肌萎缩侧索硬化症的 C. elegans 模型中运动功能障碍的评估

摘要

本方案描述了两种灵敏的检测方法，可用于区分肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）的 C. elegans 模型中轻度、中度和重度运动功能障碍，也可广泛适用于运动能力改变的 C. elegans 品系。

摘要

神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS）以运动神经元进行性丧失为特征，伴随肌肉无力和运动功能障碍，并随时间推移而加重。尽管在明确部分患者ALS的遗传驱动因素方面已取得显著进展，但大多数病例的病因仍不明确。此外，运动神经元功能障碍和退变的潜在机制尚未被充分阐明；因此，迫切需要建立并表征具有代表性的疾病模型以研究这些过程。 秀丽隐杆线虫 能够根据周围环境的物理限制调整其运动方式，在实验室环境中主要研究两种运动模式——在固体表面爬行和在液体中游动。这两种模式体现了感觉、运动神经元与肌肉之间的复杂相互作用。 秀丽隐杆线虫 肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型可能在这两种运动模式中表现出一种或两种功能受损。本方案描述了两种用于评估运动能力的敏感检测方法 秀丽隐杆线虫：一种优化的径向运动检测方法，用于测量在固体表面的爬行，以及一种自动追踪和分析液体中游泳（抽搐）行为的方法。除了可用于表征肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型的基础运动功能障碍外，这些检测方法还能检测遗传或小分子干预对表型的抑制或增强作用。因此，这些方法在ALS研究中具有重要应用价值 模型及任何 秀丽隐杆线虫 运动性发生改变的菌株

引言

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致残性的与衰老相关的神经退行性疾病，主要影响运动神经元。该病的特征是大脑和脊髓中的运动神经元丧失以及进行性运动功能障碍，导致严重的功能残疾和过早死亡，通常在确诊后3-5年内发生。¹至少38个基因的突变可导致肌萎缩侧索硬化症（ALS）；然而，大多数ALS患者的主要病理特征是在神经元和胶质细胞中出现泛素化修饰的TDP-43蛋白包涵体^2,3,4已开发出多种动物模型，用于研究导致或促进肌萎缩侧索硬化（ALS）的潜在机制 体内 （综述见于⁵). 在 秀丽隐杆线虫， 这些模型包括ALS致病基因同源物的遗传性功能缺失突变，或人类ALS基因的转基因表达。在ALS建模中具有多种优势 秀丽隐杆线虫. 秀丽隐杆线虫 是一种易于操作的简单动物，具有分化的神经系统、特征明确的行为范式，以及与人类高度保守的遗传同源性^6,7. 目前有许多工具可用于处理 秀丽隐杆线虫，包括强大的基因组编辑能力， 体内 神经退行性变的荧光报告系统、RNAi筛选范式、可操作的遗传学方法，以及成熟的行为学与表型检测手段。 秀丽隐杆线虫 ALS 模型再现了人类疾病的部分特征，包括不溶性蛋白的积聚、神经退行性变以及早亡^8,9此外，许多情况下存在运动功能障碍，表现为爬行和游泳行为均出现异常。 秀丽隐杆线虫 ALS 模型

本实验方案描述了两种用于表征C. elegans运动表型的方法：径向运动实验用于评估线虫在固体表面的爬行行为，以及利用WormLab自动化追踪与分析系统对液体中游泳（抽搐）行为进行评估。这些灵敏的运动功能缺陷表征方法可实现对表型严重程度的比较，并为检测运动表型的抑制或增强提供工具。径向运动实验可量化不同线虫群体在固体表面进行正弦波状爬行运动能力的差异。该实验利用C. elegans自然的无刺激探索行为，将线虫放置于培养皿中的单一位置，并在设定时间段后标记其最终位置¹⁰。另一种方法为液体中游泳（抽搐）实验，通过统计单个线虫在固定时间内的体部弯曲次数来评估运动能力。人工肉眼计数体部弯曲耗时较长，且不同实验操作者之间通常存在较大变异性。采用计算机辅助的自动化追踪与分析可显著减少此类变异性。除了用于表征肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型的基础运动功能障碍外，径向运动和游泳实验均可检测遗传或小分子干预所引起的特定运动表型的改变。这些方法适用于研究ALS 模型以及任何表现出运动能力异常的C. elegans品系。

