一种生成周期负荷诱导的大鼠膝关节内软骨病变模型的非侵入性方法

Summary

在这里，我们提出了大鼠膝关节的循环负荷诱导的关节内软骨病变模型，该模型由60次超过20 N的循环按压产生，导致大鼠股骨髁软骨受损。

Abstract

原发性骨关节炎 （OA） 的病理生理学仍不清楚。然而，相对年轻年龄组的 OA 的特定亚分类可能与关节软骨损伤和韧带撕脱史相关。膝关节OA的外科动物模型在了解创伤后OA的发生和进展方面起着重要作用，并有助于开发这种疾病的新疗法。然而，最近已考虑使用非手术模型来避免可能影响干预评估的创伤性炎症。

本研究建立了 体内 循环压缩负荷诱导的关节内软骨病变大鼠模型，使研究人员能够（1）确定可能导致局灶性软骨损伤的最佳负荷量、速度和持续时间;（2）评估软骨细胞活力的创伤后时空病理变化;（3）评估参与关节压缩负荷的适应和修复机制的破坏性或保护性分子的组织学表达。本报告描述了大鼠模型中这种新型软骨病变的实验方案。

Introduction

传统上，前交叉韧带 （ACL） 横断或内侧半月板不稳定被认为是研究小动物创伤后骨关节炎 （PTOA） 的最佳方法。近年来，非侵入性循环压缩模型已被用于研究PTOA。该模型最初设计用于研究松质骨对机械负荷的反应¹，然后被修改为PTOA研究的非手术动物模型²，³，⁴，^5，6。其基本原理是通过施加周期性的外力来碰撞关节软骨，从而引发一系列炎症反应。然而，该模型仅应用于小鼠，尚未讨论较大动物的适当负荷量。

先前模型的另一个问题是，高容量方案包含太多周期，这导致软骨下骨过度增厚，这是^{几个样品中}不必要的副作用7。因此，开发了一种对大型动物具有适当幅度和较低负荷副作用的循环压缩新方法⁸。本文的总体目标是描述大鼠无创循环压缩模型的方案，并观察软骨变性的代表性结果。目前的协议将帮助对非侵入性循环压缩模型在大鼠上的应用感兴趣的读者。

Protocol

该方案已获得京都大学动物研究委员会的批准（批准号:Med kyo 17616）。

1.对大鼠膝盖进行 体内 循环加压

1. 诱导实验动物麻醉
   1. 通过在麻醉盒中吸入5%异氟醚溶液，在12周龄的Wistar大鼠（256.8±8.7g）中诱导麻醉。
   2. 腹膜内注射三种麻醉剂⁹的混合物，包括美托咪定，咪达唑仑和布托酚，以2mg / kg的大鼠体重，并剃除右膝关节周围的区域。通过对脚趾夹紧缺乏踏板反射来确认充分麻醉。
2. 将麻醉的大鼠安装在固定装置上。
   1. 将麻醉的大鼠放在底板上（图1），右膝盖连接到一小块带有凹槽的树脂上。将右后肢置于髋关节伸展、膝关节屈曲和踝关节伸展位置，膝关节弯曲约 140°。将老鼠的脚跟放在可移动夹具上的楔形凹槽上。
   2. 将固定装置移至应力/拉伸测试仪器（见 材料表）。确保没有与称重传感器接触后，打开应力/拉伸测试仪器控制软件（材料表）并单击 校准 按钮。校准后，小心地将框架顶部连接到称重传感器上。为了使膝关节与框架紧密相连，请缓慢打开可移动主操作面板上的旋钮，直到预载荷达到 5 N。
3. 构建加载方法并设置压缩测试。
   1. 在主菜单上，单击创建新方法|系统标签。将"测试模式"设置为"循环"，将"测试类型"设置为"压缩"。单击传感器标签并选择测试选项卡以检查限值是否在 60 N 以内。此外，选择"行程"选项卡并检查限制是否在 500 mm 以内。
      注意:如果应力点上存在较大的位移，上述步骤将立即停止操作。
   2. 在"测试"控件标签下，选择"增长原点"以 0.3%/满量程启动主程序。在一个加载循环的四个部分中，将控制第 1^{和第 3 部分的}行程速度设置为 1 mm/s。将第 2 部分的最大测试力设置为 20 N，将^第 4 部分中的最小测试力设置为 5 N.将峰值负载的"保持持续时间"设置为 0.5 s，将最小负载设置为 10 s（图 2）。
      注意: 由于此步骤定义了每个循环，因此请确保接头表面彼此接触并以合理的速度移动并保持运动。
   3. 在页面底部的预 载荷 选项卡中，确保选中 开 ，挠 度消除速度 设置为 100 mm/min， 最大力 为 5 N。在" 标本 "标签中，将 "材质 "设置为 "金属"。
      注:这些详细设置可能特定于每个制造商。
   4. 在 主菜单中的"选择 方法和 测试"部分下，选择刚刚构建的方法，然后单击"开始 "开始 测试。
      注意:底部的表格显示了峰值载荷和位移的实际测量值。
   5. 将周期数设置为 60。
      注意:整个加载过程包括 60 个周期，持续约 12 分钟。对照组大鼠在相同条件下进行5 N预加载12 min预加载。
4. 装载后，将大鼠放回笼子并监测直至完全恢复。在笼子中保持12-12小时的明暗时间表，有足够的空间和随意的食物 。 在所需的实验期后，用过量的腹膜内注射或吸入二氧化碳的三种麻醉剂混合物处死大鼠进行分析（1小时-8周）。

