我们提供了生成和表征基于人诱导性多能干细胞（hIPSC）的2D和3D新皮质发育模型的详细方案，以及用于定性和定量分析初级纤毛（PC）发生与功能的互补方法。
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方法文章
基于人诱导性多能干细胞的二维和三维模型解析初级纤毛在新皮质发育中的作用
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
初级纤毛（PC）是一种非运动性的、基于微管的动态细胞器，突出于大多数哺乳动物细胞表面。它们在细胞周期的G1/G0期从较老的中心粒上形成，而在细胞于G2/M期边界重新进入细胞周期时发生解聚。初级纤毛作为信号枢纽，能够感知并转导对多种细胞过程至关重要的胞外信号。与大多数细胞类型相似，所有新皮质神经干细胞和前体细胞（NSPCs）均被证实具有初级纤毛，使其能够感知并转导新皮质正常发育所必需的特定信号。本文提供了从人诱导性多能干细胞（hIPSCs）建立和表征二维（2D）及三维（3D）细胞模型的详细方案，以进一步解析初级纤毛在新皮质发育过程中的作用。具体而言，我们展示了在2D神经玫瑰花结来源的NSPCs中研究初级纤毛生成及其功能的实验方案，包括Sonic Hedgehog（SHH）信号通路的转导分析。为了充分利用脑类器官的三维（3D）结构特征，我们描述了一种用于3D成像的简便方法 整体上 免疫染色的大脑类器官。经过光学透明化处理后，可快速获取整个类器官的完整图像，从而检测全类器官中新皮层前体细胞和神经元中的中心体和初级纤毛（PC）。最后，我们详细描述了对较厚的游离类器官切片进行免疫染色和透明化处理的步骤，该方法在很大程度上保留了三维空间信息，能够实现高分辨率成像，适用于初级纤毛（PC）发生及其功能的定性和定量精细分析。
引言
初级纤毛（PC） 是一类以微管为基础的细胞器，能够感知并转导来自细胞外环境的多种化学和机械信号。特别是，PC 是脊椎动物中 Hedgehog 信号通路转导的核心细胞器1,2。尽管长期以来已知大多数神经细胞均含有 PC，但该细胞器在中枢神经系统发育过程中的作用长期以来一直被低估。 关于新皮质发育的研究已发现多种神经干细胞和前体细胞（NSPCs），它们均具有 PC，且其位置被认为在前体细胞命运决定中起关键作用3,4,5,6,7。研究表明，PC 对于正常大脑皮层发育所必需的多种细胞机制至关重要，包括 NSPC 的扩增与定向分化8,9,10,11,12，以及支....
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方案
1. 基于二维人诱导多能干细胞的新生皮层发育模型的构建
- 神经玫瑰花环形成
- 从具有大而规则集落的hIPSC培养物开始，集落分化程度低于10%，融合度不超过80%。
- 用2 mL PBS冲洗hIPSC。
- 加入2 mL添加了Rho激酶抑制剂的NSPC诱导培养基（NIM + 10 µM Y-27632）。
- 使用针头将一个35 mm培养皿中的每个hIPSC集落进行手动解剖，沿水平和垂直方向精确切割，形成棋盘状图案，使每个集落均等分割为多个小簇。
- 用细胞刮刀将集落刮下，并转移至超低吸附性35 mm培养皿中。
- 在37 °C、5% CO2的湿润培养箱中过夜（ON）悬浮培养，使其形成类胚体（EB）。
NOTE: 类胚体（EB）定义为悬浮的球形hIPSC细胞簇或聚集体。 - 将EB转移至经多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白（PO/lam）包被的35 mm培养皿中，加入2 mL NIM + 10 µM Y-27632。
- 每日更换NSPC诱导培养基（不含Y-27632的NIM），直至神经玫瑰花环形成，约需12至14天。在显微镜下观察。
NOTE: 此步骤后，神经玫瑰花环可进行扩增、分化，并用于免疫染色分析，或解离以获得分离的神经干细胞....
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结果
利用二维人诱导多能干细胞模型研究初级纤毛的形成与功能
本方案改编自先前已发表的研究20,21,22。该方案可用于生成包含新皮质前体细胞和神经元的神经玫瑰花环样结构，其特征与发育中新皮质中的细胞相似。可通过使用特异性标记物进行常规免疫染色分析来完成详细的验证3。例如，顶端前体细胞（AP）应同时表达SOX2和PAX6，中间前体细胞（IP）可通过TBR2/EOMES染色识别，而早期生成的新皮质神经元则可通过CTIP2染色显示（图1A-C）。此类类似神经玫瑰花环的结构可模拟AP的核间期迁移（INM），该过程可通过使用抗磷酸化波形蛋白抗体进行免疫染色来观察，该抗体标记有丝分裂期细胞核，以及标记有丝分裂纺锤体的TPX2。因此，这些标记物可用于分析AP.......
