方法文章

基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用

DOI：

10.3791/62667

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2022年3月25日

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1Imagine Institute, INSERM UMR 1163, Université de Paris, 2Imagine Institute, iPSC Core Facility, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 3Necker Bio-image Analysis platform of the SFR Necker, 4Imagine Institute, Cell Imaging Platform, INSERM-US24-CNRS UMS 3633 Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM UMR U1163, Université de Paris, 5Fédération de Génétique, Hôpital Necker-Enfants Malades, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, 6Pediatric Neurology, APHP- Necker Enfants Malades Hospital

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初级纤毛（PC）是一种非运动性的、基于微管的动态细胞器，突出于大多数哺乳动物细胞表面。它们在细胞周期的G1/G0期从较老的中心粒上形成，而在细胞于G2/M期边界重新进入细胞周期时发生解聚。初级纤毛作为信号枢纽，能够感知并转导对多种细胞过程至关重要的胞外信号。与大多数细胞类型相似，所有新皮质神经干细胞和前体细胞（NSPCs）均被证实具有初级纤毛，使其能够感知并转导新皮质正常发育所必需的特定信号。本文提供了从人诱导性多能干细胞（hIPSCs）建立和表征二维（2D）及三维（3D）细胞模型的详细方案，以进一步解析初级纤毛在新皮质发育过程中的作用。具体而言，我们展示了在2D神经玫瑰花结来源的NSPCs中研究初级纤毛生成及其功能的实验方案，包括Sonic Hedgehog（SHH）信号通路的转导分析。为了充分利用脑类器官的三维（3D）结构特征，我们描述了一种用于3D成像的简便方法 整体上 免疫染色的大脑类器官。经过光学透明化处理后，可快速获取整个类器官的完整图像，从而检测全类器官中新皮层前体细胞和神经元中的中心体和初级纤毛（PC）。最后，我们详细描述了对较厚的游离类器官切片进行免疫染色和透明化处理的步骤，该方法在很大程度上保留了三维空间信息，能够实现高分辨率成像，适用于初级纤毛（PC）发生及其功能的定性和定量精细分析。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初级纤毛（PC） 是一类以微管为基础的细胞器，能够感知并转导来自细胞外环境的多种化学和机械信号。特别是，PC 是脊椎动物中 Hedgehog 信号通路转导的核心细胞器1,2。尽管长期以来已知大多数神经细胞均含有 PC，但该细胞器在中枢神经系统发育过程中的作用长期以来一直被低估。 关于新皮质发育的研究已发现多种神经干细胞和前体细胞（NSPCs），它们均具有 PC，且其位置被认为在前体细胞命运决定中起关键作用3,4,5,6,7。研究表明，PC 对于正常大脑皮层发育所必需的多种细胞机制至关重要，包括 NSPC 的扩增与定向分化8,9,10,11,12，以及支持神经元迁移的放射状胶质细胞支架的顶-基极性建立13。此外，PC 在中间神经元向皮层板进行切向迁移过程中也是必需的14,15。最后，已有研究提出 PC 参与了大脑皮层神经元突触连接的形成16,17。综上所述，这些发现表明 PC 在大脑皮层发育的多个关键阶段中发挥着重要作用18,19，并提示有必要进一步探究其在大脑皮层发育异常相关病理机制中的作用。

近期研究极大地加深了我们对人类与动物模型在皮层发育过程中重要细胞和分子差异的理解，强调了建立人类模型系统的必要性。 在这一背景下，人类诱导性多能干细胞（hIPSCs）为在相关的遗传和细胞背景下研究疾病发病机制提供了一种极具前景的方法。贴壁的二维（2D）细胞模型或神经玫瑰花环结构包含神经干细胞前体细胞（NSPCs），其特征与发育中大脑皮层中的细胞相似，并可自组织形成具有正确顶-基极性的玫瑰花环样结构20,21,22。此外，三维（3D）培养系统能够生成背侧前脑类器官，重现人类大脑皮层发育的诸多特征23,24,25,26。这两种互补的基于细胞的建模方法为解析PC在大脑皮层正常与病理发育过程中的作用提供了令人振奋的研究前景。

