in vivo 条件下皮肤树突状细胞不同亚群在诱导皮肤内Candida albicans感染中Th17免疫反应的功能

摘要

在此，我们展示了皮肤树突状细胞亚群在深层真皮Candida albicans感染的Th17免疫反应中的体内功能。

摘要

皮肤是人体最外层的屏障器官，其中包含多种树突状细胞（DCs），这是一类专业的抗原呈递细胞。当皮肤遇到入侵病原体时，不同类型的皮肤DC会启动特异性的T细胞免疫反应以保护机体。在各类入侵病原体中，真菌感染特别能够驱动产生白细胞介素-17的Th17型保护性免疫反应。本研究建立了一种通过皮肤内注射Candida albicans感染高效诱导Th17细胞分化的实验方案，用于探究负责诱导Th17免疫反应的一类皮肤DC亚群。流式细胞术和基因表达分析显示，在引流淋巴结和感染皮肤组织中，Th17免疫反应显著增强。利用白喉毒素诱导的特定DC亚群耗竭小鼠模型，发现CD301b⁺真皮DC在此模型中对Th17细胞的最佳分化起关键作用。因此，该实验方案为研究不同皮肤DC亚群在深部皮肤真菌感染中诱导Th17免疫反应的in vivo功能提供了有价值的方法。

引言

皮肤是最外层的屏障器官，可保护机体免受外来病原体和刺激物的侵袭¹。皮肤由两个不同的层次组成：表皮——由角质形成细胞构成的复层上皮，以及其下方的真皮——由胶原蛋白和其他结构成分构成的致密网络。作为主要的上皮屏障组织，皮肤主要提供物理屏障，并因其含有大量常驻免疫细胞而参与构成额外的免疫屏障^2,3。在皮肤免疫细胞中，树突状细胞（DCs）是一类专业的抗原呈递细胞，能够主动摄取自身和非自身抗原，并迁移至局部淋巴结（LNs），根据抗原的性质启动抗原特异性的T细胞应答或免疫耐受⁴。

皮肤中含有表皮抗原呈递细胞，即朗格汉斯细胞（Langerhans cells, LCs）以及至少两种类型的树突状细胞（DCs），包括真皮I型传统树突状细胞（cDC1）和真皮II型传统树突状细胞（cDC2）⁵。表皮LCs起源于胚胎单核细胞系，在稳态条件下通过自我更新维持其细胞数量⁶。相比之下，真皮cDC1和cDC2起源于造血干细胞，并由定向分化的DC前体细胞持续补充⁵。皮肤树突状细胞以其表面标志物为特征，大致可分为Langerin⁺（包括L....

方案

注意：所有动物实验均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC，批准号：2019-0056，2019-0055）的批准。七 用于本研究的为9周龄、体重18–24 g的野生型（WT）C57BL/6雌性小鼠。部分实验使用同龄同体重的雌性Langerin-白喉毒素受体（DTR）和CD301b-DTR小鼠。每组实验使用4至6只小鼠，实验数据代表三次独立重复实验的结果。本工作在生物安全三级条件下进行，根据机构指南也可在生物安全二级条件下开展（室温） 23 °C ± 3 °C，湿度50% ± 10%).

1. 白色念珠菌的制备

注意：本节中的实验均在生物安全柜中进行。

1. 使用接种环和接种针将 C. albicans 菌株 SC5314 划线接种至酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-腺嘌呤（YPDA）琼脂平板上。
2. 将平板倒置于 30 °C 培养 2 天。
   注意：含 C. albicans 的 YPDA 琼脂平板可在 4 °C 下保存最多 1 个月。
3. 从平板上挑取单个菌落，用无菌移液器吸头接种于 50 mL 管中的 10 mL YPDA 培养基中。
4. 在 30 °C 下以 230–250 rpm 振荡培养约 17 小时。
5. 将酵母菌悬液置于比色皿中，....

结果

在此，我们展示了一种皮内感染模型 C. albicans 研究皮肤树突状细胞介导的 Th17 免疫反应的作用 体内. 经初次皮内注射后 C. albicans 足垫注射后，皮肤引流淋巴结肿大（图2A）。在致敏期间，CD4⁺ T细胞与调节性T细胞的比值⁺ CD8⁺ 效应T细胞明显增加（图 2B，C。此外，效应CD4⁺ T细胞相较于效应CD8细胞大量产生IL-17A⁺ T细胞（图 2D，E。这些结果表明，皮内 C. albicans 感染强烈诱导产生 IL-17A 的 CD4⁺ T细胞免疫

干扰素γ（interferon gamma，IFN-γ）的表达If.......

