组织中蛋白质与RNA表达的空间分析：优化虚拟显微切割的一种方法

摘要

本文介绍了一种针对空间组学技术中感兴趣区域（ROIs）进行精细优化的实验方案，以更准确地表征肿瘤微环境并鉴定特定的细胞群体。对于蛋白质组学检测，可采用自动化的定制化流程来指导ROIs的选择；而在转录组学检测中，则可利用小至50 µm的ROIs进行精细优化。

摘要

多重检测技术能够在同一组织样本上评估多个标志物，同时提供空间位置信息。空间组学技术分别利用光解性寡核苷酸标记的抗体和探针，实现蛋白质和RNA的多重检测。通过从组织的特定区域释放并定量这些寡核苷酸，以揭示潜在的生物学特征。本研究证明，可采用自动化的定制抗体可视化方案，结合空间蛋白质组学检测，指导感兴趣区域（ROI）的选择。该特定方法在空间转录组学检测中未表现出可接受的性能。本方案描述了在自动化平台上开发一种三重免疫荧光（IF）检测方法，用于标志物的可视化，采用酪胺信号放大（TSA）技术增强来自特定蛋白质靶标的荧光信号，并扩大可选的抗体池。该可视化方案通过一个经过充分验证的三重检测体系实现自动化，以确保检测质量和可重复性。此外，评估了以SYTO染料替代DAPI的可行性，以便在空间分析平台上对基于TSA的免疫荧光检测进行成像。同时，我们测试了利用空间转录组学检测选择小ROI的能力，以研究高度特异性的感兴趣区域（例如，富集特定细胞类型的区域）。采集了直径分别为50 µm和300 µm的ROI，分别对应约15个细胞和100个细胞。将样本制备为文库并进行测序，以评估从小ROI中检测信号及对组织特定区域进行分析的能力。我们确定，空间蛋白质组学技术可显著受益于自动化、标准化的检测流程，以指导ROI的选择。尽管该自动化可视化方案与空间转录组学检测不兼容，但我们通过测试证实，即使在小ROI中，使用标准的手动可视化方案也能成功检测到特定的细胞群体。

引言

多重检测技术的进步不断为肿瘤中靶标的表征提供更优的分析工具。肿瘤微环境（TME）是一个复杂的系统，包含肿瘤细胞、浸润性免疫细胞和基质成分，其中空间信息对于深入理解与解读感兴趣生物标志物之间的相互作用机制至关重要¹。随着GeoMx数字空间分析仪（DSP）和10x Visium等新兴技术的发展，可在其空间背景下同时检测并定量多个靶标。采用有助于组织可视化的免疫荧光方案，可进一步提升这些技术的空间分析能力。

本方法开发所关注的空间组学技术包括空间蛋白质组学和转录组学检测，其中寡核苷酸通过紫外敏感的光裂解连接子共价连接至抗体或RNA探针。via该技术，组织切片经寡核苷酸偶联的抗体或探针标记后，在空间分析平台上进行成像。随后，选择不同大小和形状的感兴趣区域（ROI）进行光照，光裂解释放的寡核苷酸被吸出并收集至96孔板中。这些光裂解的寡核苷酸可进一步用于Nanostring nCounter系统或下一代测序（NGS）^2,3（图1）^4,5进行定量分析。

细胞在组织内的分布存在差异，利用特定标记物和不同大小的感兴趣区域（ROI）来表征细胞的特定位置，对于全面理解组织微环境并识别特定特征具有重要意义。本文所述的空间组学技术中，标准可视化方案采用直接偶联抗体，且为手动操作流程。用于区分肿瘤与间质的标准标记物是全细胞角蛋白（panCytokeratin，panCK）和CD45^6,7，但针对特定目标细胞群体还需引入额外的标记物。此外，使用直接偶联荧光抗体缺乏信号放大步骤，限制了抗体的选择范围，仅适用于高丰度的标记物。同时，手动实验流程相比自动化工作流程具有更高的变异性⁸。因此，建立一种可定制、自动化且具备信号放大的可视化方案用于ROI选择是十分必要的。