方案

1. 径向运动实验

1. 准备直径为 100 mm 或 150 mm 的培养皿，其中加入约一半体积的线虫生长培养基（NGM），并在琼脂表面均匀接种 OP50 细菌，形成完整的细菌菌苔。
2. 将 NGM 检测平板倒置，并在底部标记待检测的 C. elegans 品系编号，每个品系准备 2 个平板（图 1A）。
3. 用记号笔在倒置平板的中心做一个小点标记（图 1A）。
4. 在体视显微镜下操作，使用铂金丝挑取器将 15–20 条发育阶段匹配的¹¹ 线虫转移至检测平板中心，使其正好位于中心标记点上方（可通过 NGM 看到该点）（图 1B）。
   注意：尽量同时或尽可能快速地转移所有线虫。
   1. 在线虫被放置于平板中心后，设置 30 分钟计时器。盖上平板盖子并将其放置一旁（图 1C）。
5. 继续转移线虫，直到所有品系均被转移至指定的检测平板，并记录在各平板之间转移所需的大致时间（目标为每两个平板之间约 1 分钟）。所有平板应保持最初设定的顺序。
6. 30 分钟后，开始对第一个平板进行评分。
   1. 取下平板盖子，将平板倒扣在体视显微镜下，使标记面朝上，NGM 琼脂位于观察视线与线虫之间。此时平板处于与常规使用相反的倒置状态。
   2. 调节显微镜焦距，直至可通过琼脂观察到线虫。
   3. 使用与中心点标记不同颜色的记号笔，在每条线虫所在位置做小点标记——沿细菌菌苔中的爬行轨迹追踪，找到最远端的个体。
   4. 检查平板边缘，部分线虫可能已爬至边缘。同时，计数并记录位于中心点标记处的线虫数量（图 1D）。
7. 按顺序继续对所有检测平板进行标记，确保每块平板均有 30 分钟的活动时间，并注意校正各平板设置过程中的时间延迟。随后，按照步骤 1.8 或 1.9 所述进行手动或数字化测量。
8. 使用直尺进行手动测量。
   1. 使用直尺以毫米（mm）为单位，测量从中心点到每条线虫最终位置标记的距离，并记录该距离。为便于在评分过程中跟踪进度，可在第一个评分点处用短线做标记。
   2. 通过顺时针旋转平板，依次记录每个点的距离数据（图 1E）。
9. 使用扫描仪和 ImageJ 进行数字化测量。
   1. 使用平板扫描仪，将检测平板的背面与一把直尺一同扫描（数字 朝向扫描面）（图 2A）。
   2. 在 ImageJ 或类似程序中打开扫描得到的平板图像。
      ​注意：ImageJ 是由美国国立卫生研究院（NIH）提供的免费基于 Java 的图像处理软件。
   3. 点击直线工具，然后在扫描图像中连接直尺上的 1 cm 和 2 cm 刻度点（图 2B）。
      注意：按住Shift键可使所画直线自动对齐至最接近的 45° 角。
   4. 进入分析菜单，使用其设置标尺（分析 | 设置标尺）（图 2C）。
   5. 在相应输入框中输入已知距离（10）和长度单位（mm），不要修改像素距离数值。勾选全局选项，以便在同一 ImageJ 会话中对所有图像应用相同标尺；否则，需在每次打开图像时重新设置标尺（图 2D）。点击确定。
      注意：步骤 1.9.2–1.9.5 用于设定测量标尺。此后，图像中线段长度将自动与设定的像素与长度关系对应。以 300 dpi 扫描的图像，其像素与毫米的近似关系为每毫米约 11.8 像素。
   6. 使用画笔工具在第一个待评分点的正上方做一标记。
      注意：此标记作为第一个被评分线虫的视觉指示。
   7. 使用直线工具从中心点画线至第一个线虫数据点。
   8. 按下键盘上的M键以测量距离。或者，进入分析菜单并选择测量（分析 | 测量）。两种方式下，测量结果将出现在新窗口中；该窗口将收集每幅图像的所有测量数据。
   9. 保持中心点不变，将线段末端从第一个线虫点移动至下一个点（顺时针方向），然后按下M键进行测量。
   10. 继续以顺时针方向测量每个点，直至所有点均被评分。
   11. 复制和粘贴长度测量数据至电子表格中保存。随后，对每张扫描图像重复此过程。
       ​注意：步骤 1.9.6–1.9.11 用于测量线虫的位移值（图 2E–F）。
10. 进行统计分析。
    1. 将单次实验中的重复样本合并，使总评分线虫数量达到 30–40 条。
    2. 在不同日期进行独立的实验重复，并使用独立的线虫群体，最终获得 3 次独立的实验重复。
    3. 使用适当的统计分析方法对数据进行分析，例如对两个品系使用 Student t 检验，对三个或更多品系使用单因素方差分析（1-way ANOVA）。

