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方法文章

利用磷酸钙转染法制备假型H5亚型禽流感病毒及抗体中和活性检测

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DOI：

10.3791/62626

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2021年11月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Nanjing Advanced Academy of Life and Health, 2Institute of Animal Bio-technology, Jilin Academy of Agricultural Sciences, 3National Clinical Research Center for Infectious Diseases, Shenzhen Third People’s Hospital, Southern University of Science and Technology, 4CAS Key Laboratory of Molecular Virology and Immunology, Institut Pasteur of Shanghai, Chinese Academy of Sciences, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种假病毒包装的实验方案以及抗体中和活性的测定方法。

摘要

自1996年以来，A/鹅/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒已导致家禽和野生鸟类中多次流感暴发。偶尔人类也会感染该病毒，导致高死亡率。然而，由于高致病性禽流感病毒必须在生物安全三级实验室中操作，其研究常常受到限制。为解决这一问题，在部分H5高致病性禽流感病毒研究实验中，可采用假病毒作为野生型病毒的替代工具。假病毒被证明是研究抗H5高致病性禽流感病毒中和抗体的理想手段。本方案详细描述了H5高致病性禽流感假病毒的制备过程及假病毒中和试验的关键步骤，同时讨论了这些试验中的常见问题、局限性以及可能的改进方法。

引言

自1996年以来，A/鹅/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒持续在家禽和野生鸟类中引发流感暴发，给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时人类也会感染该病毒，并面临较高的病死率1,2。然而，由于高致病性禽流感病毒只能在生物安全三级实验室中操作，其研究常常受到限制。为解决这一问题，在部分H5亚型高致病性禽流感研究实验中，可采用假病毒作为野生型病毒的替代。假病毒安全性较高，可在生物安全二级实验室中进行操作。

H5 高致病性禽流感假病毒属于嵌合病毒，由替代病毒核心、携带流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜以及报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）、小鼠白血病病毒（MLV）等逆转录病毒，以及水疱性口炎病毒（VSV）。3特别是，HIV-1 包装系统被广泛用于制备流感假病毒，所提供的主要基因为 gag 和 polHIV的gag基因表达核心蛋白，pol基因表达整合酶和逆转录酶，这两种酶对于转导细胞中报告基因的表达均是必需的。报告基因以RNA形式被包裹进假病毒核心，模拟替代病毒的基因组。报告基因将在宿主细胞中表达相应的蛋白，其表达水平可用于测定假病毒感染效率。3,4主要报告基因为萤火虫荧光素酶，用于测定转导细胞中的相对发光单位（RLU）或相对荧光素酶活性（RLA）。其他报告基因如 lacZ、Gaussia 和海肾荧光素酶也有使用，但应用较少。5.

假病毒是研究针对H5亚型高致病性禽流感病毒（H5 HAPI）中和抗体的理想工具。为了测定中和抗体的效价，通常采用假病毒中和（PN）实验6。血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）是甲型流感病毒表面的糖蛋白7,8。HA由负责受体结合的球状头部结构域和介导膜融合的茎部结构域组成。NA蛋白具有唾液酸酶活性，有助于病毒释放7,8。假病毒中和实验可用于检测靶向HA蛋白的中和抗体。靶向HA头部和茎部区域的中和抗体也可通过病毒吸附和入侵实验进行检测。与野生型病毒相比，假病毒中和实验具有更高的检测灵敏度，可在生物安全二级实验室中安全操作，且在实际应用中通常更易于操作。

本方案详细介绍了H5高致病性禽流感假病毒制备及中和试验（PN）的操作流程和关键步骤，同时讨论了这些试验的故障排除方法、局限性以及可能的改进措施。本研究以H5N1高致病性禽流感病毒中的A/Thailand/1(KAN)-1/2004(TH)毒株为例。为获得试验中使用的免疫血清，本方案选择来源于TH毒株的血凝素（HA）蛋白作为免疫原，用于小鼠免疫。

