方法文章

in vivo 条件下皮肤树突状细胞不同亚群在诱导皮肤内Candida albicans感染中Th17免疫反应的功能

DOI：

10.3791/62731

⸱

2021年7月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Severance Hospital, Cutaneous Biology Research Institute, Yonsei University College of Medicine, 2Brain Korea 21 FOUR Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 3Institute for Immunology and Immunological Diseases, Yonsei University College of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们展示了皮肤树突状细胞亚群在深层真皮Candida albicans感染的Th17免疫反应中的体内功能。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

皮肤是人体最外层的屏障器官，其中包含多种树突状细胞（DCs），这是一类专业的抗原呈递细胞。当皮肤遇到入侵病原体时，不同类型的皮肤DC会启动特异性的T细胞免疫反应以保护机体。在各类入侵病原体中，真菌感染特别能够驱动产生白细胞介素-17的Th17型保护性免疫反应。本研究建立了一种通过皮肤内注射Candida albicans感染高效诱导Th17细胞分化的实验方案，用于探究负责诱导Th17免疫反应的一类皮肤DC亚群。流式细胞术和基因表达分析显示，在引流淋巴结和感染皮肤组织中，Th17免疫反应显著增强。利用白喉毒素诱导的特定DC亚群耗竭小鼠模型，发现CD301b+真皮DC在此模型中对Th17细胞的最佳分化起关键作用。因此，该实验方案为研究不同皮肤DC亚群在深部皮肤真菌感染中诱导Th17免疫反应的in vivo功能提供了有价值的方法。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

皮肤是最外层的屏障器官，可保护机体免受外来病原体和刺激物的侵袭1。皮肤由两个不同的层次组成：表皮——由角质形成细胞构成的复层上皮，以及其下方的真皮——由胶原蛋白和其他结构成分构成的致密网络。作为主要的上皮屏障组织，皮肤主要提供物理屏障，并因其含有大量常驻免疫细胞而参与构成额外的免疫屏障2,3。在皮肤免疫细胞中，树突状细胞（DCs）是一类专业的抗原呈递细胞，能够主动摄取自身和非自身抗原，并迁移至局部淋巴结（LNs），根据抗原的性质启动抗原特异性的T细胞应答或免疫耐受4。

皮肤中含有表皮抗原呈递细胞，即朗格汉斯细胞（Langerhans cells, LCs）以及至少两种类型的树突状细胞（DCs），包括真皮I型传统树突状细胞（cDC1）和真皮II型传统树突状细胞（cDC2）5。表皮LCs起源于胚胎单核细胞系，在稳态条件下通过自我更新维持其细胞数量6。相比之下，真皮cDC1和cDC2起源于造血干细胞，并由定向分化的DC前体细胞持续补充5。皮肤树突状细胞以其表面标志物为特征，大致可分为Langerin+（包括LCs和cDC1）和CD11b+Langerin-（主要为cDC2）两个群体。此外，该研究团队还发现，CD11b+Langerin- DC群体可根据CD301b的表达进一步分为两个亚群7。

皮肤树突状细胞的重要功能特征主要围绕一种分工机制，这种分工主要由各树突状细胞亚群的内在特性决定。 原位 树突状细胞的位置、组织微环境以及局部炎症信号8。这些皮肤树突状细胞的功能特征 necessitate 研究特定树突状细胞亚群在皮肤某些类型免疫应答中的作用。在引流淋巴结中，皮肤树突状细胞对抗原刺激作出反应后，初始 CD4+ T细胞可分化为特定的辅助性T细胞亚群，这些亚群分泌一组特定的细胞因子以发挥其效应功能9. 在CD4中+ 辅助性T细胞亚群中，分泌白细胞介素-17（IL-17）的Th17细胞在自身免疫性疾病和抗真菌免疫中发挥关键作用10在这方面，皮肤真菌感染一直是研究Th17免疫的可靠模型 体内11,12,13当经胶带剥离处理的皮肤经表皮暴露于 白色念珠菌 (C. albicans酵母，表皮LCs在驱动抗原特异性Th17分化中起关键作用14.