在此，我们提供了生成和鉴定神经玫瑰花环结构及其衍生的神经干细胞前体细胞（NSPCs）以及背侧前脑类器官的详细方案。我们还提供了通过检测音猬因子（Sonic Hedgehog）信号通路的转导情况以及分析该通路中关键分子的动力学变化，来研究NSPCs上初级纤毛（PC）生物发生与功能的详细实验方法。为了充分利用大脑类器官的三维结构优势，我们还建立了一种简单且经济高效的三维成像方法 整体上 经免疫染色的脑类器官可通过光片显微镜实现快速、高分辨率的全类器官成像，从而在所有类型的新皮质前体细胞及全类器官神经元中可视化纤毛（PC）。最后，我们优化了针对150 µm游离脑片的免疫组织化学染色流程，结合后续透明化处理及共聚焦共振扫描显微镜成像，获得高分辨率图像，以满足纤毛发生与功能的精细分析需求。具体而言，三维成像软件可实现纤毛的三维重建，并进一步分析其形态学参数，包括纤毛长度、数量、取向，以及沿轴丝分布的纤毛组分信号强度。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 基于二维人诱导多能干细胞的新生皮层发育模型的构建

  1. 神经玫瑰花环形成
    1. 从具有大而规则集落的hIPSC培养物开始，集落分化程度低于10%，融合度不超过80%。
    2. 用2 mL PBS冲洗hIPSC。
    3. 加入2 mL添加了Rho激酶抑制剂的NSPC诱导培养基（NIM + 10 µM Y-27632）。
    4. 使用针头将一个35 mm培养皿中的每个hIPSC集落进行手动解剖，沿水平和垂直方向精确切割，形成棋盘状图案，使每个集落均等分割为多个小簇。
    5. 用细胞刮刀将集落刮下，并转移至超低吸附性35 mm培养皿中。
    6. 在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中过夜（ON）悬浮培养，使其形成类胚体（EB）。
      NOTE: 类胚体（EB）定义为悬浮的球形hIPSC细胞簇或聚集体。
    7. 将EB转移至经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PO/lam）包被的35 mm培养皿中，加入2 mL NIM + 10 µM Y-27632。
    8. 每日更换NSPC诱导培养基（不含Y-27632的NIM），直至神经玫瑰花环形成，约需12至14天。在显微镜下观察。
      ​NOTE: 此步骤后，神经玫瑰花环可进行扩增、分化，并用于免疫染色分析，或解离以获得分离的神经干细胞和前体细胞（NSPCs）。
  2. 神经玫瑰花环扩增与早期分化
    1. 用针头将神经玫瑰花环以网格状模式切割，并用细胞刮刀刮下细胞簇。
    2. 将玫瑰花环转移至4孔板中，孔内含PO/lam包被的玻璃盖玻片（每孔4-5个玫瑰花环），加入0.5 mL NSPC维持培养基（NMM）。
    3. 将培养板置于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。
    4. 每隔一天更换一次NMM，直至第20天。
    5. 从第20天起，将神经玫瑰花环培养于0.5 mL细胞因子缺失的NMM中以诱导分化。每2-3天更换一次培养基。
    6. 在第30天和第40天（即分化10或20天后），用0.5 mL 4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定20分钟。
  3. 分离NSPC中初级纤毛（PC）的生成与功能分析
    1. NSPC解离