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方案

所有假病毒相关实验操作均在中国科学院上海巴斯德研究所（IPS, CAS）的生物安全二级（ABSL2）条件下进行。动物实验根据中国科学院上海巴斯德研究所（IPS, CAS）机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案开展。

1. 使用磷酸钙转染法进行假病毒包装

  1. 用完全DMEM培养基（表1）制备HEK293FT细胞的单细胞悬液（每毫升含9 × 105 个细胞）。每只T75培养瓶中加入10 mL单细胞悬液，转染前在37 °C、5%二氧化碳（CO2）的培养箱中培养20小时。
    注意：建议使用低代次HEK293FT细胞（<20代）。确保细胞单层融合度达到80–90%。
  2. 转染前2小时，将培养基更换为含氯喹（100 µM）的新鲜完全培养基10 mL。
  3. 按表2和图1所示混合试剂与质粒DNA：ddH2O、pCMV/R-HA、pCMV/R-NA、pHR-Luc、pCMV Δ 8.9、2.5 M CaCl2和2x HEPES缓冲液。轻轻吹打混匀5次，在室温（RT）下孵育20分钟。
  4. 将混合物转移至细胞上方的培养基中，轻轻摇动培养瓶。将细胞置于细胞培养箱中继续孵育15小时。
  5. 将培养基更换为15 mL新鲜完全DMEM培养基，在37 °C、5% CO2培养箱中继续培养65小时。
    注意：培养基颜色应呈浅橙色或微黄色，在倒置光学显微镜下观察，至少80%的细胞应出现细胞病变效应（CPE）。
  6. 收集上清液，在4 °C条件下以2095 × g离心20分钟。收集上清液，分装后于-80 °C保存。

2. 流感假病毒中HA、NA及HIV-1 p24蛋白表达的检测

  1. 通过血凝素（HA）检测法检测HA蛋白的表达。
    1. 向96孔圆底板的第2至12列、A、B和C行中每孔加入50 µL PBS。
      注意：A、B 和 C 行分别属于 3 次独立的重复实验，第 12 列用作阴性对照。
    2. 将100 µL假病毒加入第1列各孔中。从第1列取50 µL转移至第2列，用移液器上下吹打5次充分混匀，依次进行两倍系列稀释至最后一列第11列，并弃去第11列多余的50 µL。
    3. 每孔加入50 µL 0.5% 红细胞悬液，轻轻吹打混匀两次。室温孵育30–60分钟，或直至阴性对照孔中的红细胞在孔底形成规则的红细胞斑点。
    4. 观察并记录假病毒的血凝素滴度。
      注：假病毒的HA单位是指能够引起红细胞100%凝集的病毒最高稀释倍数。
  2. 通过蛋白质印迹法检测HA和NA蛋白的表达。
    注意：所有蛋白质印迹步骤均按照《分子克隆实验指南》（第4版）中的操作手册进行。th 版次
  3. 使用HIV-1 p24 ELISA试剂盒检测HIV-1 p24蛋白表达材料表).
    1. 向450 µL假病毒样品中加入50 µL裂解缓冲液，充分混匀。
    2. 向微孔板的每个孔中加入 300 µL 洗涤缓冲液。将平板倒置轻敲，彻底去除洗涤缓冲液。重复洗涤 5 次。
    3. 向每个孔中分别加入200 µL标准品和样品。在37 °C孵育过夜或2 h。
    4. 吸出板内液体，并按照步骤 2.3.2 中所述方法洗涤平板。
      注意：留出检测板中的一个孔不加样品，作为空白对照孔。
    5. 向每孔中加入200 µL p24检测抗体，在37 °C孵育1小时。按照步骤2.3.2所述方法吸弃液体并洗涤平板。
    6. 每孔加入100 µL链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液，37 °C孵育30分钟。参照步骤2.3.2所述方法吸弃液体并洗涤平板。
    7. 向每个孔（包括底物空白孔）中加入100 µL底物工作液，在37 °C下孵育30分钟。
      注意：反应孔中将出现蓝色。
    8. 每孔加入 100 µL 终止缓冲液。
      注意：蓝色会立即变为黄色。
    9. 在15分钟内读取450 nm处的光密度值。记录假病毒的p24滴度。