针对皮肤内 C. albicans 感染的保护性免疫依赖于先天免疫，例如成纤维细胞和吞噬细胞的纤溶活性15。然而，关于皮肤树突状细胞（DC）亚群在深部真皮 C. albicans 感染中建立 Th17 免疫应答的作用，目前了解甚少。本文描述了一种皮肤内接种 C. albicans 的感染方法，可诱导局部和区域性的 Th17 免疫应答。利用白喉毒素（DT）诱导的 DC 亚群耗竭小鼠模型发现，CD301b+ 真皮 DC 在该模型中对 Th17 免疫应答至关重要。本文所述方法可用于研究 Th17 应答在深部真皮侵袭性真菌感染中的作用。

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方案

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注意：所有动物实验均经机构动物护理和使用委员会（IACUC，批准号：2019-0056，2019-0055）批准。本研究使用7至9周龄、体重18–24 g的野生型（WT）C57BL/6雌性小鼠。部分实验使用同龄同体重的雌性Langerin-白喉毒素受体（DTR）和CD301b-DTR小鼠。每组实验使用4至6只小鼠，数据代表三次独立实验的结果。本工作在生物安全等级3级条件下进行，但根据机构指南也可在生物安全等级2级条件下开展（室温23 °C ± 3 °C，湿度50% ± 10%）。

1. 白色念珠菌的制备

注意：本节实验均在生物安全柜中进行。

  1. 使用接种环和接种针将白色念珠菌（C. albicans）菌株SC5314划线接种至酵母-蛋白胨-葡萄糖-腺嘌呤（YPDA）琼脂平板上。
  2. 将平板倒置于30 °C培养2天。
    注意：含白色念珠菌（C. albicans）的YPDA琼脂平板可在4 °C保存最多1个月。
  3. 用无菌移液器吸头从平板上挑取单个菌落，接种于50 mL离心管中的10 mL YPDA液体培养基中。
  4. 在30 °C、230–250 rpm振荡条件下培养约17小时。
  5. 将酵母菌悬液转移至比色皿中，使用紫外-可见分光光度计每隔30分钟测定600 nm处的光密度（OD），直至OD600达到1.5–2.0。
    注意：此步骤可能需要16–18小时。
  6. 在1000 × g条件下离心5分钟。
  7. 弃去上清液，用适量无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重悬酵母细胞。
  8. 使用血细胞计数板对白色念珠菌（C. albicans）细胞进行计数，并在1000 × g条件下离心5分钟。
  9. 弃去上清液，将白色念珠菌（C. albicans）细胞重悬于PBS中，每足垫接种体积为40 µL，细胞浓度为1 × 107个细胞。
  10. 制备热灭活（HK）白色念珠菌（C. albicans）时，在确定细胞数量后，使用加热振荡器于65 °C加热60分钟以灭活酵母细胞。

2. 小鼠足垫感染 C. albicans

C. albicans experiment diagram; sensitization, challenge, footpad analysis, popliteal LN examination.
图1皮内示意图 白色念珠菌 感染模型 (A) 小鼠后足垫皮内注射 1 × 107 C. albicans7天后，小鼠足垫再次暴露于1 × 107 HK C. albicans 通过皮内注射，抗原攻击后24小时测量迟发型超敏反应。抗原攻击期间的局部免疫反应 C. albicans 7天后在皮肤引流淋巴结中分析致敏反应。B，C足垫在皮内注射前的足垫图像 C. albicans (D，E注射 C. albicans 到右足垫的真皮深层。F，G右足垫注射后出现红肿等临床症状。H) 示意图显示从足垫至腘窝淋巴结的淋巴通路 C. albicans 注射。 (我暴露膝后腘窝淋巴结，术后7天 白色念珠菌 注射和（J）未注射。缩写：HK = 热灭活；LNs = 淋巴结。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 将小鼠置于异氟烷诱导室中进行麻醉，直至小鼠呼吸频率变慢，且对脚趾或尾部夹捏无回缩反应。
    注意：麻醉期间建议使用眼药膏以防止眼睛干涩，尤其是当麻醉时间超过5分钟时。
  2. 取下31 G针头的帽，用已配制好的溶液填充0.3 mL胰岛素注射器 C. albicans 步骤1.9 细胞混匀后
  3. 将麻醉后的小鼠从麻醉诱导舱中取出，轻轻注射40 µL酵母细胞（1 × 107 细胞注入右足垫的真皮深层 C. albicans 致敏。
    注意：足垫可注射的最大体积为 50 µL。
  4. 缓慢地将注射器针头从注射部位抽出。
  5. 将每只小鼠单独置于笼中，直至其完全从麻醉中恢复，然后安全送回原笼。
  6. 为了产生针对抗原的特异性应答 C. albicans ，用制备好的HK刺激小鼠的右后足垫 C. albicans 通过皮内注射，于致敏后7天进行，具体方法如前所述（1 × 107 细胞；每足垫40 µL；重复步骤2.1-2.5。
  7. 7天后收获皮肤引流淋巴结 C. albicans 安乐死后24小时采集抗原攻击后的致敏或病变足垫组织2 腔室