      1. 用针头将步骤1.1.8中的神经玫瑰花环以网格状模式切割，并用细胞刮刀刮下细胞簇。将细胞转移至PO/lam包被的35 mm培养皿中，加入2 mL NMM，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。
      2. 每隔一天更换一次NMM，直至细胞达到融合（约5-7天）。
      3. 刮除围绕神经玫瑰花环的大而透明的细胞后，手动挑选玫瑰花环并转移至新的PO/lam包被的35 mm培养皿中，以富集NSPC并去除非神经细胞类型。
      4. 经过一次或两次手动传代（如需要可重复步骤1.3.1.3）以去除所有污染细胞类型后，吸除培养基并用PBS冲洗。
      5. 加入300 µL 0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟，直至大多数细胞脱落。
      6. 加入2 mL含10%胎牛血清的培养基（DMEM + 10% FBS）以终止胰酶消化。将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。轻柔吹打细胞悬液3次，以打散细胞团块。
      7. 以300 x g离心5分钟。
      8. 小心吸除上清液，将细胞重悬于NMN中。
      9. 将解离后的NSPC以单细胞形式接种（1 x 105 cells/cm2）于PO/lam包被的培养皿中，加入NMM，并在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育。
      10. 通过每隔一天更换NMM来扩增NSPC。
        NOTE: NSPC以高密度接种以避免分化。
    2. PC生成分析
      1. 将解离后的NSPC以100,000 cells/cm2的密度接种，在NMM中于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育2天。
      2. 吸除培养基，将NSPC在细胞因子缺失培养基（NSPC饥饿培养基，补充表1）中饥饿处理48小时。
      3. 用4% PFA在室温下固定20分钟。
      4. 在室温下用PBS洗涤两次，每次5分钟，然后进行免疫染色。
    3. PC功能分析：SHH信号通路
      1. 将解离后的NSPC以100,000 cells/cm2的密度接种于PO/lam包被的8孔腔室载玻片（每孔300 µL）或T25培养瓶（5 mL）中，在NMM中于37 °C、5% CO2的湿润培养箱中孵育2天。 
      2. 将NSPC在NSPC饥饿培养基中饥饿处理48小时（8孔腔室载玻片每孔300 µL，T25培养瓶5 mL）。
      3. 为激活SHH通路，将NSPC在添加重组SHH（100 ng/mL）或SAG（500 nM）的饥饿培养基中孵育24小时（8孔腔室载玻片每孔150 µL，T25培养瓶2 mL）。
      4. 用每孔250 µL 4% PFA在室温下固定8孔腔室载玻片上的NSPC20分钟，然后在室温下用250 µL PBS洗涤两次，每次5分钟，再进行免疫染色分析。
      5. 吸除培养基，并用PBS洗涤T25培养瓶中的NSPC。
      6. 加入500 µL 0.05%胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟，直至细胞脱落。
      7. 加入2 mL含10% FBS的培养基（DMEM + 10% FBS）以终止胰酶消化，并将细胞悬液收集至15 mL锥形管中。
      8. 以300 x g离心5分钟，小心吸除上清液，获得NSPC沉淀，可于-80 °C冻存，用于后续RNA提取及RT-PCR分析。

