树脂辅助捕获联合等重串联质谱标签标记用于多重定量蛋白质硫醇氧化

摘要

蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术，能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。

摘要

蛋白质硫醇的可逆氧化修饰最近被发现是调控细胞功能的重要介质。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法，该方法结合树脂辅助捕获（RAC）、串联质谱标签（TMT）等压标记以及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS），可在蛋白质组水平上实现对氧化蛋白质硫醇的多重化学计量定量。针对氧化半胱氨酸残基的位点特异性定量信息，为进一步理解此类修饰的功能影响提供了重要线索。

该实验流程适用于多种样本类型，包括培养细胞（如哺乳动物细胞、原核细胞）和完整组织（如心脏、肺、肌肉）。样本首先经过裂解或匀浆处理，并对游离巯基进行烷基化修饰，以防止发生人工氧化。随后，被氧化的蛋白质巯基被还原，并通过巯基亲和树脂进行富集捕获。该树脂可简化后续操作流程，使得消化、标记和洗涤步骤无需额外转移蛋白质或多肽即可完成。最后，洗脱标记后的肽段并采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行分析，从而全面揭示整个蛋白质组中与巯基氧化相关的化学计量变化。该方法显著提升了对生理及病理生理状态下蛋白质巯基氧化介导的氧化还原依赖性调控作用的理解。

引言

在稳态条件下，细胞会产生活性氧、活性氮和活性硫物质，这些物质有助于促进代谢和信号传导等过程^1,2,3，该现象存在于原核生物和真核生物中。这些活性物质的生理水平对于细胞正常功能至关重要，也被称为“良性应激”（eustress）^1,4。相反，氧化剂增加导致氧化剂与抗氧化剂之间失衡时，可引发氧化应激，即“不良应激”（distress）¹，从而造成细胞损伤。氧化剂通过修饰多种生物分子（包括蛋白质、DNA、RNA和脂质）将信号传递至生物学通路。其中，蛋白质中的半胱氨酸残基因其含有对多种氧化剂具有高反应活性的巯基，成为易受氧化的关键位点⁵。这导致半胱氨酸发生多种可逆的基于氧化还原的翻译后修饰（PTMs），包括亚硝基化（SNO）、谷胱甘肽化（SSG）、次磺酰化（SOH）、过硫化（SSH）、多硫化（SS_nH）、酰化以及二硫键形成。而半胱氨酸的不可逆氧化形式则包括亚磺酰化（SO₂H）和磺酰化（SO₃H）。

半胱氨酸残基的可逆氧化修饰可....

方案

本方案中所述所有涉及动物或人类样本/组织的实验程序均经人类与动物研究伦理委员会批准，并遵循其机构指南。

1. 样品匀浆/裂解

1. 冷冻组织样本
   1. 在干冰上，使用预冷的刀片和镊子将冷冻组织（约 30 mg）在玻璃载玻片上切碎。将切碎的组织转移至预冷的 5 mL 圆底聚苯乙烯管中，加入 700 µL 缓冲液 A（见表 1），在冰上孵育 30 分钟，避光。
   2. 使用手持式组织匀浆器匀浆 30 秒，或直至组织完全均质化。将样品置于冰上，静置 10 分钟以使泡沫消退。
      注意：将铝制烤盘放置于干冰上可提供稳定的操作平台，便于组织的初始处理和切碎。
2. 或者，使用 100 mm 培养皿中的贴壁细胞培养物作为起始材料。
   1. 将细胞置于冰上，用含有 100 mM NEM 的 10 mL 冰冷 PBS 通过移液管冲洗细胞两次。
   2. 加入 1 mL 冷的匀浆/裂解缓冲液，用坚硬的细胞刮刀剧烈刮取以裂解细胞。使用移液器将裂解液转移至 2 mL 离心管中。
      注意：冲洗缓冲液和裂解缓冲液可根据不同规格的培养容器按比例调整。通常需要 200 万至 500 万个细胞；然而，具体数量取决于裂解效率和特定细胞类型的蛋白得率。若样品用于总巯基分析，匀浆缓冲液可不添加 NEM。