2. 计算机分析的游泳实验

注意：本实验方案包含针对市售 WormLab 硬件与软件系统（参见材料表）的详细操作说明。然而，该工作流程也可应用于其他计算机分析的游泳行为检测系统。

1. 设置并录制视频。
2. 升起成像设备的屏蔽装置（图3并确认相机高度已设置在预期位置。
   注意：在35 mm培养皿上捕捉线虫的最佳高度为，可观察到位于可调相机安装支架下方的从底部数第三个螺纹孔，但螺纹孔上方不再可见其他安装孔（距载物台约30.5 cm）图3C）。这将产生 11.43 µm/像素的捕获比例。可考虑添加一个 "正确高度" 指示剂，以便在开始检测前更容易确认。有关高度调整，请参见方案步骤 2.18。
3. 打开相关软件（补充图 1A).
4. 点击 视频采集 图标（中间带右指三角形的影片图标）以打开新 视频采集 窗口。相机将处于 实时观察，但显示屏会是黑色的（补充图1B).
5. 按下调光旋钮并顺时针旋转以调节光线。
   注意：调光旋钮位于成像系统载物台上，靠近明场光源处。 视频采集 实时视图显示将从黑色变为亮起。
6. 回到 视频采集 窗口，单击 设置 标签，按如下方式调整： 视频模式：2456 x 2052_Mono8， 帧率: 14, 输出单色 暴露：0.00300 秒，增益：1 dB 伽马: 1, 旋转180度 （检查开启状态）。
7. 返回到 捕获 选项卡。选择录制文件夹（补充图1B).
   注意：所有录音和项目文件将存储在此处。为单个实验创建独立的文件夹，以保持数据有序。
8. 通过在其中输入文件名来指定文件名 文件前缀 文本框
   注意：软件会以指定格式在前缀末尾自动添加一个递增的编号 "0001"建议为文件采用一致的命名方案，例如： "YYYYMMDD_处理名称_rep#_".
9. 设置其他 捕获 设置如下： 缓冲液：128 帧（默认）， 持续时间 （检查时间）：00小时01分钟00秒。忽略或关闭此选项卡中的其他设置。
10. 将检测板（盖朝上）放置于仪器载物台上，并将其居中 视频采集 移除盖子。
    注意：提前准备检测用培养板。每个培养板包含一个直径35 mm的培养皿，其中约一半体积装有未接种细菌的NGM培养基。
11. 使用微量移液器冲洗同步化培养阶段的样品¹¹ 将约50条线虫加入1 mL M9中，转移到检测平板上（图3D）。轻轻晃动培养板使线虫聚集到中心，或使用微量移液器加入几滴M9缓冲液以分离个体线虫（图3E）。设置60秒计时器，使线虫适应游泳状态。
    注意：平板在屏幕上不会完全可见。当动物相互重叠时，无法准确追踪。
12. 在计时器倒计时过程中，通过观察显示器，手动旋转相机镜头主体上的对焦环来调节相机焦点（图 3F可以使用滚轮鼠标放大线虫，以便更精确地聚焦。
13. 设置焦点后，调节光源旋钮，使显示亮度达到尽可能高但不出现过曝的程度（过曝区域在显示屏上会呈现为红色像素）。
14. 60 秒后，按下 记录 按钮
    注意：视频将从 实时观察 到 记录 计时器将可见。当采集完成后， 视频采集 显示屏将恢复至 实时观察 (补充图1B).
15. 记录后移除平板，设置下一块平板。根据需要重命名前缀。将线虫冲洗至检测平板中，孵育60秒，记录每种处理。
16. 实验的所有记录完成后，关闭所有打开的视频标签页，并通过按压调光旋钮关闭光源。
17. 关闭 视频采集 通过点击红色窗口 x 单击窗口右上角的按钮；或者，关闭整个软件包后重新打开。
18. 准备用于追踪的视频。
19. 从 工作流程 侧边栏菜单，选择该菜单上的第一个按钮 导入图像序列，找到并双击一个视频。该视频将在中间窗口打开（补充图2A).
    注意：软件的默认显示为 工作流程 侧边栏菜单；该菜单也可通过顶部“视图”下拉菜单中的选项访问 查看 [查看 | 工作流程]. 的 工作流程 菜单包含多个视图选项； 追踪 此时在方案中查看是合适的。如果 设置序列信息 如果菜单中未显示该按钮，则说明视图不正确。首先，请查看底部的 菜单 并检查 工作流程 标签处于激活状态，接下来检查 追踪 点击以激活视图 追踪 图标。窗口中菜单的显示位置取决于显示器尺寸及其他已打开菜单的位置。菜单可通过拖放移动、调整大小并关闭。大多数菜单也可通过以下方式打开： 查看 下拉菜单
20. 从工作流程菜单中选择 设置序列信息 (补充图 2B）。在新弹出的菜单窗口中，检查命名方案，添加备注，并验证元数据。
21. 检查缩放设置是否正确； 量程：11.43 µm/像素 测量 将自动填充，因为1000 µm对应87像素。如果相机高度的调整与本文规定的不同，请按照此菜单中的说明更新标尺。点击 保存 按钮
22. 在工作流程菜单中，选择 调整图像，以及一个名为 图像调整 将打开（补充图 2C选择 深色蠕虫在浅色背景上（明场）.
23. 调整其他设置。推荐 图像处理设置 如下所示： 背景平滑: 10, 高斯平滑: 5, 填补孔洞: 2, 小物体滤光片：0，跳过 积分微分分割.
24. 调节 阈值 使动物体内的绿色达到完全充满但与背景仍有明显区别的程度。点击 应用.
    注意：允许夹取少量非线虫的物体。
25. 从 工作流程 菜单，选择 检测与追踪 (补充图 2D).
    注意：视频旁边将出现一个包含 3 个标签页的菜单： 检测, 追踪，以及 修复光标移至视频显示区域时会变为手指指向的形状。或者，单击 选择 软件左上角图标菜单中的图标（光标箭头）。
    1. 使用手指选择工具选取3-7条线虫，然后点击 检测线虫 按钮在 检测 表。
       注意：此步骤有助于软件在特定条件下准确识别线虫，且需针对每个视频进行设置。数秒后，大多数线虫将被绿色轮廓标记，并带有黄色数字编号。相互接触或卷曲的线虫可能不会被标记；但在追踪过程中，程序仍大概率能够识别它们。软件提供调整检测参数的选项，但在大多数情况下，默认参数已能良好运行。若需调整检测参数，务必确保各样本及重复组之间保持一致。
