本文介绍了一种针对空间组学技术中感兴趣区域（ROIs）进行精细优化的实验方案，以更准确地表征肿瘤微环境并鉴定特定的细胞群体。对于蛋白质组学检测，可采用自动化的定制化流程来指导ROIs的选择；而在转录组学检测中，则可利用小至50 µm的ROIs进行精细优化。
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本文内容
摘要
摘要
多重检测技术能够在同一组织样本上评估多个标志物，同时提供空间位置信息。空间组学技术分别利用光解性寡核苷酸标记的抗体和探针，实现蛋白质和RNA的多重检测。通过从组织的特定区域释放并定量这些寡核苷酸，以揭示潜在的生物学特征。本研究证明，可采用自动化的定制抗体可视化方案，结合空间蛋白质组学检测，指导感兴趣区域（ROI）的选择。该特定方法在空间转录组学检测中未表现出可接受的性能。本方案描述了在自动化平台上开发一种三重免疫荧光（IF）检测方法，用于标志物的可视化，采用酪胺信号放大（TSA）技术增强来自特定蛋白质靶标的荧光信号，并扩大可选的抗体池。该可视化方案通过一个经过充分验证的三重检测体系实现自动化，以确保检测质量和可重复性。此外，评估了以SYTO染料替代DAPI的可行性，以便在空间分析平台上对基于TSA的免疫荧光检测进行成像。同时，我们测试了利用空间转录组学检测选择小ROI的能力，以研究高度特异性的感兴趣区域（例如，富集特定细胞类型的区域）。采集了直径分别为50 µm和300 µm的ROI，分别对应约15个细胞和100个细胞。将样本制备为文库并进行测序，以评估从小ROI中检测信号及对组织特定区域进行分析的能力。我们确定，空间蛋白质组学技术可显著受益于自动化、标准化的检测流程，以指导ROI的选择。尽管该自动化可视化方案与空间转录组学检测不兼容，但我们通过测试证实，即使在小ROI中，使用标准的手动可视化方案也能成功检测到特定的细胞群体。
引言
多重检测技术的进步不断为肿瘤中靶标的表征提供更优的分析工具。肿瘤微环境（TME）是一个复杂的系统，包含肿瘤细胞、浸润性免疫细胞和基质成分，其中空间信息对于深入理解与解读感兴趣生物标志物之间的相互作用机制至关重要1。随着GeoMx数字空间分析仪（DSP）和10x Visium等新兴技术的发展，可在其空间背景下同时检测并定量多个靶标。采用有助于组织可视化的免疫荧光方案，可进一步提升这些技术的空间分析能力。
本方法开发所关注的空间组学技术包括空间蛋白质组学和转录组学检测，其中寡核苷酸通过紫外敏感的光裂解连接子共价连接至抗体或RNA探针。via该技术，组织切片经寡核苷酸偶联的抗体或探针标记后，在空间分析平台上进行成像。随后，选择不同大小和形状的感兴趣区域（ROI）进行光照，光裂解释放的寡核苷酸被吸出并收集至96孔板中。这些光裂解的寡核苷酸可进一步用于Nanostring nCounter系统或下一代测序（NGS）2,3（图1）4,5进行定量分析。
细胞在组织内的分布存在差异....
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方案
所有人体组织均来自商业生物样本库或经认证的组织库，且保证已获得适当的机构审查委员会批准和知情同意。
注意：本实验方案使用 Discovery Ultra 和 GeoMx 数字空间分析仪进行操作。有关本方案中所用试剂、设备和软件的详细信息，请参见材料表。
1. 空间蛋白质组学检测的自动化可视化方案
- 编程自动染色机以应用荧光可视化抗体
- 在自动染色机软件中，点击主页按钮并选择程序。然后点击创建/编辑程序，并选择RUO DISCOVERY Universal作为操作流程。
- 点击第一序列 > 脱蜡 > 脱蜡 v2。对于中等温度，选择72 Deg C，然后点击预处理并选择细胞条件处理和CC1 储液槽。对于极高温度，选择100 Deg C，然后点击CC1 8 Min并持续点击直至选中....