3. 白喉毒素诱导的树突状细胞耗竭 体内

注意：在本研究中，Langerin-DTR 和 CD301b-DTR 小鼠均在皮内致敏白色念珠菌（C. albicans）前 1 天和后 1 天接受白喉毒素（DT）处理。

  1. 用 PBS 配制 10 µg/mL 的 DT 溶液。
  2. 取下 1 mL 胰岛素注射器针头的帽，混匀 DT，并用该溶液充满注射器。
  3. 将小鼠正确固定于头朝下的位置。
  4. 用 70% 乙醇对小鼠腹侧进行消毒。
  5. 将 100 µL 含 1 µg DT 的溶液缓慢注射到小鼠腹部左下象限的腹腔内，以清除特定的树突状细胞亚群。
    注意：注射时注意避免损伤器官。
  6. 等待 5 秒后，缓慢拔出针头。

4. 定量实时聚合酶链式反应

  1. 将小鼠放入 CO2 室内，直至观察不到呼吸运动。
  2. 用 70% 乙醇对小鼠进行消毒，并使用镊子和剪刀将后足垫皮肤的病损组织剪成小块。
  3. 将切碎的组织完全浸入 RNA 提取试剂中。
  4. 按照制造商说明书，使用组织匀浆器对样品进行匀浆（30 Hz 下运行 2 个循环，每个循环 3 分钟）。
    注意：本研究中使用不锈钢珠用于组织裂解。
  5. 在 4 °C 条件下，以 10,000 × g 离心 5 分钟。
  6. 小心将上清液转移至新的离心管中。
  7. 使用总 RNA 提取试剂盒从病损皮肤组织中提取总 RNA。
  8. 使用紫外-可见分光光度计测定 RNA 浓度。
  9. 使用逆转录试剂盒合成 cDNA，用于定量实时聚合酶链式反应（qPCR）。
  10. 利用实时 PCR 系统，通过绿色荧光染料监测 PCR 循环过程中双链 DNA 的合成，进行实时 qPCR。
    ​注意：本研究中，结果均以次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hprt）的表达水平为内参进行标准化。引物序列见表 1，PCR 程序如下：95 °C 预变性 30 秒，随后进行 42 个扩增循环（95 °C 变性 5 秒，60 °C 退火延伸 30 秒）。

5. 细胞分离与流式细胞术分析

  1. CO处理后2 安乐死小鼠后，使用镊子和剪刀解剖小鼠，小心暴露并采集位于膝关节后方、引流足垫的淋巴结，即腘窝淋巴结（popliteal LNs）。
  2. 使用3 mL注射器的推杆将每只小鼠足垫引流淋巴结组织匀浆后，通过70 µm细胞筛过滤，制备单细胞悬液。
  3. 用 PBS 洗涤细胞，在 500 × g 4 °C下离心5分钟。
  4. 弃去上清液，再用 PBS 洗涤细胞。
  5. 500 × g 离心 g 4 °C下离心5分钟。
  6. 弃去上清液，将细胞重悬于完全RPMI-10培养基中，加入55 µM β-巯基乙醇、50 ng/mL佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）和500 ng/mL离子霉素，在24孔板中进行T细胞刺激。
  7. 孵育1小时后，向细胞悬液中加入10 µg/mL布雷菲德菌素A和1000倍浓度的莫能菌素，继续培养5小时。
  8. 收集细胞，并用荧光激活细胞分选（FACS）缓冲液洗涤。
  9. 500 × 离心 g 4 °C下离心5分钟，弃去上清液。
  10. 使用可固定的死细胞染色染料对死细胞进行染色，并在 4 °C 下孵育 30 分钟。
  11. 用FACS缓冲液洗涤样品，并在500 × g下离心 g 4 °C下离心5分钟。
  12. 弃去上清液，在 4 °C 下用荧光染料标记的表面标志物抗体和 Fc 受体阻断剂对细胞染色 30 分钟。
  13. 用 FACS 缓冲液洗涤样品，在 500 × g 条件下离心 g 4 °C下离心5分钟。
  14. 弃去上清液，将沉淀的细胞重悬于固定和透化溶液中，在 4 °C 下孵育 15–20 分钟，用于胞内染色。
  15. 用1×洗涤缓冲液洗涤样品，并在500 × g下离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。
  16. 弃去上清液，在 4 °C 下进行细胞内细胞因子染色 30 分钟。
  17. 用1×洗涤缓冲液洗涤样本，并在500 × g下离心 g 4 °C下离心5分钟。
  18. 用适量（200–300 µL）FACS缓冲液重悬细胞。
  19. 使用流式细胞术分析蛋白质表达。

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结果

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在此，我们展示了一种皮内感染模型 C. albicans 研究皮肤树突状细胞介导的Th17免疫反应的作用 体内。在初次皮内注射后 C. albicans 足垫注射后，皮肤引流淋巴结增大（图2A）。在致敏期间，CD4⁺ T细胞与调节性T细胞的比值+ CD8+ 效应T细胞显著增加（图2B，C）。此外，效应CD4+ T细胞产生的IL-17A显著多于效应CD8细胞+ T细胞（图2D，E。这些结果表明，皮内 C. albicans 感染强烈驱动产生IL-17A的CD4细胞+ T细胞免疫

干扰素γ（Ifnγ), Il4 和 Il...