26. 仍在 检测与追踪 窗口，移动到 追踪 标签补充图2E）。在 追踪参数 检查 使用回溯法，取消勾选 在图像边缘追踪线虫.
27. 设置 最大追踪假设 至 5。设置 追踪模式 到 游泳.
    注意：最大追踪假设设置用于调整单个被追踪线虫可拥有的潜在虫迹数量，使程序在追踪单个线虫时具有一定的容错空间，避免丢失目标。对于游泳行为的追踪，设置为5较为合适。
28. 移动到 高级设置 部分并设置以下内容： 帧中的线虫可接触边界: 50, 帧与帧之间的线虫可能出现重叠: 500, 位置公差: 0.50, 形状公差：0.50。将这些设置保存为配置文件，以便在本实验及其它实验的所有视频中应用。
    注意： 轨迹筛选 不推荐，可在后期处理中轻松完成，因此请省略。
29. 导航至 配置管理器 （左上角图标菜单中的齿轮图标）。点击后， 配置管理器 侧边栏菜单将打开。接下来，点击 保存（齿轮 + 图标），为此配置命名并添加描述，然后单击 好的 按钮
    1. 要将来访问此配置，请打开 配置 菜单中选择所需的配置，然后单击 加载 （齿轮向上箭头）图标。然后添加序列信息，可能需要微调阈值水平，并选择用于检测的线虫。所有其他设置将保持不变。
30. 在 工作流程 菜单，单击 保存项目，确认保存位置并添加项目文件名（将项目文件名与视频名称保持一致有助于保证连贯性）。关闭视频。
    注意：这些项目以 .wpr 文件类型保存。
31. 对所有视频重复以下操作：导入图像序列（2.18）、加载已保存的配置（2.28.1）、调整阈值（2.23）、设置序列信息（2.19）、检测线虫（2.24.1）、保存项目（2.29）、关闭视频。
32. 追踪视频
    1. 要跟踪项目文件，请前往 工作流程 菜单并点击 批次 （包含线虫页面的文件夹）图标（补充图2F).
       注意：该 批量处理 面板将被显示（补充图2G）。有时它处于隐藏状态，但可在页面最底部找到。 批量工作流程 菜单；可能需要扩大窗口才能看到。
    2. 点击 添加 按钮位于下方 文件选择 本部分 批量处理 菜单。导航并选择所有要处理的项目文件（.wpr），然后单击 打开.
       注意：批量处理菜单将显示所选文件的路径、状态指示器以及每个文件对应的灰色进度条。
    3. 点击 开始 （播放按钮图标）。注意第一个文件上的绿色进度指示条。等待所有文件完成处理。当所有文件均显示为完成（绿色）时，即可关闭软件。补充图2G).
    4. 如果项目文件卡住，可尝试单独运行该卡住的文件，通常可解决此问题。若问题仍未解决，请打开项目文件，删除选定的线虫（检测 和 追踪 菜单），并从新的训练集中重新选择。然后重新处理项目文件。
33. 修复轨道（推荐）
    注意：修复轨迹可提高轨迹的准确性。常见的修复方法包括：将人眼可识别为属于同一条线虫的轨迹进行合并，删除不准确或未捕获真实线虫数据的轨迹，以及拆分因线虫相互接触而导致错误表示的轨迹（若可行，可移除错误片段，并将该片段前后的轨迹重新合并）。
    1. 打开软件并打开一个项目文件文件 | 打开项目] 感兴趣的区域。点击 打开 并单击 是 使用此文件。等待时间滤波器加载完成。处理后的视频将显示在屏幕上，线虫将以绿色高亮并以黄色轮廓标出。使用视频播放器拖动进度条或播放视频。
    2. 从 工作流程 菜单，选择 检测与追踪 (补充图2D）。切换到 修复 选项卡。激活 选择器 通过点击光标 选择工具 图标（光标箭头）。拖动视频进度条，找到并选中一条线虫轨迹，然后使用修复菜单进行所需修改。
       注意：为快速策略性地解决大部分问题，应放大图像，使视野范围约为整体的1/6^th 当视野中可见培养板时，从 #1 轨迹周围区域开始。快速浏览视频，检查是否有凭空出现的线虫、轨迹编号发生改变的情况，或线虫之间相互碰撞的现象，并在发现问题时立即进行编辑。按照起始位置，依序跟踪编号线虫。根据需要前后拖动视频，逐一追踪每条线虫，直至整块培养板的轨迹全部修复。需特别注意培养板边缘区域；通常，伪影线虫常出现在培养板边缘的阴影处。
34. 数据分析
    1. 从 工作流程 菜单，选择 分析数据 (补充图3A).
       注意：一个名为 数据分析与绘图 将出现（补充图3B）。此窗口提供了多种方法来评估和查看特定项目文件中线虫群体的运动数据。大多数分析功能允许从给定视频中选择单个、多个或全部线虫，从而以不同方式绘制轨迹信息。
    2. 要分析转弯次数，请导航至 追踪摘要 [位置 & 速度 | 轨迹摘要] (补充图 3C）。使用 导出 右下角的按钮可将数据导出为可读的电子表格格式（.csv），选择电子表格的保存路径，并将其重命名为易于记忆的名称。默认设置是较好的选择（补充图3D).
    3. 将这些数据以及任何其他相关的项目数据集粘贴到一个整合的电子表格工作簿中（补充图3E).
    4. 使用 转数 和 追踪时长 使用电子表格函数（=每圈数 / 轨迹持续时间 × 60）计算每条轨迹每分钟的圈数，或根据需要采用其他指标补充图 3F).
       注意：每分钟转数所反映的信息与手动抽搐实验非常相似，后者是衡量液体中活动能力的常用指标，但存在多种可选方法，对于特定处理或比较，其他指标也很可能揭示出有趣的实验数据。
    5. 如有需要，可使用条件格式化工具，根据线虫大小、轨迹持续时间或其它选定指标筛选数据，以标出可能造成干扰、需剔除的轨迹。不同处理组及重复组间应保持数据处理方法一致。
    6. 使用适当的统计分析方法分析数据，例如对两种菌株采用学生t检验，对三种或更多菌株采用单因素方差分析（1-way ANOVA）。实验需在不同日期进行，并使用独立的线虫群体完成至少3次独立的实验重复。

