蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法,该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术,能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。
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蛋白质巯基氧化在正常生理和病理生理条件下具有重要意义。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法,该方法利用树脂辅助捕获、等重标记和质谱技术,能够实现对蛋白质中可逆氧化半胱氨酸残基的位点特异性鉴定与定量分析。
蛋白质硫醇的可逆氧化修饰最近被发现是调控细胞功能的重要介质。本文详细描述了一种定量氧化还原蛋白质组学方法,该方法结合树脂辅助捕获(RAC)、串联质谱标签(TMT)等压标记以及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),可在蛋白质组水平上实现对氧化蛋白质硫醇的多重化学计量定量。针对氧化半胱氨酸残基的位点特异性定量信息,为进一步理解此类修饰的功能影响提供了重要线索。
该实验流程适用于多种样本类型,包括培养细胞(如哺乳动物细胞、原核细胞)和完整组织(如心脏、肺、肌肉)。样本首先经过裂解或匀浆处理,并对游离巯基进行烷基化修饰,以防止发生人工氧化。随后,被氧化的蛋白质巯基被还原,并通过巯基亲和树脂进行富集捕获。该树脂可简化后续操作流程,使得消化、标记和洗涤步骤无需额外转移蛋白质或多肽即可完成。最后,洗脱标记后的肽段并采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)进行分析,从而全面揭示整个蛋白质组中与巯基氧化相关的化学计量变化。该方法显著提升了对生理及病理生理状态下蛋白质巯基氧化介导的氧化还原依赖性调控作用的理解。
在稳态条件下,细胞会产生活性氧、活性氮和活性硫物质,这些物质有助于促进代谢和信号传导等过程1,2,3,该现象存在于原核生物和真核生物中。这些活性物质的生理水平对于细胞正常功能至关重要,也被称为“良性应激”(eustress)1,4。相反,氧化剂增加导致氧化剂与抗氧化剂之间失衡时,可引发氧化应激,即“不良应激”(distress)1,从而造成细胞损伤。氧化剂通过修饰多种生物分子(包括蛋白质、DNA、RNA和脂质)将信号传递至生物学通路。其中,蛋白质中的半胱氨酸残基因其含有对多种氧化剂具有高反应活性的巯基,成为易受氧化的关键位点5。这导致半胱氨酸发生多种可逆的基于氧化还原的翻译后修饰(PTMs),包括亚硝基化(SNO)、谷胱甘肽化(SSG)、次磺酰化(SOH)、过硫化(SSH)、多硫化(SSnH)、酰化以及二硫键形成。而半胱氨酸的不可逆氧化形式则包括亚磺酰化(SO2H)和磺酰化(SO3H)。
半胱氨酸残基的可逆氧化修饰可能起到保护作用,防止进一步发生不可逆氧化,或作为信号分子参与下游细胞通路的调控6,7某些硫醇氧化还原型翻译后修饰的可逆性使得半胱氨酸位点能够发挥 "氧化还原开关"8,9,其中这些位点氧化还原状态的变化会改变蛋白质功能,从而调控其在瞬时过程中的作用。氧化还原翻译后修饰的调节作用10 在蛋白质功能的许多方面都已观察到11,包括催化作用12蛋白质-蛋白质相互作用13构象变化14金属离子配位15或药理学抑制剂结合16此外,氧化还原型翻译后修饰参与调控转录等通路的蛋白质半胱氨酸位点17,翻译18,或代谢19鉴于氧化还原翻译后修饰对蛋白质功能和生物过程具有重要影响,定量分析在氧化还原状态发生扰动时半胱氨酸位点所经历的氧化程度显得尤为重要。
对氧化还原状态发生改变的半胱氨酸位点的鉴定,主要集中于在正常与扰动条件下,对位点特异性水平上的氧化状态进行比较。通常利用倍数变化(fold change)测量来确定哪些位点发生了显著改变,这有助于研究人员判断哪些半胱氨酸位点可能在生理学上对研究具有重要意义。另一种方法是,对特定样本类型中可逆硫醇氧化的化学计量比进行测量,从而总体反映细胞氧化状态下的生理状况,这一重要测量指标常常被忽视且使用不足。修饰化学计量比的计算基于修饰型硫醇占总蛋白硫醇(包括修饰与未修饰硫醇)的百分比20,21。因此,相较于倍数变化,化学计量比测量提供了更为精确的定量结果,尤其是在使用质谱技术时。通过化学计量比来确定特定半胱氨酸位点的翻译后修饰(PTM)占据率,可以更清晰地评估氧化程度增加的生物学意义。例如,硫醇氧化水平增加3倍,可能源于修饰占据率从1%上升至3%,也可能由30%上升至90%。对于一个基础占据率仅为1%的位点,其氧化水平增加3倍可能对蛋白功能影响甚微;然而,若某位点在静息状态下的占据率已达30%,则其氧化水平增加3倍可能对蛋白功能产生更显著的影响。当化学计量比测量在总氧化硫醇与特定氧化修饰类型(如蛋白质谷胱甘肽化(SSG)和亚硝基化(SNO))之间进行时,可揭示不同修饰类型之间的比例关系及定量信息。