本研究证明，在空间蛋白质组学检测中，TSA 技术可用于自动化平台上的可视化实验流程，从而实现更精准且标准化的检测。此外，基于 TSA 的检测方法能够检测低表达标志物，扩大了可用于可视化分析的靶标范围。本研究利用自动化平台开发了一种针对 panCK、FAP 和抗体 X 的三重检测方法，其中 panCK 和 FAP 分别用于区分肿瘤细胞和间质。抗体 X 是一种在肿瘤中常见的间质蛋白，但其生物学功能及对抗肿瘤免疫的影响尚未完全阐明。通过表征富含抗体 X 区域的免疫微环境，有助于揭示其在抗肿瘤免疫和治疗反应中的作用，并评估其作为药物靶点的潜力。

尽管定制的自动化TSA可视化面板在空间蛋白质组学检测中已证明是成功的，但这些检测方法在空间转录组学检测中的应用尚无法确认。这很可能是因为自动化可视化方案所使用的试剂和操作流程会破坏RNA的完整性。认识到自动化标记方案可用于空间蛋白质组学检测而不能用于空间转录组学检测，为空间组学技术的检测设计提供了重要的指导。

此外，该研究证明空间转录组学检测可用于分析直径小至50 µm（约15个细胞）的区域中的靶标。选择了两种不同大小的感兴趣区域（ROI），以测试该检测方法在小ROI中检测转录本的能力。针对每个感兴趣区域，根据空间分析平台的操作流程，收集对应于1,800个mRNA靶标的寡核苷酸并构建文库。文库经单独加索引后合并，并进行测序。这使得能够评估合并测序的效率以及在小ROI中识别特定细胞群体的能力。

本文表明，在空间蛋白质组学检测中，可采用自动化方案根据特定目标标志物指导感兴趣区域（ROI）的选择，从而选择性地针对相关组织区域进行分析，并表征组织的空间微环境。此外，我们还证明，在空间转录组学检测中可使用较小的ROI来检测并表征特定的细胞群体。

方案

所有人体组织均来自商业生物样本库或经认证的组织库，且保证已获得适当的机构审查委员会批准和知情同意。

注意：本实验方案使用 Discovery Ultra 和 GeoMx 数字空间分析仪进行操作。有关本方案中所用试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。