结果

径向运动和游泳实验均可灵敏地检测运动能力障碍（图4 和 图5）。为了研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）中TDP-43病理机制，已建立表达野生型或ALS突变型人源TDP-43的C. elegans模型，这些模型在全神经元中表达目标蛋白。这些动物表现出与ALS相似的分子和细胞特征，包括运动功能障碍⁹。重要的是，在径向运动和游泳实验中均发现，表达野生型人源TDP-43的线虫表现出中度运动能力障碍，而表达ALS突变型TDP-43的线虫则表现出更严重的运动能力障碍。某些突变型或转基因动物在爬行方面的功能障碍可能比游泳更显著，反之亦然。通过采用两种不同的运动能力检测方法，可以更清晰地揭示不同品系之间的表型差异。

径向运动
当秀丽隐杆线虫（C. elegans）被放置在接种了细菌的琼脂平板上时，它们会探索周围环境，包括趋向食物源的边界。径向运动实验可利用这种行为作为评估其身体机能的一种指标。通过以受控且可量化的方式分析线虫的运动行为（在固体表面爬行），径向运动实验为评估运动功能障碍及其他与运动相关表型的严重程度提供了一种简单而有效的工具。径向运动实验能够检测中度或重度受损的肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型线虫在运动能力上的差异，并为比较运动表型的调节作用或年龄相关的运动能力变化提供基线依据（图6）。该策略可用于量化任何与野生型（N2）或对照线虫相比运动能力发生改变的品系的爬行行为。然而，对于无法正常爬行的动物，例如滚动突变体（roller mutants）或瘫痪个体，该方法可能并不适用。通常情况下，野生型线虫在20 °C条件下培养并测试时，其平均位移约为200–300 µm/min。在图4中展示的示例数据比较了以下品系的预期结果：N2野生型、两种表达野生型人源TDP-43且表型较轻的转基因品系[TDP-43(WT-轻度)，CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])]或表型较明显的品系[TDP-43(WT-中度)，CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]、一种表达突变型人源TDP-43且具有严重表型的转基因品系[TDP-43(M337V)，CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]，以及另一种表达与神经退行性疾病相关蛋白——野生型人源tau蛋白的转基因品系[tau(WT)，CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]。通过径向运动实验检测发现，表达野生型TDP-43的两个品系表现出不同程度的运动障碍。其中TDP-43(WT-低)与N2无显著差异，而TDP-43(WT-高)则表现出明显的运动能力差异。TDP-43(M337V)和tau(WT)品系的运动障碍更为严重。