讨论

本文描述了一种皮内注射的方法 C. albicans 感染模型，可用于研究皮肤树突状细胞在Th17免疫应答中的作用 体内通过在DT诱导的小鼠品系中应用多参数流式细胞术分析，我们发现CD301b⁺ 真皮树突状细胞是启动针对深层真皮Th17免疫反应的关键皮肤树突状细胞亚群 C. albicans 感染。此外，结果表明，产生IL-17的T细胞反应主要由CD4产生⁺ 但不受 CD8 影响⁺ T细胞，表明该模型是Th17免疫的可靠模型 体内.

先前的精巧研究表明，表皮途径 C. albicans 感染通过产生IL-6的表皮LCs诱导Th17免疫反应^14,16此外，针对 Th17 的免疫应答 C. albicans 皮肤表面感染特异性地由酵母相诱导，而菌丝相则不能诱导 白色念珠菌， 表明形.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.3 mL (31 G) 胰岛素注射器	BD	328822
1×  破膜/洗涤缓冲液	BD	554723
1 mL (30 G) 胰岛素注射器	BD	328818
24 孔板	Falcon	353047
50 mL 圆底离心管	Falcon	50050
70 μm 滤网	Falcon	352350
70% 乙醇
ABI StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统	Applied Biosystems
麻醉室	Harvard Apparatus
布雷菲德菌素 A	BD	BD 555029
β-巯基乙醇	Gibco	21985023
白色念珠菌 SC5314 菌株			由匹兹堡大学 Daniel Kaplan 提供
CD3	BioLegend	100216	克隆号 17A2
CD301b-DTR 小鼠			由耶鲁大学 Akiko Iwasaki 提供
CD4	BioLegend	100408	克隆号 GK1.5
CD44	eBioscience	47-0441-80	克隆号 IM7
CD8a	BD Biosciences	553031	克隆号 53.6.7
离心机
计数器
比色杯	Kartell	KA.1938
Cytofix/Cytoperm 固定与破膜溶液	BD	554722
白喉毒素 (DT)	Sigma
杜氏磷酸盐缓冲液 (DPBS)	Welgene	LB001-02
FACS（荧光激活细胞分选）缓冲液	实验室自制
Fc 受体阻断剂	BD	553142
胎牛血清 (FBS)	Welgene	S101-07
镊子	Roboz		用于样本采集
血细胞计数板	Fisher Scientific	267110
Hybrid-R 总 RNA 提取试剂盒	GeneAll Biotechnology	305-101
羟乙基哌嗪乙磺酸 (HEPES)	Gibco	15630-080
IL-17A（细胞内细胞因子）	BioLegend	506912	克隆号 TC11-18H10.1
离子霉素	Sigma	I0634
异氟烷
Langerin-DTR 小鼠			由韩国科学技术院 Heung Kyu Lee 提供
LIVE/DEAD 可固定 Aqua 死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L34957
接种环与接种针	SPL	90010
莫能菌素	BD	BD554724
NanoDrop 2000	Thermo Scientific
青霉素	Gibco	15140-122
培养皿	SPL	10090
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 (PMA)	Sigma	P8139
PrimeScript RT Master Mix	Takara Bio	RR360A
RPMI 1640 培养基	Gibco	11875-093
剪刀	Roboz		用于样本采集
5 mm 不锈钢研磨珠	QIAGEN	69989
无菌移液器吸头
SYBR Green Premix Ex Taq II	Takara Bio	RR820A
TCRβ	BioLegend	109228	克隆号 H57-597
ThermoMixer C	Eppendorf
TissueLyser	QIAGEN
紫外-可见光分光光度计	PerkinElmer
野生型 C57BL/6 小鼠	Orient Bio		使用 7 至 9 周龄小鼠
酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖-腺嘌呤 (YPDA) 液体培养基，无菌（1% 酵母提取物，2% Bacto 蛋白胨，2% 葡萄糖）
YPDA 琼脂平板，无菌（1% 酵母提取物，2% Bacto 蛋白胨，2% 葡萄糖，2% Bacto 琼脂）