Results

获得了承受20 N循环负荷的样品中软骨细胞活力短期变化（1 h和12 h）的代表性结果。如图 3所示，创伤后12小时死亡软骨细胞（红色荧光）的数量增加。相反，活软骨细胞的数量（绿色荧光）继续减少，一些样本在受影响区域不含活软骨细胞。

组织学显示，经历20 N动态负荷的大鼠膝关节软骨受损，所有样本中股骨外侧髁均确认一个局灶性病变区（图4）。然而，在8周的观察期内，病变大小没有逐渐增加。在受影响的区域可以观察到对应于病变界面和未受影响的软骨的边界。

图1:固定装置由底板和固定装置组成。底板...

Discussion

目前的协议首次展示了如何在大鼠股骨外侧髁上建立负荷诱导的软骨病变模型，^{类似于小鼠等}较小啮齿动物的关节内损伤模型2。然而，小鼠的负荷方案导致严重的骨赘形成和交叉韧带病变，这对于评估循环压缩的效果并不理想。目前的方案在大鼠中产生了局灶性软骨病变，负荷力要低得多。正确的加载方法设置对于协议至关重要，因为只有适当的应力大小、速度和持续时间才能在不损坏骨组织的情况下破坏软骨。

设置位移极限（协议步骤1.3.1）也至关重要，因为在韧带断裂或大鼠在负荷过程中从麻醉中醒来时，它会立即停止仪器。最佳最大负荷和大鼠的年龄仍有待确定。然而，在初步实验中，超过50 N的负荷导致大鼠膝盖ACL破裂的可能性很高。此外，目前的模型很难在年龄较大的（>36周龄）大鼠中繁殖，这可能是由于生长过程中软骨的僵硬。

虽然尚未确定年轻大鼠的破坏性负荷阈值，但据信未来的研究应将最大负荷保持在20N以下，以观察对软骨的任何合成代谢作用。病变区域的范围和定位相对容易建立，即使对于那些刚进入该领域的人也是如此，正如每个样本中的软...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
小动物麻醉仪	SHINANO MFG CO.，LTD.	SN-487-0T
亲笔签名 AG-X	岛津公司	N.A.	精密万能/拉力测试仪
Fluoview FV10i 显微镜	Olympus Corp	N.A.	全自动共聚焦激光扫描显微镜
ISOFLURANE 吸入溶液	Pfizer Japan Inc.	（01）14987114133400
LIVE/DEA 活力/细胞毒性试剂盒	Thermo Fisher Scientific Japan Inc	L3224	一种快速简便的双色测定法，用于确定细胞活力
TRAPEZIUM X 软件	Shimadzu Corp	N.A.	Autograph AG-X 的数据处理软件