2. 背侧前脑类器官的生成

  1. 人诱导多能干细胞的单细胞培养
    1. 从人诱导多能干细胞（hIPSC）培养物开始，要求细胞集落大且形态规则，分化比例低于10%，并已传代约一次。确保细胞融合度不超过80%。
    2. 用 2 mL PBS 清洗菌落。
    3. 加入500 µL温和细胞解离试剂（GCDR），在37 °C孵育5至7分钟。
    4. 吸除 GCDR，加入 2 mL 添加了 5 µM Y-27632 的 mTeSR1 培养基。
    5. 轻轻吹打细胞，上下混匀10次，以将所有细胞团解离为单细胞。
    6. 将细胞转移至包被有玻连蛋白的培养皿中，在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中孵育2.
      ​注意：在开展分化实验之前，需使用 GCDR 对 hIPSCs 进行至少一次传代，以使 hIPSCs 适应单细胞培养条件。
  2. 第0天，将人诱导多能干细胞（hIPSCs）置于含低浓度FGF2和高浓度ROCK抑制剂的EB培养基中，使其形成拟胚体，其中ROCK抑制剂为hIPSC存活所必需。具体操作步骤如下。
    1. 用 2 mL PBS 清洗菌落。
    2. 加入500 µL温和细胞解离试剂（GCDR），于37 °C孵育5至7分钟。
    3. 吸去GCDR，加入1 mL添加了50 µM Y-27632的EB培养基；用1 mL移液器轻轻吹打悬浮细胞，转移至15 mL锥形管中。
    4. 用2 mL添加了50 µM Y-27632的EB培养基再次冲洗，将剩余细胞转移至15 mL圆底离心管中。立即向离心管中加入3 mL添加了50 µM Y-27632的EB培养基，使用5 mL移液器轻轻吹打混匀溶液。
    5. 将解离的细胞在 100 x g 5 分钟。
    6. 轻轻吸除上清液，将细胞重悬于6 mL添加了50 µM Y-27632的EB培养基中。
    7. 以 100 x g 离心细胞 g 5 分钟。
    8. 吸弃上清液，将细胞重悬于1 mL添加了50 µM Y-27632的EB培养基中。使用1 mL移液器轻轻吹打，使细胞解离成单细胞悬液。
    9. 细胞重悬后立即进行稀释并计数。
    10. 将适量的细胞悬液（含900,000个细胞）稀释至30 mL EB培养基中，培养基中添加50 µM Y-27632和4 ng/mL bFGF，并轻轻混匀。
    11. 将9,000个细胞/孔接种至超低吸附96U板（每孔300 µL）。为避免干扰拟胚体形成，将培养板置于37 °C、5% CO₂的加湿培养箱中孵育2 第3天前不更换培养基。
  3. 神经诱导（双SMAD抑制）
    1. 第3天，确保拟胚体（EBs）直径为300–400 µm且边界规则。若两项标准均达到，则更换一半培养基（150 µL），加入含Dual SMAD抑制剂的诱导培养基-1，至第6至第7天拟胚体轮廓变亮，提示神经外胚层分化补充表 2).
    2. 第4天，更换3/4的培养基（225 µL），加入诱导培养基-1。
    3. 第6天和第8天：更换一半的诱导培养基-1（150 µL）。
  4. 类器官包埋于基底膜基质（第10天）
    1. 第10天，将拟胚体包埋于去生长因子的基底膜基质（BMM）中。
      注意：从这一步开始，始终使用无菌剪刀剪开移液器吸头的开口，以避免因反复移液而损伤类器官。
    2. 首先将约15–17个类器官转移至锥形管中。让胚体沉降后吸除培养基。加入50 µL诱导培养基-2，并将其转移至含有100 µL BMM的微量离心管中。
    3. 将基质-EB混合物铺展至超低吸附培养板孔的中央，并分散EB，以防止其发生融合。
    4. 在37 °C培养箱中孵育45分钟，使BMM凝固。
    5. 每孔加入3 mL诱导培养基-2，将培养板置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中2.
      注意：此操作应尽快完成，因为BMM在室温下会迅速凝固。
  5. 嵌入基底膜基质的类器官静态培养
    1. 第12天、第14天：更换诱导培养基-2。
    2. 第16天：更换诱导培养基-2，并在显微镜下观察神经上皮环的扩展情况。
  6. 基底膜基质解离及在轨道摇床上的培养
    1. 第17天，使用5 mL移液器将类器官从BMM中上下吹打10次进行解离，并转移至分化培养基-1（不含维生素A）中。置于37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中，以80 rpm在摇床上孵育。2 以改善营养吸收。
      注意：使用不同的培养箱分别进行静置培养和摇床培养，以避免振荡对贴壁性人诱导多能干细胞（hIPS细胞）生长产生不利影响。
    2. 第19天：更换分化培养基-1。
    3. 第21天：将分化培养基-1更换为分化培养基-2（含维生素A）。
    4. 从第23天到第35天：每2-3天用分化培养基-2更换培养基。
    5. 从第35天到第70天：使用含1% BMM的分化培养基-2进行换液，每2-3天更换一次。
    6. 在分化第28、42和70 ± 2天收集类器官，加入5 mL 4%多聚甲醛置于15 mL锥形管中，于4 °C固定过夜。
    7. 进一步 整体上 用于游离免疫染色分析时，类器官用 PBS 洗涤两次后，置于含 0.05% 叠氮化钠的 PBS 中，4 °C 保存。
    8. 对于冷冻切片的免疫染色分析，将4%多聚甲醛固定的类器官浸入10 mL 30%蔗糖溶液中，4 °C过夜（或直至类器官沉底）。将类器官包埋于冷冻包埋剂中，-80°C保存，直至进行冷冻切片。