游泳实验
C. elegans 在液体中浸没时会表现出典型的游泳（抽搐）运动。一旦被浸入液体，线虫即开始以约45°的弯曲角度，将头部和尾部向彼此弯曲，弯曲顶点位于虫体中点。线虫交替地向腹侧和背侧方向弯曲。软件所测量的一次抽搐定义为虫体从伸直状态弯曲至体角达到20°或更大的过程，不考虑弯曲方向（角度阈值可在分析后于分析和绘图窗口中调整[工作流程 | 分析数据 | 体型 | 弯曲角度 | 中点 | 振幅阈值：#度]）。此处描述的游泳实验采用基于计算机的自动追踪与分析系统，以实现对游泳活动的无偏评分。预期在20 °C条件下培养并记录的野生型（N2）线虫每分钟平均抽搐次数为150–200次。图5中展示的示例数据比较了N2、两种表达野生型人源TDP-43且表型较轻[ TDP-43(WT-轻度)，CK402 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-3::GFP])]或表型较重[TDP-43(WT-中度)，CK410 (bkIs402[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])]的转基因品系，以及一种表达另一种与神经退行性疾病相关蛋白——野生型人源tau蛋白的转基因品系[tau(WT)，CK144 (bkIs144[Paex-3::tau(4R1N); Pmyo-2::GFP])]。表达ALS突变型TDP-43 [TDP-43(M337V)]的转基因品系在液体中不发生抽搐，因此在图中以ND（无数据）表示。该实验能够区分出与图4所示径向运动实验不同的表型。例如，在径向运动实验（图4）中，TDP-43(WT-低)与N2之间无显著差异；但在游泳实验（图5）中，TDP-43(WT-低)和TDP-43(WT-高)均与N2存在显著差异，且彼此之间也有显著差异。此外，尽管TDP-43(M337V)和tau(WT)在径向运动中均表现出严重的爬行障碍（图4），但只有tau(WT)能够产生足够的抽搐动作，从而被软件有效追踪（图5）。TDP-43(M337V)个体无法抽搐，基于软件的分析无法准确检测或追踪这些线虫，因此未收集其数据（ND，无数据）。

图1：径向运动测定实验流程图。 图中A-E展示了径向运动测定的一般步骤。具体如下：（A）制备NGM平板，在平板边缘接种OP50，并在平板中心位置标记一个中心点；（B）将线虫放置于琼脂平板中心的标记点处；（C）让线虫自由移动一段设定的时间；（D）将平板翻转，使底部朝上，并用不同于中心点颜色的标记标注每条线虫的最终位置；（E）通过手动或数字方式测量中心点到每条线虫最终位置的距离。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：使用 ImageJ 进行最终位置的数字化测量。 距中心距离可通过手工或数字化方式测量。要使用 ImageJ 进行数字化测量，（A）用扫描仪扫描平板背面，并在画面中包含一把直尺。（B）使用直线工具绘制一段已知长度的线段。（C）利用步骤（B）中绘制的已知长度设定比例尺 [分析 | 设定比例尺…]。（D）使用直线工具从中心点向每个最终位置标记画线，每个标记均需重复此操作。（E）用画笔线条标出第一个已测量的标记，有助于计分（靠近标记“1”处的黑色波浪线）。最终位置标记以黄色数字编号，以显示计分的方向性。（F）测量结果将显示在“结果”窗口中。请将结果另存以用于统计分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：使用软件所需的材料与硬件调整。（A）用于软件辅助游泳实验的材料。（B）软件及相关材料的总体设置，注意此时外壳处于抬高位置。（C）镜头安装支架的高度可进行调节。图中显示了可调节轨道以及用于标记进行游泳实验时理想高度的胶带指示标记。在开始录制前，必须调整明场光照和相机对焦。（D）将一个 35 mm 的实验板放置在载物台上，在板中加入含有线虫的 M9 缓冲液，并启动 1 分钟计时器。（E）有时轻轻旋转培养板可使线虫向中心移动——通过实时捕获画面观察其位置；或者也可使用移液器滴加几滴 M9 缓冲液以分离线虫。（F）调节相机镜头上的对焦环，通过屏幕观察线虫以确定最佳对焦状态。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：径向运动分析可检测爬行速度的差异。 使用上述径向运动分析方法测量发育阶段同步的 L4 幼虫在无刺激条件下的扩散情况，并以每分钟移动的微米数（µm/min）表示（A-B）。在（A）和（B）中展示的相同数据体现了两种不同的图形呈现方式。（A）中数据以柱状图显示，使不同品系间的相对差异更清晰；（B）中则在图中绘制了每条线虫的最终位移，从而更直观地反映群体内的变异情况。为评估各品系间的显著性差异，采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。**p=0.0022，****p<0.0001，ns=无显著性差异。TDP-43(M337V) 和 tau(WT) 与 N2 相比也具有显著差异，p<0.0001。（A）中的误差线表示均值标准误（SEM），（B）中则表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：游泳实验检测液体中摆动行为的差异。 游泳速率（液体中的摆动或波动频率）通过上述无偏的计算机辅助评分与分析方法测定，并以每分钟摆动次数（thrashes/min）表示（A-B）。同一组数据分别在（A）和（B）中展示。 在（A）中，数据以柱状图形式呈现，便于观察不同品系之间的相对差异；在（B）中，每个被评分的单个线虫数据均在图中单独标出，从而更清晰地展示群体内的变异情况。为评估不同品系间的显著性差异，采用单因素方差分析（ANOVA）结合 Tukey 多重比较检验。****p<0.0001，ns = 无显著性差异。TDP-43(WT-moderate) 和 tau(WT) 与 N2 之间也存在显著差异，p<0.0001。（A）中的误差棒表示均值的标准误（SEM），（B）中表示标准差。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：表达突变型TDP-43的线虫移动距离短于野生型线虫。图示为同步化L4期N2（野生型）与TDP-43(M337V)（CK423 (bkIs423[Psnb-1::TDP-43; Pmyo-2::GFP])）线虫在室温下无刺激爬行1小时后最终位置的代表性差异，该品系表达突变型人源TDP-43蛋白，运动功能严重受损。平板中心以红点标记，动物最终位置以蓝点标记。请点击此处查看该图的放大版本。