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讨论
初级纤毛（PC）现被视为调节正常大脑皮层发育关键步骤的关键细胞器18,19,31，包括神经干细胞/前体细胞（NSPC）的扩增与命运决定8,9,10,11,12，以及神经元迁移13,14和突触形成16,17。除了在动物模型或人类胎儿脑组织中进行分析外，建立基于患者来源的人诱导多能干细胞（hIPSC）的.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作获得了法国国家研究署（ANR）向 S.T.（项目编号：ANR-17-CE16-0003-01）和 N.B.B.（项目编号：ANR-16-CE16-0011 和 ANR-19-CE16-0002-01）提供的资助。LB 获得了法国国家研究署“未来投资计划”（Investissements d'avenir）项目（ANR-10-IAHU-01）以及贝当古舒勒基金会（Fondation Bettencourt Schueller）（MD-PhD 项目）的支持。伊马金研究所（Imagine Institute）获得了法国国家研究署“未来投资计划”（Investissements d'avenir）项目（ANR-10-IAHU-01，CrossLab 项目）的国家资金支持，并作为第二期“未来投资计划”（ANR-17-RHUS-0002）的一部分获得资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基é乙醇（50 mM） | 赛默飞世尔科技 | 31350010 | |
| 6孔透明平底超低吸附多孔板 | 康宁 | 3471 | |
| 96孔透明圆底超低吸附微孔板 | 康宁 | 7007 | |
| B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素A | 赛默飞世尔科技 | 12587010 | |
| B-27添加剂（50倍浓缩，无血清） | 赛默飞世尔科技 | 17504044 | |
| CellAdhere 稀释缓冲液 | StemCell Technologies | 7183 | |
| DMEM/F-12，Glutamax | ThermoFisher Scientific | 31331028 | |
| DMSO | ATCC | 4-X | |
| Dorsomorphin | StemCell Technologies | 72102 | |
| 易握型 35 10毫米 | Falcon | 353001 | |
| EDTA | 赛默飞世尔科技 | 15575020 | |
| EGF，25µg | 赛默飞世尔科技 | PHG0315 | |
| FGF2，25µg | 赛默飞世尔科技 | PHG0264 | |
| 温和细胞解离试剂 | StemCell Technologies | 7174 | |
| 胰岛素 | 赛默飞世尔科技 | 12585014 | |
| KnockOut血清 | 赛默飞世尔科技 | 10828028 | |
| 层粘连蛋白（1 mg） | 赛默飞世尔科技 | 23017015 | |
| LDN193189 | StemCell Technologies | 72147 | |
| 基质胶生长因子减少型 | 康宁 | 354230 | |
| MEM非必需氨基酸溶液（100X） | 赛默飞世尔科技 | 11140050 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma Aldrich | 81381-250G | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| 神经基础培养基 | Thermofischer | 21103049 | |
| 轨道摇床 | Dutscher | 995002 | |
| PBS | 赛默飞世尔科技 | 14190094 | |
| 青霉素-链霉素（10,000 U/mL） | 赛默飞世尔科技 | 15140122 | |
| PFA 32% | 电子显微镜科学公司 | 15714 | |
| 聚-L-鸟氨酸（PO） | Sigma | P4957 | |
| 重组人 BDNF 10 µg | 干细胞技术 | 78005 | |
| 重组人碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| rSHH | R&D Systems | 8908-SH | |
| SAG | Santa Cruz | Sc-202814 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Stembeads FGF2 | 干细胞培养 | SB500 | |
| 蔗糖 | Sigma Aldrich | S7903-250G | |
| Superfrost Plus 黏附载玻片 | 赛默飞世尔科技 | J1800AMNZ | |
| 补充éN2-（100倍浓缩） | 赛默飞世尔科技 | 17502048 | |
| TDE 2,2’-硫代二乙醇 | Sigma Aldrich | 166782-500G | |
| 玻璃粘连蛋白 | StemCell Technologies | 7180 | |
| Y-27632 | StemCell Technologies | 72304 | |
| <强>一抗 | |||
| ARL13B | Abcam | Ab136648 | 1/200e |
| ARL13B | Proteintech | 17711-1-AP | 1/500e |
| CTIP2 | Abcam | Ab18465 | 1/500e |
| GLI2 | R&D Systems | AF3526 | 1/100 |
| GPR161 | Proteintech | 13398-1-AP | 1/100 |
| N-钙黏蛋白 | BD 转导实验室 | 610921 | 1/500e |
| P-波形蛋白 | MBL | D076-3 | 1/500e |
| PAX6 | Biolegend | PRB-278P | 1/200e |
| PCNT | Abcam | Ab4448 | 1/1000 |
| S0X2 | R&D Systems | MAB2018 | 1/200e |
| SATB2 | Abcam | Ab51502 | 1/200e |
| TBR2 | Abcam | Ab216870 | 1/400e |
| TPX2 | NovusBio | NB500-179 | 1/500e |
| γ微管蛋白 | Sigma Aldrich | T6557 | 1/500e |
| <强>二抗 | |||
| 驴抗兔 AF488 | 赛默飞世尔科技 | A21206 | 1/500e |
| 山羊抗小鼠 AF555 | 赛默飞世尔科技 | A21422 | 1/500e |
| 山羊抗小鼠 AF647 | 赛默飞世尔科技 | A21236 | 1/500e |
| 山羊抗大鼠 AF555 | 赛默飞世尔科技 | A21434 | 1/500e |
参考文献
- Huangfu, D., et al. Hedgehog signalling in the mouse requires intraflagellar transport proteins. Nature. 426 (6962), 83-87 (2003).
- Goetz, S. C., Anderson, K. V. The primary cilium: a signalling centre during vertebrate development. Nature Reviews. ....
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重印与许可