3. 整体上 背侧前脑类器官的免疫标记、透明化及光片成像

  1. 固定
    1. 收集6孔板中的类器官，去除培养基，加入2 mL 4%多聚甲醛，在4 °C下固定过夜。
    2. 在室温下用2 mL PBS洗涤三次。
    3. 将类器官转移至2 mL离心管中，加入2 mL PBS + 0.05%叠氮化钠，于4 °C保存。
  2. 通透处理
    1. 在含有0.2% Triton X100的1 mL PBS中，室温孵育类器官1小时，重复两次。
    2. 在含有0.2% Triton X100和20% DMSO的1 mL PBS中，37 °C下孵育过夜。
    3. 在含有0.1% Tween20、0.1% Triton X100、0.1%脱氧胆酸钠、0.1% NP40和20% DMSO的1 mL PBS中，37 °C下孵育过夜。
    4. 在含有0.2% Triton-X100的1 mL PBS中，室温孵育1小时，重复两次。
  3. 封闭与免疫标记
    1. 在封闭液（PBS、0.2% Triton X100、6%驴血清、10% DMSO）中，37 °C下封闭过夜。
    2. 将一抗用含0.2% Tween20、0.1 µg/mL肝素、5% DMSO和3%驴血清的250 µL PBS稀释后，37 °C孵育2天。
    3. 在含0.2% Tween20和0.1 µg/mL肝素的1 mL PBS中，37 °C下洗涤1小时，重复四次。
    4. 在含0.2% Tween20和0.1 µg/mL肝素的1 mL PBS中，37 °C下过夜洗涤。
    5. 将二抗用含0.2% Tween20、0.1 µg/mL肝素和3%驴血清的250 µL PBS稀释后，37 °C孵育2天。
    6. 在含0.2% Tween20和0.1 µg/mL肝素的1 mL PBS中，室温下置于摇床上洗涤1小时，重复四次。
    7. 在含0.2% Tween20和0.1 µg/mL肝素的1 mL PBS中，室温下置于摇床上过夜洗涤。
    8. 在1 mL PBS中，室温下洗涤24小时。
    9. 在1 mL PBS和0.05%叠氮化钠中，于+4 °C保存，直至进行透明化处理。
  4. TDE（2,2′-硫代二乙醇）透明化
    1. 将类器官置于1 mL 30% TDE（3 mL TDE + 7 mL PBS）中，室温孵育24小时。
    2. 在1 mL 60% TDE（6 mL TDE + 4 mL PBS）中，室温孵育24小时。
    3. 在1 mL 80% TDE（8 mL TDE + 2 mL PBS）中，室温孵育24小时。
  5. 光片显微成像前的类器官包埋
    注意：使用自制系统，即用手术刀片切去尖端的1 mL注射器。
    1. 制备100 mL含4%低熔点琼脂糖的60% TDE溶液，并分装至2 mL离心管中，于+4 °C保存。
    2. 在包埋类器官前，将含1.5 mL 4%低熔点琼脂糖的60% TDE溶液的离心管置于37 °C水浴中加热至完全液化。
    3. 同时，使用手术刀片切去1 mL注射器的尖端，制备自制的模具系统。
    4. 用活塞将600 µL凝胶溶液吸入注射器中。
    5. 使用经无菌剪刀剪大开口的加长型移液器吸头定位样品。
    6. 向注射器中加入400 µL凝胶溶液，使样品位于注射器下三分之一处。
    7. 让凝胶聚合，并在避光条件下于4 °C的80% TDE溶液中保存，直至成像。
    8. 进行光片成像时，使用20倍物镜，并将80% TDE溶液加入样品室中，以精确匹配透明化方法的折射率。
    9. 将含有琼脂糖包埋类器官的注射器插入专为容纳1 mL注射器设计的最大样品架中，通过推动活塞调节类器官位置，使其位于物镜前方。
      ​注意：完整类器官的光片成像大约需要5至10分钟。