3. 假病毒滴定

  1. 用完全DMEM培养基制备MDCK细胞的单细胞悬液（5 × 104 个/mL），分别向96孔平底板的不同孔中加入1250、2500、5000、10000、20000和40000个细胞。将细胞置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育20小时。
  2. 从-80 °C冰箱中取出假病毒，在冰上解冻，并对假病毒进行涡旋振荡。
  3. 向96孔圆底板的每孔中加入6 HAU（6个血凝单位）的假病毒，并用完全DMEM补足每孔体积至120 µL。
  4. 用移液器将混合液上下吹打5次以充分混匀。将混合液所在的培养板置于37 °C、5% CO2 培养箱中孵育1小时。
  5. 将100 µL混合液转移至96孔板中的细胞孔内。在病毒感染后，将细胞培养板放回培养箱中继续培养48小时、60小时和72小时。
  6. 将培养板从培养箱中取出，进行荧光素酶检测（材料表）。
  7. 小心吸除培养板各孔中的培养基，用200 µL PBS清洗细胞，并尽可能吸除PBS。
    注：将培养板倒置，在吸水纸上轻拍以去除残留上清液。若待测细胞系不能牢固贴壁，应小心进行培养基的吸除操作。
  8. 向每孔中加入50 µL裂解缓冲液，轻轻摇动培养板数次。将培养板置于-80 °C过夜保存。
    注：将1体积的5×裂解缓冲液与4体积的水混合，配制成1×裂解缓冲液。使用前将1×裂解缓冲液平衡至室温。轻轻摇动培养板，确保细胞完全被裂解缓冲液覆盖。一次冻融循环有助于细胞完全裂解。
  9. 将培养板从-80 °C取出，在室温下平衡2小时。
    注：细胞应已完全裂解。
  10. 轻轻摇动培养板数次，将所有细胞裂解液转移至不透光的96孔板中。
  11. 向每孔中加入50 µL底物，轻轻摇动培养板数次，使底物与裂解缓冲液充分混匀。
  12. 在加入底物后5分钟内使用化学发光仪测定发光信号。记录假病毒的荧光素酶滴度。
    ​注：当加入适当的底物后，荧光素酶催化荧光素转化为氧荧光素，此化学反应会释放光信号作为副产物。所产生的光信号强度与荧光素酶的含量成正比。

4. 免疫血清的制备

注意：免疫血清将用于细胞相关实验，实验操作应在无菌条件下进行。

  1. 准备12只八周龄雌性BALB/c小鼠，将小鼠平均分为两组。
    注：一组为DDV组，另一组为阴性对照组。
  2. DDV组免疫：在第0周和第3周，通过肌肉注射方式，各接种100 µg编码A/Thailand/(KAN-1)/2004（TH）HA蛋白的密码子优化DNA质粒，进行两次初免；在第6周通过腹腔注射512 HAU TH病毒样颗粒（VLP）进行一次加强免疫。
  3. 对照组免疫：在第0周和第3周，通过肌肉注射方式，各接种100 µg空载体质粒DNA，进行两次初免；在第6周通过腹腔注射HIV-1 gag VLP进行一次加强免疫。
  4. 在末次免疫后2周采集小鼠血液。
    注：此处采血时，使用戊巴比妥钠（65 mg/kg）对小鼠进行麻醉。从下颌静脉采血后，立即用CO2实施安乐死。
  5. 将血液在室温下静置2小时，随后在4 °C过夜。在4 °C条件下以900 × g离心10分钟，收集上清液。将血清置于56 °C水浴30分钟以灭活。
  6. 将免疫血清储存于-80 °C冰箱中备用。
    注：小鼠免疫主要步骤的流程图请参见补充图1。

