利用磷酸钙转染法制备假型H5亚型禽流感病毒及抗体中和活性检测

摘要

本文介绍了一种假病毒包装的实验方案以及抗体中和活性的测定方法。

摘要

自1996年以来，A/鹅/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒已导致家禽和野生鸟类中多次流感暴发。偶尔人类也会感染该病毒，导致高死亡率。然而，由于高致病性禽流感病毒必须在生物安全三级实验室中操作，其研究常常受到限制。为解决这一问题，在部分H5高致病性禽流感病毒研究实验中，可采用假病毒作为野生型病毒的替代工具。假病毒被证明是研究抗H5高致病性禽流感病毒中和抗体的理想手段。本方案详细描述了H5高致病性禽流感假病毒的制备过程及假病毒中和试验的关键步骤，同时讨论了这些试验中的常见问题、局限性以及可能的改进方法。

引言

自1996年以来，A/鹅/广东/1/96谱系高致病性禽流感（HPAI）H5病毒持续在家禽和野生鸟类中引发流感暴发，给全球家禽业造成了巨大的社会经济损失。有时人类也会感染该病毒，并面临较高的病死率^1,2。然而，由于高致病性禽流感病毒只能在生物安全三级实验室中操作，其研究常常受到限制。为解决这一问题，在部分H5亚型高致病性禽流感研究实验中，可采用假病毒作为野生型病毒的替代。假病毒安全性较高，可在生物安全二级实验室中进行操作。

H5 高致病性禽流感假病毒属于嵌合病毒，由替代病毒核心、携带流感病毒表面糖蛋白的脂质包膜以及报告基因组成。假病毒核心通常来源于慢病毒人类免疫缺陷病毒（HIV）、小鼠白血病病毒（MLV）等逆转录病毒，以及水疱性口炎病毒（VSV）。³特别是，HIV-1 包装系统被广泛用于制备流感假病毒，所提供的主要基因为 gag 和 polHIV的gag基因表达核心蛋白，pol基因表达整合酶和逆转录酶，这两种酶对于转导细胞中报告基因的表达均是必需的。报告基因以RNA形式被包裹进假病毒核心，模拟替代病毒的基因组。报告基因将在宿主细胞中表达相应的蛋白，其表达水平可用于测定假病毒感染效率。^3,

方案

所有假病毒相关实验操作均在中国科学院上海巴斯德研究所（IPS, CAS）的生物安全二级（ABSL2）条件下进行。动物实验根据中国科学院上海巴斯德研究所（IPS, CAS）机构动物护理和使用委员会批准的动物实验方案开展。

1. 使用磷酸钙转染法进行假病毒包装

1. 用完全DMEM培养基（表1）制备HEK293FT细胞的单细胞悬液（每毫升含9 × 10⁵ 个细胞）。每只T75培养瓶中加入10 mL单细胞悬液，转染前在37 °C、5%二氧化碳（CO₂）的培养箱中培养20小时。
   注意：建议使用低代次HEK293FT细胞（<20代）。确保细胞单层融合度达到80–90%。
2. 转染前2小时，将培养基更换为含氯喹（100 µM）的新鲜完全培养基10 mL。
3. 按表2和图1所示混合试剂与质粒DNA：ddH₂O、pCMV/R-HA、pCMV/R-NA、pHR-Luc、pCMV Δ 8.9、2.5 M CaCl₂和2x HEPES缓冲液。轻轻吹打混匀5次，在室温（RT）下孵育20分钟。
4. 将混合物转移至细胞上方的培养基中，轻轻摇动培养瓶。将细胞置于细....

结果

流感假病毒的HA、NA和HIV-1 p24蛋白表达
为鉴定病毒包装效率，首先通过血凝（HA）实验检测流感假病毒储备液（图2A）。每毫升流感假病毒的HA单位为643（表3）。采用Western印迹实验和夹心ELISA实验检测HA、NA以及HIV-1 p24蛋白的表达水平，并计算假病毒中HA单位与gag p24蛋白含量的比值。Western印迹实验结果显示，存在4种蛋白类型：HA0、HA1、HA2和NA蛋白（补充图2），表明流感假病毒的包膜蛋白与野生型病毒相似。HA与Gag p24的比值处于文献报道的正常范围内（表3）⁹。

假病.......

讨论

HEK293FT 细胞通常用作包装细胞以生产假病毒。在细胞培养过程中，定期进行支原体检测至关重要。支原体污染会显著降低假病毒的产量，有时甚至接近于零。与其他污染不同，支原体污染不会引起细胞培养基的 pH 值变化或浑浊现象。即使存在高浓度的支原体，肉眼或显微镜下也无法观察到。目前常用的三种支原体检测方法包括支原体培养、使用荧光染料 DAPI 或 Hoechst 33258 进行 DNA 染色，以及聚合酶链式反应（PCR）。通过 PCR 扩增培养样品中的支原体 DNA，因其快速、简便且可靠，已被广泛用于支原体检测¹⁰。

磷酸钙介导的转染因其高效、低成本和操作简便，多年来一直被用于流感假病毒的包装。¹¹. 然而，该方法对HEPES缓冲溶液、HEK293FT细胞培养基以及重蒸水的pH值非常敏感₂O. pH值影响沉淀物的形成及其在HEK293FT细胞上的停留时间，因此可决定HEK293FT细胞摄取的DNA量。HEPES缓冲溶液的pH范围极为严格，仅限于7.05–7.12

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 鸡红细胞	Bio-channel	BC-RBC-C001	试剂
96孔细胞培养板（平底）	Thermo Fisher Scientific	167008	耗材
96孔细胞培养板（圆底）	Thermo Fisher Scientific	163320	耗材
Allegra X-15R	Beckman Coulter	--	设备/离心机
BD 胰岛素注射器	BD	324910	耗材
无水氯化钙	AMRESCO	1B1110-500G	试剂
磷酸氯喹	Selleck	S4157	试剂
Dulbecco’s 改良伊格尔培养基（DMEM）	Gibco	12100-046	试剂
胎牛血清	Gibco	16000-044	试剂
HEK293FT	Gibco	R700-07	细胞系
HEPES 游离酸	AMRESCO	0511-250G	试剂
HIV-1 p24 抗原 ELISA 检测试剂盒	ZeptoMetrix	801111	试剂盒
荧光素酶检测试剂盒冷冻包装	Promega	E4530	试剂盒
MDCK.1	ATCC	CRL-2935	细胞系
微量离心管 1.5 mL	Thermo Fisher Scientific	509-GRD-Q	耗材
Nunc 圆底离心管 15 mL	Thermo Fisher Scientific	339650	耗材
Nunc 圆底离心管 50 mL	Thermo Fisher Scientific	339652	耗材
Nunc EasYFlask 75 cm2	Thermo Fisher Scientific	156499	耗材
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	试剂
移液器吸头（10 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF102-10-Q	耗材
移液器吸头（100 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF113-100-Q	耗材
移液器吸头（1000 μL）	Thermo Fisher Scientific	TF112-1000-Q	耗材
血清移液管（5 mL）	Thermo Fisher Scientific	170355N	耗材
血清移液管（10 mL）	Thermo Fisher Scientific	170356N	耗材
胰蛋白酶/EDTA	Gibco	25200-072	试剂
Varioskan Flash	Thermo Fisher Scientific	--	设备/微孔板读板仪
水套式培养箱	Thermo Fisher Scientific	3111	设备/细胞培养箱
戊巴比妥钠	Sigma	57-33-0	试剂