介导转染的主要程序。请点击此处查看此图的大图。

图 2:假病毒的定量和滴定。 （A）假病毒HA测定流程图，描述了假病毒HA测定的主要步骤。（B）假病毒P24测定流程图，描述了假病毒P24测定的主要步骤。（C） 描述假病毒滴定测定主要步骤的假病毒滴定测定流程图。请点击此处查看此图的大图。

图 3:基于假病毒的中和测定。 （A）描述PN测定主要步骤的PN测定流程图。（B）假病毒附着测定流程图，描述了附着测定的主要步骤。（C）描述病毒进入测定主要步骤的病毒进入测定评估流程图。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:假病毒滴定。 （A）96孔板中每孔的不同细胞量会影响RLA读数。将 1250、2500、5000、10000、20000 和 40000 个细胞接种在 96 孔板中。（B）不同的收获时间会影响RLA读数。在病毒感染后48小时，60小时和72小时检测到RLA读数。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。使用Tukey检验进行单因素方差分析。P < 0.0001;ns，不重要。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:假病毒检测到的 H5 中和抗体反应。 （A）滴定DDV组免疫血清的中和抗体反应。（B）滴定对照组免疫血清的中和抗体反应。IC 50定义为可以抑制50 %假病毒的中和抗体的相互稀释。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。VSVG假病毒用作阴性对照。 请点击此处查看此图的大图。

图 6:通过结合和病毒进入测定检测中和抗体效力 。 （A）来自DDV组的免疫血清，而不是来自对照组的免疫血清，抑制病毒对细胞的附着。（B）来自DDV组的免疫血清，而不是来自对照组的免疫血清，部分抑制病毒附着后感染。从三个独立实验中收集的数据以平均± SEM表示;误差线表示平均值的标准误差 （SEM）。 请点击此处查看此图的大图。

表 1:完整的 DMEM 培养基组成。

表 2:伪病毒包装系统。

补充图1:小鼠免疫流程图。 该流程图描述了小鼠免疫的主要程序。免疫血清用作样品。 请点击此处下载此文件。

补充图2:流感假病毒的HA，NA和HIV-1 p24蛋白表达。 假病毒蛋白的蛋白质印迹。 请点击此处下载此文件。

作者没有什么可透露的。