5. 假病毒中和（PN）实验

  1. 用完全DMEM培养基制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升含5 × 104个细胞），每孔加入100 µL细胞悬液至96孔平底培养板中。将细胞置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育20小时。
  2. 从-80 °C冰箱中取出假病毒和血清，在冰上解冻，并充分涡旋混匀。
  3. 用完全培养基将血清稀释20倍，并向96孔圆底培养板第2至第10列的各孔中加入100 µL完全DMEM培养基。
  4. 向第2列各孔中加入200 µL稀释后的血清，从第2列取100 µL转移至第3列，依次进行2倍系列稀释，从第2列到第10列将血清稀释为1:20、1:40、1:80，直至1:10240，最后弃去第10列的100 µL液体。
  5. 向第11列各孔中加入100 µL完全DMEM培养基作为阴性对照。
  6. 向每孔加入100 µL假病毒，用移液器反复吹打混合5次，充分混匀后将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
  7. 将96孔圆底培养板中每孔100 µL混合液转移至96孔细胞培养板的对应孔中，将细胞培养板放回培养箱（37 °C，5% CO2）继续孵育60小时。
  8. 从培养箱中取出培养板，按照步骤3.7–3.12所述方法进行荧光素酶检测。

6. 假病毒结合实验

  1. 用完全DMEM培养基制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升含4 × 104个细胞），每孔加入100 µL细胞悬液至96孔平底培养板中。将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育20小时。
  2. 将假病毒与血清在含1% BSA的DMEM中于4 °C孵育过夜。
    注意：混合液体积为100 µL。
  3. 用每孔100 µL含1% BSA的DMEM在4 °C条件下封闭MDCK细胞1小时。
  4. 将假病毒与血清的混合液（100 µL）接种至MDCK单层细胞上，在4 °C孵育2小时。
  5. 用含1% BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除未结合的病毒。
  6. 在室温下用100 µL荧光素酶裂解缓冲液裂解细胞30分钟。
  7. 按照上述方法（第2.3节）使用HIV-1 p24 ELISA试剂盒定量细胞上结合的病毒量。

7. 病毒进入的评估

  1. 用完全DMEM培养基制备MDCK细胞的单细胞悬液（每毫升含5 × 104个细胞），每孔加入100 µL细胞悬液至96孔平底培养板中。在37 °C、5% CO2条件下培养20小时，然后进行检测。
  2. 将假病毒（100 µL）接种至96孔板中的MDCK单层细胞上，在4 °C孵育6小时。
  3. 用含1% BSA的PBS洗涤细胞板4次，以去除未结合的假病毒。
  4. 向单层细胞中加入100 µL用含1% BSA的DMEM倍比稀释的免疫血清或假免疫小鼠血清，在4 °C孵育2小时。
  5. 移除细胞上清液，并用含1% BSA的PBS洗涤细胞培养板4次。
  6. 向细胞中加入新鲜DMEM，在37 °C、5% CO2培养箱中继续孵育60小时。
  7. 按照步骤3.7–3.12所述方法测定细胞的相对荧光素酶活性（RLA）。
    注意：病毒进入程度以RLA表示，计算为无血清条件下检测值的百分比，后者设定为100%。

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结果

流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达
为鉴定病毒包装效率，首先通过血凝（HA）实验检测流感假病毒储备液（图2A）。每毫升流感假病毒的HA单位为643（表3）。采用Western印迹实验和夹心ELISA实验检测HA、NA以及HIV-1 p24蛋白的表达水平，并计算假病毒中HA单位与gag p24蛋白含量的比值。Western印迹实验结果显示，存在4种蛋白类型：HA0、HA1、HA2和NA蛋白（补充图2），表明流感假病毒的包膜蛋白与野生型病毒相似。HA与Gag p24的比值处于文献报道的正常范围内（表3）9。

假病...