补充图1：使用成像与追踪软件记录游泳行为。（A）追踪工作流程及视频捕获图标的位置。（B）在实时预览模式下显示的视频捕获窗口，其中最重要的部分已标出。当启动录制按钮后，绿色的“实时预览”字样将变为红色的“正在录制”。请点击此处下载该文件。

补充图2：游泳行为的制备与追踪该图展示了一系列截图，用于帮助设置视频图像序列以进行追踪。准备视频序列的通用操作流程是按以下顺序依次打开各个工作流程菜单： 导入图像序列 | 设置序列信息 | 调整图像 | 检测与追踪 | 保存项目。该 分析数据 项目文件被跟踪后，窗口才能使用。A) 显示从软件内部导入序列后打开的 .avi（视频）文件 追踪 工作流程。B） The 设置序列信息 窗口提供了添加注释、设置/更改比例尺以及查看视频序列元数据的功能。更改比例尺的操作说明也在此窗口中，当摄像机被降低或升高时，应遵循该说明进行操作。B）。图像（C）显示了 调整图像 窗口设置。D) 检测选项卡界面截图 检测与追踪 窗口。检测线虫用于训练软件，必须针对每个视频序列进行设置。如有需要，此处还可设置其他检测参数。E截图 追踪 标签的 检测与追踪 用于追踪游泳行为的推荐设置窗口。这是设置视频序列的最后一步。使用项目保存该序列 保存项目 窗口。对每个视频序列重复这些步骤。可将设置保存为配置文件，以减少工作量并确保所有序列处理方式一致（未显示）。为跟踪项目文件进行分析，请导航至 批次 工作流程。 (F) 显示用于导航至该位置的图标 批次 工作流程，以及（G) 显示批量处理窗口，突出显示添加和开始按钮，并展示已跟踪的项目文件的预期外观。 请点击此处下载此文件。

补充图3：游泳行为分析。 项目文件完成追踪后，可通过[文件 | 打开项目]将其打开。如图（A）所示，线虫将以绿色显示。通过拖动视频进度条可快速检查视频处理结果是否符合预期，拖动时绿色高亮将消失。点击 分析数据 工作流程项可打开“数据分析与绘图”窗口。（B）展示了打开位置视图（默认）的数据分析与绘图窗口，所有轨迹均被高亮显示。在数据点下方的图表中，显示了每条高亮线虫的记录轨迹。轨迹汇总分析用于计算每分钟转弯次数。（C-D）展示了轨迹汇总报告及导出详情。（E-F）展示了以电子表格形式呈现的轨迹汇总结果，以及如何计算本实验所测定的指标——每分钟转弯次数。请点击此处下载该文件。

讨论

径向运动：
该实验的分辨率可通过调整时间变量轻松控制。延长实验时间有助于观察表型严重个体之间的差异，从而识别细微差别。然而，由于该实验测量的是位移，若实验时间过长，运动能力正常的线虫（如 N2）会移动至培养皿边缘，其觅食行为将导致回溯运动，从而人为地降低行进距离的测量值。时间过长可能导致不同品系间的差异消失，尤其是运动表型较轻微的个体之间，因为线虫会均匀分散在整个培养皿上。缩短时间变量可防止活动性较强的线虫到达培养皿边缘。该方法并不记录每条线虫的总移动距离，而是将每条线虫的移动距离压缩为从培养皿中心出发的直线距离。因此，与记录单个线虫总轨迹长度的方法相比，其内在稳健性较低。然而，径向运动实验对研究人员的技术要求极低，所用试剂相对便宜且在大多数线虫实验室中均易获得，并且具有足够的灵敏度以产生显著且可重复的结果。对于倾向于使用自动视频追踪的实验室，已有多种方法被建立用于追踪和分析爬行运动¹²，或者本文中游泳实验所用的软件参数也可进行调整，以实现对爬行行为的检测与分析。