由于可逆性巯基氧化通常是一种丰度较低的翻译后修饰,因此已开发出多种方法用于从生物样品中富集含有此类修饰的蛋白质。Jaffrey 等人早期提出的一种方法称为生物素转换技术(biotin switch technique, BST)22,该方法包含多个步骤:首先通过烷基化封闭未修饰的巯基,然后将可逆修饰的巯基还原为新生的游离巯基,接着用生物素标记这些新生的游离巯基,最后通过链霉亲和素亲和沉淀富集标记的蛋白质。该技术已在多项研究中用于分析 SNO 和 SSG,并可进一步改造以检测其他形式的可逆性巯基氧化23,24。尽管 BST 已被用于探索多种可逆性巯基氧化形式,但该方法存在一个问题是:非特异性结合可能导致未生物素化的蛋白质与链霉亲和素结合,从而影响富集效果。我们 实验室开发了一种替代方法,称为树脂辅助捕获法(resin-assisted capture, RAC)25,26(图1),该方法避免了通过生物素-链霉亲和素系统进行巯基富集所带来的问题。
在还原可逆氧化的巯基后,含有新生游离巯基的蛋白质可通过巯基亲和 树脂进行富集,该树脂可共价捕获游离巯基,从而实现比生物素开关法(BST)更特异地富集含半胱氨酸的蛋白质。将RAC方法与近年来在等压标记和质谱技术方面的多重检测能力相结合,可建立一种稳健且灵敏的流程,用于在全蛋白质组水平上对可逆氧化的半胱氨酸残基进行富集、鉴定和定量。质谱技术的最新进展使得巯基氧化还原蛋白质组的分析深度显著增加,加深了人们对蛋白质巯基氧化因果关系的理解27。从位点特异性定量数据中获得的信息有助于进一步研究可逆氧化修饰的机制性影响及其下游效应28。利用该流程已揭示可逆半胱氨酸氧化在正常生理过程(如衰老)中的生理影响,其中S-谷胱甘肽化(SSG)水平随年龄发生变化。使用新型肽类药物SS-31(elamipretide)可在一定程度上逆转衰老引起的SSG变化,该药物可增强线粒体功能并降低老龄小鼠的SSG水平,使其SSG谱更接近于年轻小鼠29。
在小鼠巨噬细胞模型中,已证明与纳米颗粒暴露相关的病理生理状况涉及SSG。作者采用RAC联合质谱技术,表明SSG水平与氧化应激程度及巨噬细胞吞噬功能损伤程度呈直接相关性。数据还揭示了不同人工纳米材料因诱导不同程度的氧化应激,导致通路特异性的响应差异30。该方法在原核生物中也显示出其应用价值,曾被用于研究昼夜节律对光合蓝细菌中硫醇氧化的影响。研究观察到多个关键生物学过程中的硫醇氧化发生广泛变化,包括电子传递、碳固定和糖酵解。此外,通过正交验证,多个关键功能位点被证实发生氧化修饰,提示这些氧化修饰可能具有调控作用6。
本文详细描述了一种标准化的工作流程(图1),展示了RAC方法在富集蛋白质中全部氧化型半胱氨酸巯基、并对其进行后续标记与化学计量学定量方面的应用价值。该工作流程已应用于多种样本类型的氧化还原状态研究,包括细胞培养物27,30以及完整组织(如骨骼肌、心脏、肺)29,31,32,33。尽管本文未予涵盖,RAC方案亦可便捷地调整用于研究特定类型的可逆性氧化还原修饰形式,包括谷胱甘肽化(SSG)、亚硝基化(SNO)和S-酰化(S-acylation),如前所述25,29,34。
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本方案中所述所有涉及动物或人类样本/组织的实验程序均经人类与动物研究伦理委员会批准,并遵循其机构指南。
1. 样品匀浆/裂解
2. 树脂辅助捕获
3. 树脂上胰蛋白酶消化及TMT标记
4. 肽段洗脱
5. 肽段烷基化及脱盐/纯化
6. 液相色谱-串联质谱法
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完成该方案将实现对 formerly oxidized 含半胱氨酸肽段的高度特异性富集,通常具有 >95% 特异性27,35,36然而,该方案的若干关键步骤需要特别注意,例如在样品裂解/匀浆前对游离巯基进行初始封闭,以防止巯基发生人为氧化及非特异性富集人为氧化的巯基25样品可在实验方案的多个阶段通过不同方法进行分析,包括对蛋白质和多肽进行SDS-PAGE分析。SDS-PAGE可用于样品的定性分析,其中总巯基样品可实现样本间的比率比较,以确定因处理或刺激导致的氧化水平差异。图2A)。为了进一步研究单个蛋白质的氧化水平,可将SDS-PAGE凝胶进行蛋白质印迹分析36 (图2B)。这使得能够对模型系统进行更详细的分析,生成支持性数据,并进一...