4. 背侧前脑类器官游离切片的免疫染色与透明化

  1. 类器官的固定、琼脂糖包埋与切片
    1. 在分化第28、42和70 ± 2天时，从6孔板中收集类器官，并在4 °C条件下用2 mL 4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。
    2. 用2 mL PBS洗涤两次，随后在4 °C条件下用2 mL PBS + 0.05%叠氮化钠保存。
    3. 将固定的类器官包埋于塑料包埋模具（7 × 7 mm）中的4%低熔点琼脂糖中。小心将琼脂糖块从塑料模具中取出，并将其粘附至振动切片机的载物台上。
    4. 使用振动切片机对包埋的类器官进行切片，获得150 µm厚的游离切片，并用画笔将其转移至含有500 µL PBS的24孔板孔中，以避免切片受损。
      注意：推荐使用低熔点琼脂糖，因其熔点仅约60 °C。将4%低熔点琼脂糖溶于PBS溶液中，包埋前置于水浴中冷却至略高于37 °C备用。
  2. 通透、封闭与免疫染色
    1. 将切片置于含0.3% Triton X100的500 µL PBS中，在室温下振荡孵育20分钟，重复三次。
    2. 将切片置于含0.3% Triton X100和5%脱脂奶粉的500 µL PBS中，在室温下振荡孵育2小时。
    3. 将切片置于250 µL一抗溶液（PBS + 0.3% Triton X100 + 1%脱脂奶粉）中，在+4 °C条件下振荡孵育过夜。
    4. 用500 µL PBS在室温下振荡洗涤切片，每次20分钟，共洗涤四次。
    5. 将切片置于250 µL二抗溶液（PBS + 0.3% Triton X100 + 1%脱脂奶粉）中，在室温下振荡孵育2小时。
    6. 用500 µL PBS在室温下振荡洗涤切片，每次20分钟，共洗涤四次。
    7. 将切片保存于500 µL PBS中，置于+4 °C直至透明化处理。
  3. 使用TDE（2,2′-硫代二乙醇）透明化
    1. 将切片先后在500 µL 30%和60% TDE溶液中各孵育1小时（室温），随后在500 µL 80% TDE溶液中于室温下孵育过夜。
    2. 将透明化后的切片保存于500 µL 80% TDE溶液中，置于+4 °C直至成像。
  4. 共振扫描共聚焦显微镜成像前的游离切片封片
    1. 将一片游离切片封于密封腔室中，该腔室可使样本保持在80% TDE溶液中，并设计为适配共聚焦显微镜的电动XY载物台。
    2. 在腔室系统中放入一个圆形盖玻片。
    3. 使用画笔小心转移已透明化的免疫染色切片。
    4. 向腔室中加入80% TDE溶液至充满。
    5. 添加两个标准盖玻片、一个额外的圆形盖玻片以及一个硅胶密封圈。
    6. 旋紧腔室的螺纹环，以完全密封系统。

5. 光片与共振扫描共聚焦分析

  1. 使用能够实现整个免疫染色样本三维可视化与分析的软件处理光片成像和共振扫描采集的数据。
    注意：此类软件可快速打开海量数据，便于生成快照和动画；可通过二维切片工具在不同方向（例如 XY 和 YZ）对样本进行多角度移动并生成二维视图。
  2. 为自动检测中心体和初级纤毛，使用点状结构识别向导工具，以量化病理条件与对照条件下的数量差异。
  3. 为实现初级纤毛（PC）的三维重建并精确测量其长度，使用纤维状结构识别向导工具手动设定 PC 的起始点，软件将基于荧光信号精确重建 PC 结构。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

用于研究初级纤毛发生及其功能的2D人诱导多能干细胞模型
本方案改编自先前已发表的研究20,21,22。该方案可用于生成包含新皮质前体细胞和神经元的神经玫瑰花环样结构，其特征类似于发育中新皮质中的细胞组成。可通过使用特异性标记物进行常规免疫染色分析，对模型进行详细验证3。例如，顶端前体细胞（AP）应同时表达SOX2和PAX6，中间前体细胞（IP）可通过TBR2/EOMES染色识别，而早期生成的新皮质神经元则可通过CTIP2染色识别（图1A-C）。此类神经玫瑰花环样结构可模拟AP的核间期迁移（INM），该过程可通过使用抗磷酸化波形蛋白抗体（标记有丝分裂期细胞核）和抗TPX2抗体（标记有丝分裂纺锤体）进行免疫染色观察。因此，这些标记物可用于分析...