结果

完成该方案将实现对 formerly oxidized 含半胱氨酸肽段的高度特异性富集，通常具有 >95% 特异性^27,35,36然而，该方案的若干关键步骤需要特别注意，例如在样品裂解/匀浆前对游离巯基进行初始封闭，以防止巯基发生人为氧化及非特异性富集人为氧化的巯基²⁵样品可在实验方案的多个阶段通过不同方法进行分析，包括对蛋白质和多肽进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE可用于样品的定性分析，其中总巯基样品可实现样本间的比率比较，以确定因处理或刺激导致的氧化水平差异。图2A）。为了进一步研究单个蛋白质的氧化水平，可将SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹分析³⁶ (图2B）。这使得能够对模型系统进行更详细的分析，生成支持性数据，并进一.......

讨论

树脂辅助捕获技术已广泛应用于多种样本类型和生物系统，用于研究半胱氨酸残基的氧化修饰^25,29,30。该方法可在多个层面和检测方式下对样本进行评估，包括利用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测蛋白质和多肽，以及利用质谱技术检测单个半胱氨酸位点。无论样本类型或最终检测终点如何，该方法最终均可实现对含半胱氨酸的蛋白质和多肽的高度高效且特异性的富集³⁸。通过使用RAC技术，我们已在不同模型系统中检测到扰动后多达数千个半胱氨酸位点的氧化状态变化。

在经历疲劳性肌肉收缩的小鼠中，2,200 S-谷胱甘肽化位点被鉴定出来，其中超过一半的位点谷胱甘肽化水平发生显著改变 S-谷胱甘肽化³²RAC 也已用于分析可逆性硫醇氧化的特征 >蓝细菌在暴露于光合作用抑制剂或不同光照条件后出.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-(吡啶二硫)乙胺盐酸盐	Med Chem Express	HY-101794	用于实验室自制树脂的试剂
2.0 mL LoBind 离心管	Eppendorf	22431048
5.0 mL LoBind 离心管	Eppendorf	30108310
5.0 mL 圆底管	Falcon	352054
丙酮	赛默飞世尔科技	A949-1
乙腈	Sigma Aldrich	34998
活化硫醇–Sepharose 4B	Sigma Aldrich	T8512	硫醇亲和树脂的潜在替代品
Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器	Millipore Sigma	UFC5010BK
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	09830
双辛可宁酸（BCA）	Thermo Scientific	23227	蛋白质检测试剂
离心机	Eppendorf	5810R
离心机	Eppendorf	5415R
二硫苏糖醇（DTT）	Thermo Scientific	20291
EDTA	Sigma Aldrich	E5134
HEPES 缓冲液	Sigma Aldrich	H4034
匀浆器	BioSpec Products	985370
碘乙酰胺（IAA）	Sigma Aldrich	I1149
N-乙基马来酰亚胺	Sigma Aldrich	4259
NHS-活化 Sepharose 4 Fast Flow	Cytiva	17-0906-01	用于实验室自制树脂的试剂
QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置	Qiagen	19413
氯化钠	Sigma Aldrich	S3014
十二烷基硫酸钠（SDS）	Sigma Aldrich	L6026
超声破碎仪	Branson	1510R-MT
离心柱	Thermo Scientific	69705
Strata C18-E 反相柱	Phenomenex	8B-S001-DAK	肽段脱盐
恒温混匀仪	Eppendorf	5355
硫丙基 Sepharose 6B	GE Healthcare	17-0420-01	硫醇亲和树脂；*该树脂的生产已被制造商停止（详见实验方案说明）。
TMT 同重同位素标签（16-plex）	Thermo Scientific	A44522	肽段标记试剂；有多种规格可选
三乙基碳酸氢铵缓冲液（TEAB）	Sigma Aldrich	T7408
三氟乙酸（TFA）	Sigma Aldrich	T6508
吐温 X-100	Sigma Aldrich	T8787
胰蛋白酶	Promega	V5820
尿素	Sigma Aldrich	U5378
Vacufuge Plus 真空浓缩仪	Eppendorf	22820001	真空浓缩装置
涡旋混合器	Scientific Industries	SI-0236