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树脂辅助捕获技术已广泛应用于多种样本类型和生物系统,用于研究半胱氨酸残基的氧化修饰25,29,30。该方法可在多个层面和检测方式下对样本进行评估,包括利用SDS-PAGE和蛋白质印迹分析检测蛋白质和多肽,以及利用质谱技术检测单个半胱氨酸位点。无论样本类型或最终检测终点如何,该方法最终均可实现对含半胱氨酸的蛋白质和多肽的高度高效且特异性的富集38。通过使用RAC技术,我们已在不同模型系统中检测到扰动后多达数千个半胱氨酸位点的氧化状态变化。
在经历疲劳性肌肉收缩的小鼠中,2,200 S-谷胱甘肽化位点被鉴定出来,其中超过一半的位点谷胱甘肽化水平发生显著改变 S-谷胱甘肽化32RAC 也已用于分析可逆性硫醇氧化的特征 >蓝细菌在暴露于光合作用抑制剂或不同光照条件后出...
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作者声明不存在任何经济或其他方面的利益冲突。
本工作的部分研究得到了美国国立卫生研究院(NIH)基金 R01 DK122160、R01 HL139335 和 U24 DK112349 的资助
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(吡啶二硫)乙胺盐酸盐 | Med Chem Express | HY-101794 | 用于实验室自制树脂的试剂 |
| 2.0 mL LoBind 离心管 | Eppendorf | 22431048 | |
| 5.0 mL LoBind 离心管 | Eppendorf | 30108310 | |
| 5.0 mL 圆底管 | Falcon | 352054 | |
| 丙酮 | 赛默飞世尔科技 | A949-1 | |
| 乙腈 | Sigma Aldrich | 34998 | |
| 活化硫醇–Sepharose 4B | Sigma Aldrich | T8512 | 硫醇亲和树脂的潜在替代品 |
| Amicon Ultra 0.5 mL 离心过滤器 | Millipore Sigma | UFC5010BK | |
| 碳酸氢铵 | Sigma Aldrich | 09830 | |
| 双辛可宁酸(BCA) | Thermo Scientific | 23227 | 蛋白质检测试剂 |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 离心机 | Eppendorf | 5415R | |
| 二硫苏糖醇(DTT) | Thermo Scientific | 20291 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E5134 | |
| HEPES 缓冲液 | Sigma Aldrich | H4034 | |
| 匀浆器 | BioSpec Products | 985370 | |
| 碘乙酰胺(IAA) | Sigma Aldrich | I1149 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Sigma Aldrich | 4259 | |
| NHS-活化 Sepharose 4 Fast Flow | Cytiva | 17-0906-01 | 用于实验室自制树脂的试剂 |
| QIAvac 24 Plus 真空抽滤装置 | Qiagen | 19413 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrich | S3014 | |
| 十二烷基硫酸钠(SDS) | Sigma Aldrich | L6026 | |
| 超声破碎仪 | Branson | 1510R-MT | |
| 离心柱 | Thermo Scientific | 69705 | |
| Strata C18-E 反相柱 | Phenomenex | 8B-S001-DAK | 肽段脱盐 |
| 恒温混匀仪 | Eppendorf | 5355 | |
| 硫丙基 Sepharose 6B | GE Healthcare | 17-0420-01 | 硫醇亲和树脂;*该树脂的生产已被制造商停止(详见实验方案说明)。 |
| TMT 同重同位素标签(16-plex) | Thermo Scientific | A44522 | 肽段标记试剂;有多种规格可选 |
| 三乙基碳酸氢铵缓冲液(TEAB) | Sigma Aldrich | T7408 | |
| 三氟乙酸(TFA) | Sigma Aldrich | T6508 | |
| 吐温 X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| 胰蛋白酶 | Promega | V5820 | |
| 尿素 | Sigma Aldrich | U5378 | |
| Vacufuge Plus 真空浓缩仪 | Eppendorf | 22820001 | 真空浓缩装置 |
| 涡旋混合器 | Scientific Industries | SI-0236 |
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