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讨论

HEK293FT 细胞通常用作包装细胞以生产假病毒。在细胞培养过程中，定期进行支原体检测至关重要。支原体污染会显著降低假病毒的产量，有时甚至接近于零。与其他污染不同，支原体污染不会引起细胞培养基的 pH 值变化或浑浊现象。即使存在高浓度的支原体，肉眼或显微镜下也无法观察到。目前常用的三种支原体检测方法包括支原体培养、使用荧光染料 DAPI 或 Hoechst 33258 进行 DNA 染色，以及聚合酶链式反应（PCR）。通过 PCR 扩增培养样品中的支原体 DNA，因其快速、简便且可靠，已被广泛用于支原体检测10。

磷酸钙介导的转染因其高效、低成本和操作简便，多年来一直被用于流感假病毒的包装。11. 然而，该方法对HEPES缓冲溶液、HEK293FT细胞培养基以及重蒸水的pH值非常敏感2O. pH值影响沉淀物的形成及其在HEK293FT细胞上的停留时间，因此可决定HEK293FT细胞摄取的DNA量。HEPES缓冲溶液的pH范围极为严格，仅限于7.05–7.12

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了江苏省创新能力提升项目（BM2020019）、深圳 市科技计划项目（No. JSGG20200225150702770）、中国科学院战略性先导研究计划（XDB29030103）、广东省科技计划项目（No. 2020B1111340076）以及深圳湾实验室开放研究项目（No. SZBL202002271003）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1% 鸡红细胞Bio-channelBC-RBC-C001试剂
96孔细胞培养板（平底）Thermo Fisher Scientific167008耗材
96孔细胞培养板（圆底）Thermo Fisher Scientific163320耗材
Allegra X-15RBeckman Coulter--设备/离心机
BD 胰岛素注射器BD324910耗材
无水氯化钙AMRESCO1B1110-500G试剂
磷酸氯喹SelleckS4157试剂
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）Gibco12100-046试剂
胎牛血清Gibco16000-044试剂
HEK293FTGibcoR700-07细胞系
HEPES 游离酸AMRESCO0511-250G试剂
HIV-1 p24 抗原 ELISA 检测试剂盒ZeptoMetrix801111试剂盒
荧光素酶检测试剂盒冷冻包装PromegaE4530试剂盒
MDCK.1ATCCCRL-2935细胞系
微量离心管 1.5 mLThermo Fisher Scientific509-GRD-Q耗材
Nunc 圆底离心管 15 mLThermo Fisher Scientific339650耗材
Nunc 圆底离心管 50 mLThermo Fisher Scientific339652耗材
Nunc EasYFlask 75 cm2Thermo Fisher Scientific156499耗材
青霉素-链霉素Gibco15140-122试剂
移液器吸头（10 μL）Thermo Fisher ScientificTF102-10-Q耗材
移液器吸头（100 μL）Thermo Fisher ScientificTF113-100-Q耗材
移液器吸头（1000 μL）Thermo Fisher ScientificTF112-1000-Q耗材
血清移液管（5 mL）Thermo Fisher Scientific170355N耗材
血清移液管（10 mL）Thermo Fisher Scientific170356N耗材
胰蛋白酶/EDTAGibco25200-072试剂
Varioskan FlashThermo Fisher Scientific--设备/微孔板读板仪
水套式培养箱Thermo Fisher Scientific3111设备/细胞培养箱
戊巴比妥钠Sigma57-33-0试剂

参考文献

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  15. Kachkin, D. V., Khorolskaya, J. I., Ivanova, J. S., Rubel, A. A. An efficient method for isolation of plasmid DNA for transfection of mammalian cell cultures. Methods and Protocols. 3 (4), 69(2020).
  16. Luciferase assay system. , Available from: https://www.promega.com.cn/products/luciferase-assays/reporter-assays/luciferase-assay-system (2021).
  17. Corning 96-Well Solid Black or White Polystyrene Microplates. , Available from: https://www.fishersci.com/shop/products/costar-96-well-black-white-solid-plates (2021).

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