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结果
自动可视化流程以指导ROI的选择
本文介绍了一种基于自动化定制的TSA免疫荧光（IF）流程，用于组织可视化并选择特定的感兴趣区域（ROI）。使用黑色素瘤和正常人皮肤作为对照组织进行可视化面板开发，包括表位稳定性测试、标记物信号强度的精细优化，以及通过留一法对照进行串色评估。为检验抗体表位稳定性是否受重复洗脱步骤影响，对3重标记中每个位置标记后的FAP和抗体X信号进行了定性评估。结果显示，抗体X信号在所有位置均保持一致，而FAP信号强度在经历一次洗脱后即出现下降图2）。先前的内部研究表明，panCK表位在3重检测中保持稳定。因此，选择将FAP置于第1通道st 在3重检测中，panCK被置于第2位nd，以及3中的抗体Xrd 由于FAP信号整体较抗体X和panCK弱，因此将FAP与荧光更强的Cy5荧光染料配对。
通过“留一法”对照对自动化三重检测进行了优化，即在三重检测方案中依次省略每个标志物，以确认不存在信号渗漏至相邻通.......
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讨论
迄今为止，在手动操作流程中，直接标记荧光的抗体最常被用作空间蛋白质组学或空间转录组学检测的可视化检测面板9,10。然而，对于丰度较低的标志物而言，使用直接标记荧光的抗体可能面临挑战，从而限制了合适抗体的选择范围。本方案表明，可在自动化染色平台上利用TSA技术实现可视化标志物标记的自动化，以支持空间蛋白质组学检测。这使得可视化检测面板的定制更具灵活性，从而能够更有针对性地选择感兴趣区域（ROI），并从组织的特定区域获取相关的生物学数据。TSA技术还可实现对低丰度标志物的可视化，进而增加潜在可用抗体的数量。此外，可视化检测流程的自动化可确保标记过程的可重复性和质量。
开发一个三重免疫荧光检测需要在适当的对照组织上仔细评估标记物/荧光染料的信号强度。建议对抗体浓度进行滴定，以获得最佳的信噪比，从而有助于最大限度地减少信号渗漏到相邻通道。此外，应测试每个目标标记物的表位稳定性，以确保其不受重复洗脱步骤的影响。一旦确认了抗体组合的顺序，就需要使用“留一法”对照对检测进行精细优.......
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披露
Veronica Ibarra-Lopez、Sangeeta Jayakar、Yeqing Angela Yang、Zora Modrusan 和 Sandra Rost 是罗氏集团成员企业基因泰克（Genentech）的员工及股票持有者。罗氏集团旗下的其他公司生产了本手稿中所使用的试剂和仪器。Ciara Martin 是 NanoString Technologies Inc 的全职员工，该公司生产本手稿中所使用的试剂和仪器。
致谢
作者感谢 Thomas Wu 对 NGS 文件的处理。我们感谢 James Ziai 对结果的讨论和稿件审阅，以及 Meredith Triplet 和 Rachel Taylor 对稿件的内部修订。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10x Tris 缓冲盐溶液 (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | 用 DEPC 处理水稀释至 1x TBS |
| 抗体 X（未公开） | 因保密原因对抗体设盲 | ||
| DEPC 处理水 | ThermoFisher | AM9922 | 可使用其他同类产品 |
| DISCOVERY 细胞预处理液 (CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 试剂盒 | Ventana | 760-238 | 文中简称为 Cy5 |
| DISCOVERY FAM 试剂盒 | Ventana | 760-243 | 文中简称为 FAM |
| DISCOVERY 山羊 IgG 封闭剂 | Ventana | 760-6008 | 文中简称为 Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap 抗小鼠 HRP | Ventana | 760-4310 | 文中简称为 OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap 抗兔 HRP | Ventana | 760-4311 | 文中简称为 OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY 罗丹明 6G 试剂盒 | Ventana | 760-244 | 文中简称为 Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA 全自动玻片制备系统 | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | 文中简称为 autostainer |
| FAP [EPR20021] 抗体 | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx 数字空间分析仪 | NanoString | GMX-DSP-1Y | 文中简称为空间分析平台 |
| 湿盒 | Simport | M920-2 | 可使用其他同类产品 |
| 广谱细胞角蛋白 [AE1/AE3] 抗体 | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | 用于统计分析 | |
| 反应缓冲液 (10x) | Ventana | 950-300 | |
| 统计分析软件 | GraphPad | Prism 7 | 用于统计分析 |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA 细胞预处理液 (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana 含酪蛋白的一抗稀释液 | Ventana | 760-219 | 文中简称为指定稀释液 |
| Ventana 一抗加样器 | Ventana | 货号取决于加样器编号 |
参考文献
- Nerurkar, S. N., et al. Transcriptional spatial profiling of cancer tissues in the era of immunotherapy: The potential and promise. Cancers. 12 (9), 2572(2020).
- Decalf, J., Albert, M. L., Ziai, J.
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重印与许可