该实验通常设置三个独立的重复组，每组包含30至40条线虫。每个重复组被平均分配到两个不同的100 mm或150 mm培养皿中，每皿放置15至20条线虫。若每皿线虫数量超过推荐值，可能导致评分效率降低。总评分数量达到90条以上时，足以有效检出轻度、中度或重度运动能力损伤的显著性差异。在对不同品系进行评分时，保持时间点的一致性对于实验的准确性与可重复性至关重要。通常情况下，30分钟已足以区分中度至重度表型差异，例如表达人类突变型TDP-43的转基因品系与野生型线虫之间的差异（图4）。若需延长观察时间，建议将培养皿尺寸从100 mm增加至150 mm。环境因素（如温度和湿度）可能影响本实验结果，实验通常在室温条件下进行，因此在不同重复组之间比较时，必须始终设置野生型（N2）对照组。此外，该实验还可用于检测某些在液体中无法正常游泳（即“抽打”运动）品系的运动能力，因而可作为游泳实验的有益补充。

游泳实验：
利用成像与采集系统对线虫游泳行为进行自动追踪与分析，可获得严谨且无偏倚的数据。然而，在实验初始设置过程中，有多个因素需要在不同样本间保持一致。这些因素包括：线虫在开始记录前在液体中适应的时间、环境条件（即温度、湿度）以及恒定的光照和录像设置。在记录平台上，有若干设计有助于减少不同培养皿之间的变异。这些设计包括：集成的轨道式摄像头和明场载物台，可确保不同培养皿间的视频记录一致性；围绕载物台的遮蔽装置，可防止反射、眩光和记录过程中的空气流动；以及一套功能强大的软件包，能够可靠地识别线虫，并允许在视频后期处理中对手动校正轨迹。在本实验方案中，对盛有线虫的35 mm培养皿进行1分钟的视频录制，随后使用该软件包进行处理。处理完成后，通过手动校正轨迹，确保线虫行为被准确记录，避免追踪错误的干扰。通过转体次数和轨迹持续时间数据，计算每分钟转体次数作为最终的检测指标。为确保可重复性，数据需来自至少3次独立的重复实验，每次实验评分40–50只动物，最终合计动物总数达到120–150只。该样本量足以区分实验组与对照组线虫在游泳行为上的微小差异。某些线虫的运动功能缺陷过于严重，无法通过游泳实验有效检测。例如，若将线虫置于液体介质中时其身体蜷缩，而非表现出预期的抽打样运动，则该实验无法准确记录其运动行为，此时可采用其他运动检测方法，如径向运动实验，以更有效地评估此类运动缺陷。本方案所用为 commercially available imaging system（参见材料表了解详细信息），但其他线虫追踪系统也可能提供类似功能，其中部分系统为开源系统¹²。已有文献报道了对线虫抽打行为进行人工评分的方法¹³。尽管自动分析可为每条线虫提供多种行为参数，但以每分钟身体弯曲次数（即每分钟抽打次数）作为检测指标，可在不同实验间提供一致的结果，并与传统的人工目测评分高度吻合。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C. elegans	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）	-	可根据需要获取菌株，N2 是一种有用的对照菌株
一次性巴斯德吸管，硼硅酸盐玻璃	VWR	14673-010	用于制作线虫挑针的玻璃吸管——一手持玻璃吸管，另一手持约1"长的铂丝（用镊子夹住），在火焰上加热连接。
一次性培养皿，35×10 mm	VWR	10799-192	WormLab 成像系统的检测用培养皿
一次性培养皿，60×15 mm	VWR	25384-090	线虫保种用培养皿
一次性培养皿，100×15 mm	VWR	25384-302	标准径向运动检测培养皿
一次性培养皿，150×15 mm	VWR	25384-326	长时间径向运动检测培养皿
体视显微镜	Leica	M80	用于线虫培养及设置径向运动检测
细头标记笔	VWR	52877-810	径向运动检测至少需要两种颜色，需使用细头以确保精确度
平板扫描仪	Amazon	Epson Perfection V850	径向运动检测可选设备。本方案假设分辨率为300 dpi，大多数扫描仪均可满足要求
ImageJ	NIH	-	NIH 提供的可选免费软件 — https://imagej.nih.gov/ij/
M9 缓冲液	VWR	IC113037012	用于游泳检测的介质。可自行配制，参见 WormBook：C. elegans 的维持
NGM（线虫生长培养基）	VWR	76347-412	用于培养 C. elegans 的培养基。可自行配制，参见 WormBook：C. elegans 的维持
OP50 细菌	秀丽隐杆线虫遗传学中心（CGC）	OP50	C. elegans 的主要食物来源
p1000 移液器	VWR	76207-552	移液器，用于游泳检测
p1000 吸头	VWR	83007-384	移液器吸头，用于游泳检测
铂丝，直径 0.2032 mm	VWR	BT136585-5M	细规格铂丝，用于制作线虫挑针——一手持玻璃吸管，另一手持约1"长的铂丝（用镊子夹住），在火焰上加热连接。
直尺	VWR	56510-001	用于评分径向运动检测结果
WormLab 成像系统	MBF Bioscience	WormLab	该成像系统包括 WormLab 硬件（明场载物台、相机和外壳）和 WormLab 软件。https://www.mbfbioscience.com/wormlab-imaging-system