1. 空间蛋白质组学检测的自动化可视化方案

1. 编程自动染色机以应用荧光可视化抗体
   1. 在自动染色机软件中，点击主页按钮并选择程序。然后点击创建/编辑程序，并选择RUO DISCOVERY Universal作为操作流程。
   2. 点击第一序列 > 脱蜡 > 脱蜡 v2。对于中等温度，选择72 Deg C，然后点击预处理并选择细胞条件处理和CC1 储液槽。对于极高温度，选择100 Deg C，然后点击CC1 8 Min并持续点击直至选中CC1 64 Min。
   3. 点击抑制剂 > DISCOVERY 抑制剂，对于孵育时间，选择8 分钟。然后点击抗体 > 高温抗体孵育；对于低温，选择37 Deg C；对于抗体，从分配器标签中选择抗体编号（本示例中为抗体 6）；对于额外孵育时间，选择32 分钟。
      注：该程序包含三种不同的抗体编号。第一种抗体为 FAP，第二种为 Pan-Cytokeratin，第三种为 Antibody X。
   4. 点击多聚体 HRP > 多聚体 HRP 阻断剂，然后对于抗体阻断，选择Gt Ig Block，对于孵育时间，选择4 分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂中选择OMap anti-Rb HRP，对于孵育时间，选择16 分钟。然后点击Cy5，对于长时间孵育时间，选择0 小时 8 分钟。
   5. 点击双序列并选择抗体变性，然后选择抗体变性 CC2-1，对于极高温度，选择100 Deg C。确保孵育时间为 8 分钟。接下来，点击DS 抑制剂并选择中和。
   6. 点击DS 抗体，对于极低温度，选择37 Deg C。然后在抗体中，从分配器标签中选择抗体编号（本示例中为抗体 3），对于额外孵育时间，选择32 分钟。
   7. 点击DS 多聚体 HRP并选择DS 多聚体 HRP 阻断剂。然后对于抗体阻断，选择Gt Ig Block，对于孵育时间，选择4 分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂中选择OMap anti-Ms HRP，对于孵育时间，选择16 分钟。然后点击DS Rhodamine 6G，对于长时间孵育时间，选择0 小时 8 分钟。
   8. 点击三重染色并选择TS 抗体变性，然后选择抗体变性 CC2-2，对于极高温度，选择100 Deg C。确保孵育时间为 8 分钟。接下来，点击TS 抑制剂并选择TS 中和。
   9. 点击TS 抗体，对于极低温度，选择37 Deg C。然后在抗体中，从分配器标签中选择抗体编号（本示例中为抗体 7），对于额外孵育时间，选择32 分钟。
   10. 点击TS 多聚体 HRP并选择TS 多聚体 HRP 阻断剂。然后对于抗体阻断，选择Gt Ig Block，对于孵育时间，选择4 分钟。接下来，在多聚体 HRP 试剂中选择OMap anti-Rb HRP，对于孵育时间，选择16 分钟。然后点击TS FAM，对于长时间孵育时间，选择0 小时 8 分钟。
   11. 为程序添加标题。选择一个程序编号，添加注释，点击启用，然后点击保存。
2. 准备载玻片，打印标签，并启动自动染色机运行
   1. 将供应商提供的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）人组织切片置于70 °C的烘箱中烘烤20–60分钟。在载玻片烘烤的同时，通过在自动染色机软件中点击创建标签来打印标签。接着点击程序，选择程序编号，然后点击关闭/打印。在载玻片标签上添加相关信息，然后点击打印。
   2. 从烘箱中取出载玻片，使其冷却至室温（RT）。将先前打印好的程序标签贴至相应的载玻片上。
   3. 根据步骤1.1中指定的抗体标签编号，向可重复填充的抗体分配器中加入相应的抗体。在本程序中，使用抗体6（1 µg/mL）检测FAP，使用抗体3（0.1 µg/mL）检测Pan-Cytokeratin，使用抗体7（2.5 µg/mL）检测Antibody X。将每种抗体用指定的稀释液稀释，并对可重复填充的抗体分配器进行预启动。
   4. 收集上述提及的阻断、检测和扩增预填充试剂分配器，并将其放置于试剂托盘上。将载玻片装入载玻片托盘（每次运行最多30张载玻片），点击运行，然后点击是。注意：本实验不使用DAPI进行细胞核复染。
   5. 通过查看自动染色机软件中的运行时长，确认运行已开始。该程序完成约需11小时，可过夜运行。
   6. 次日，通过观察载玻片托盘插槽上的绿色闪烁灯确认运行完成。然后将载玻片从仪器中取出，并用1x反应缓冲液剧烈冲洗，直至完全去除液态封片溶液。
3. 用于蛋白质组学检测的空间分析平台程序
   1. 遵循下方注释中指出的空间蛋白质组学程序。为实现三重自动标记流程，需对程序进行以下修改。
   2. 在开始空间蛋白质组学程序的前一天执行步骤1.2.1–1.2.6 ，并在完成步骤1.2.6后直接进入空间蛋白质组学程序的抗原修复步骤。省略空间分析蛋白质组学程序中所述的可视化步骤。
   3. 用5000 nM的SYTO 64替代SYTO 13，以实现荧光染料整合。将SYTO 64用1x TBS稀释后，在湿盒中孵育15分钟。
   4. 在空间分析平台中设置扫描参数时，根据可视化面板中使用的荧光染料选择滤光片和对焦通道，以实现三重整合。使用FITC对应DISCOVERY FAM，曝光时间设为200 ms；使用Cy3对应DISCOVERY Rhodamine 6G，曝光时间设为200 ms；使用Texas Red对应SYTO 64，曝光时间设为50 ms（指定为对焦通道）；最后，使用Cy5对应DISCOVERY Cy5，曝光时间设为200 ms，并保存更改。
      注：空间分析蛋白质组学程序的详细说明可在官方网站支持页面中找到，路径为选择文档 > 用户手册。在此查找使用Bond RX平台的nCounter蛋白检测程序。

2. 空间转录组学检测中的感兴趣区域选择

1. 将FFPE细胞团块切片置于70 °C的烘箱中烘烤20-60分钟。按照下方注释中指出的空间分析平台NGS操作流程，在空间分析平台上扫描载玻片，并选择50 µm和300 µm的尺寸。针对空间转录组检测，建议如下：
   1. 在构建文库时，若选择了不同大小的感兴趣区域（ROIs），应将尺寸相近的ROIs合并，每种尺寸构建一个独立文库。此举可确保所有ROIs获得足够的测序深度，避免因尺寸差异引入偏差。
      注：空间分析平台的详细操作说明可通过官方网站“支持”页面获取，路径为选择 文档 > 用户手册。请查找适用于Bond RX平台的NGS应用RNA操作流程。