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讨论

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初级纤毛（PC）现被视为调节正常大脑皮层发育关键步骤的关键细胞器18,19,31，包括神经干细胞/前体细胞（NSPC）的扩增与命运决定8,9,10,11,12，以及神经元迁移13,14和突触形成16,17。除了在动物模型或人类胎儿脑组织中进行分析外，建立基于患者来源的人诱导多能干细胞（hIPSC）的...

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披露

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作者声明无利益冲突。

致谢

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本工作获得了法国国家研究署（ANR）向 S.T.（项目编号：ANR-17-CE16-0003-01）和 N.B.B.（项目编号：ANR-16-CE16-0011 和 ANR-19-CE16-0002-01）提供的资助。LB 获得了法国国家研究署“未来投资计划”（Investissements d'avenir）项目（ANR-10-IAHU-01）以及贝当古舒勒基金会（Fondation Bettencourt Schueller）（MD-PhD 项目）的支持。伊马金研究所（Imagine Institute）获得了法国国家研究署“未来投资计划”（Investissements d'avenir）项目（ANR-10-IAHU-01，CrossLab 项目）的国家资金支持，并作为第二期“未来投资计划”（ANR-17-RHUS-0002）的一部分获得资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
2-巯基é乙醇（50 mM）赛默飞世尔科技31350010
6孔透明平底超低吸附多孔板康宁3471
96孔透明圆底超低吸附微孔板康宁7007
B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A赛默飞世尔科技12587010
B-27添加剂（50倍浓缩，无血清）赛默飞世尔科技17504044
CellAdhere 稀释缓冲液StemCell Technologies7183
DMEM/F-12，GlutamaxThermoFisher Scientific31331028
DMSOATCC4-X
DorsomorphinStemCell Technologies72102
易握型 35 10毫米Falcon353001
EDTA赛默飞世尔科技15575020
EGF，25µg赛默飞世尔科技PHG0315
FGF2，25µg赛默飞世尔科技PHG0264
温和细胞解离试剂StemCell Technologies7174
胰岛素赛默飞世尔科技12585014
KnockOut血清赛默飞世尔科技10828028
层粘连蛋白（1 mg）赛默飞世尔科技23017015
LDN193189StemCell Technologies72147
基质胶生长因子减少型康宁354230
MEM非必需氨基酸溶液（100X）赛默飞世尔科技11140050
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381-250G
mTeSR1StemCell Technologies85850
神经基础培养基Thermofischer21103049
轨道摇床Dutscher995002
PBS赛默飞世尔科技14190094
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）赛默飞世尔科技15140122
PFA 32%电子显微镜科学公司15714
聚-L-鸟氨酸（PO）SigmaP4957
重组人 BDNF 10 µg干细胞技术78005
重组人碱性成纤维细胞生长因子Peprotech100-18B
rSHHR&D Systems8908-SH
SAGSanta CruzSc-202814
SB431542StemCell Technologies72232
Stembeads FGF2干细胞培养SB500
蔗糖Sigma AldrichS7903-250G
Superfrost Plus 黏附载玻片赛默飞世尔科技J1800AMNZ
补充éN2-（100倍浓缩）赛默飞世尔科技17502048
TDE 2,2’-硫代二乙醇Sigma Aldrich166782-500G
玻璃粘连蛋白StemCell Technologies7180
Y-27632StemCell Technologies72304
<强>一抗
ARL13BAbcamAb1366481/200e
ARL13BProteintech17711-1-AP1/500e
CTIP2AbcamAb184651/500e
GLI2R&D SystemsAF35261/100
GPR161Proteintech13398-1-AP1/100
N-钙黏蛋白BD 转导实验室6109211/500e
P-波形蛋白MBLD076-31/500e
PAX6BiolegendPRB-278P1/200e
PCNTAbcamAb44481/1000
S0X2R&D SystemsMAB20181/200e
SATB2AbcamAb515021/200e
TBR2AbcamAb2168701/400e
TPX2NovusBioNB500-1791/500e
γ微管蛋白Sigma AldrichT65571/500e
<强>二抗
驴抗兔 AF488赛默飞世尔科技A212061/500e
山羊抗小鼠 AF555赛默飞世尔科技A214221/500e
山羊抗小鼠 AF647赛默飞世尔科技A212361/500e
山羊抗大鼠 AF555赛默飞世尔科技A214341/500e

参考文献

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