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讨论

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本文描述了一种皮内注射的方法 C. albicans 感染模型，可用于研究皮肤树突状细胞在Th17免疫应答中的作用 体内通过在DT诱导的小鼠品系中应用多参数流式细胞术分析，我们发现CD301b+ 真皮树突状细胞是启动针对深层真皮Th17免疫反应的关键皮肤树突状细胞亚群 C. albicans 感染。此外，结果表明，产生IL-17的T细胞反应主要由CD4产生+ 但不受 CD8 影响+ T细胞，表明该模型是Th17免疫的可靠模型 体内.

先前的精巧研究表明，表皮途径 C. albicans 感染通过产生IL-6的表皮LCs诱导Th17免疫反应14,16此外，针对 Th17 的免疫应答 C. albicans 皮肤表面感染特异性地由酵母相诱导，而菌丝相则不能诱导 白色念珠菌， 表明形...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

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本研究由延世大学医学院Samjung-Dalim教员研究基金（6-2019-0125）、韩国国家研究基金会基础科学研究中心项目（由教育部长资助，2019R1A6A1A03032869）和科学技术信息通信部长资助（2018R1A5A2025079、2019M3A9E8022135和2020R1C1C1014513）以及韩国疾病管理厅（KCDC，2020-ER6714-00）提供支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.3 mL (31 G) 胰岛素注射器 BD328822
1×  破膜/洗涤缓冲液BD554723
1 mL (30 G) 胰岛素注射器 BD328818
24 孔板Falcon353047
50 mL 圆底离心管Falcon50050
70 μm 滤网Falcon352350
70% 乙醇
ABI StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Applied Biosystems
麻醉室Harvard Apparatus
布雷菲德菌素 ABDBD 555029
β-巯基乙醇Gibco21985023
白色念珠菌 SC5314 菌株由匹兹堡大学 Daniel Kaplan 提供
CD3BioLegend100216克隆号 17A2
CD301b-DTR 小鼠由耶鲁大学 Akiko Iwasaki 提供
CD4BioLegend100408克隆号 GK1.5
CD44eBioscience47-0441-80克隆号 IM7
CD8aBD Biosciences553031克隆号 53.6.7
离心机
计数器
比色杯KartellKA.1938
Cytofix/Cytoperm 固定与破膜溶液BD554722
白喉毒素 (DT)Sigma
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)WelgeneLB001-02
FACS（荧光激活细胞分选）缓冲液实验室自制
Fc 受体阻断剂BD553142
胎牛血清 (FBS)WelgeneS101-07
镊子Roboz用于样本采集
血细胞计数板Fisher Scientific267110
Hybrid-R 总 RNA 提取试剂盒GeneAll Biotechnology305-101
羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)Gibco15630-080
IL-17A（细胞内细胞因子）BioLegend506912克隆号 TC11-18H10.1
离子霉素SigmaI0634
异氟烷
Langerin-DTR 小鼠由韩国科学技术院 Heung Kyu Lee 提供
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒InvitrogenL34957
接种环与接种针SPL90010
莫能菌素BDBD554724
NanoDrop 2000Thermo Scientific
青霉素 Gibco15140-122
培养皿SPL10090
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 (PMA)SigmaP8139
PrimeScript RT Master MixTakara BioRR360A
RPMI 1640 培养基Gibco11875-093
剪刀Roboz用于样本采集
5 mm 不锈钢研磨珠QIAGEN69989
无菌移液器吸头
SYBR Green Premix Ex Taq IITakara BioRR820A
TCRβBioLegend109228克隆号 H57-597
ThermoMixer CEppendorf
TissueLyserQIAGEN
紫外-可见光分光光度计PerkinElmer
野生型 C57BL/6 小鼠Orient Bio使用 7 至 9 周龄小鼠
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-腺嘌呤 (YPDA) 液体培养基，无菌（1% 酵母提取物，2% Bacto 蛋白胨，2% 葡萄糖）
YPDA 琼脂平板，无菌（1% 酵母提取物，2% Bacto 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% Bacto 琼脂）

参考文献

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