结果

自动可视化流程以指导ROI的选择
在本文中，我们介绍了一种基于自动化定制的TSA免疫荧光（IF）流程，用于组织成像并选择特定的感兴趣区域（ROI）。使用黑色素瘤和正常人皮肤作为对照组织进行可视化面板开发，包括表位稳定性测试、标志物信号强度的精细优化，以及通过“留一法”对照进行的信号串扰评估。为检测抗体表位稳定性是否受重复洗脱步骤的影响，对3重染色中每个位置标记后的FAP和抗体X信号进行了定性评估。结果显示，抗体X信号在所有位置均保持一致，而FAP信号强度在经历一次洗脱后即出现下降图2）。先前的内部研究表明，panCK 表位在 3-重检测过程中保持稳定。因此，选择将 FAP 置于第 1 通道^st 3重检测中的位置，panCK被置于第2位^nd，以及3中的抗体X^rd 位置。由于FAP信号整体较抗体X和panCK弱，因此将FAP与荧光更强的Cy5荧光染料配对。

通过“留一法”对照对自动化的三重检测进行优化，即在三重检测方案中...

讨论

迄今为止，在手动操作流程中，直接标记荧光的抗体最常被用作空间蛋白质组学或空间转录组学检测的可视化检测面板^9,10。然而，对于丰度较低的标志物而言，使用直接标记荧光的抗体可能面临挑战，从而限制了合适抗体的选择范围。本方案表明，可在自动化染色平台上利用TSA技术实现可视化标志物标记的自动化，以支持空间蛋白质组学检测。这使得可视化检测面板的定制更具灵活性，从而能够更有针对性地选择感兴趣区域（ROI），并从组织的特定区域获取相关的生物学数据。TSA技术还可实现对低丰度标志物的可视化，进而增加潜在可用抗体的数量。此外，可视化检测流程的自动化可确保标记过程的可重复性和质量。

开发一个三重免疫荧光检测需要在适当的对照组织上仔细评估标记物/荧光染料的信号强度。建议对抗体浓度进行滴定，以获得最佳的信噪比，从而有助于最大限度地减少信号渗漏到相邻通道。此外，应测试每个目标标记物的表位稳定性，以确保其不受重复洗脱步骤的影响。一旦确认了抗体组合的顺序，就需要使用“留一法”对照对检测进行精细优...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x Tris 缓冲盐溶液 (TBS)	Cell Signaling Technologies	12498S	用 DEPC 处理水稀释至 1x TBS
抗体 X（未公开）			因保密原因对抗体设盲
DEPC 处理水	ThermoFisher	AM9922	可使用其他同类产品
DISCOVERY 细胞预处理液 (CC1)	Ventana	950-500
DISCOVERY Cy5 试剂盒	Ventana	760-238	文中简称为 Cy5
DISCOVERY FAM 试剂盒	Ventana	760-243	文中简称为 FAM
DISCOVERY 山羊 IgG 封闭剂	Ventana	760-6008	文中简称为 Gt Ig Block
DISCOVERY OmniMap 抗小鼠 HRP	Ventana	760-4310	文中简称为 OMap anti-Ms HRP
DISCOVERY OmniMap 抗兔 HRP	Ventana	760-4311	文中简称为 OMap anti-Rb HRP
DISCOVERY 罗丹明 6G 试剂盒	Ventana	760-244	文中简称为 Rhodamine 6G
DISCOVERY ULTRA 全自动玻片制备系统	Ventana	05 987 750 001 / N750-DISU-FS	文中简称为 autostainer
FAP [EPR20021] 抗体	Abcam	Ab207178
GeoMx 数字空间分析仪	NanoString	GMX-DSP-1Y	文中简称为空间分析平台
湿盒	Simport	M920-2	可使用其他同类产品
广谱细胞角蛋白 [AE1/AE3] 抗体	Abcam	Ab27988
ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThermoFisher	P36934
Python	Python		用于统计分析
反应缓冲液 (10x)	Ventana	950-300
统计分析软件	GraphPad	Prism 7	用于统计分析
SYTO 64	ThermoFisher	S11346
ULTRA 细胞预处理液 (ULTRA CC2)	Ventana	950-223
Ventana 含酪蛋白的一抗稀释液	Ventana	760-219	文中简称为指定稀释液
Ventana 一抗加样器	Ventana		货号取决于加样器编号