需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测

2.7K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/62813

⸱

2021年7月16日

 ,  ,  , 
1Jefferson Weinberg ALS Center, Thomas Jefferson University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

描述了两种相关方法，用于可视化突触传递所需的亚细胞事件。这些方案通过活细胞成像技术，实现对突触前钙离子内流和突触囊泡膜融合动态过程的实时监测。 体外 培养的神经元

摘要

在肌萎缩侧索硬化症（ALS）和/或额颞叶痴呆（FTLD）患者出现神经元变性之前，运动和认知功能障碍的原因是神经元之间以及运动神经元与肌肉之间的通讯功能障碍。突触传递的基本过程涉及膜去极化依赖性的突触小泡融合，并将神经递质释放到突触间隙中。该过程通过突触小泡所在部位的突触前末梢局部钙离子内流而实现。本文所述方案介绍了一种基于荧光的活体成像方法，可可靠地报告培养神经元中去极化介导的突触小泡胞吐作用及突触前末梢钙离子内流动态。

通过使用一种可掺入突触小泡膜的苯乙烯基染料，可以阐明突触小泡的释放过程。另一方面，为了研究钙离子内流，我们使用Gcamp6m，一种基因编码的荧光报告分子。我们采用高浓度氯化钾介导的去极化来模拟神经元活动。为了明确量化突触小泡的胞吐作用，我们测量归一化后的苯乙烯基染料荧光随时间的减少量。在相似的刺激条件下，钙离子内流会导致Gcamp6m的荧光增强。这种荧光变化的归一化与定量分析方法与苯乙烯基染料实验方案类似。这些方法可与基于转染的荧光标记突变蛋白过表达技术联合使用。这些实验方案已被广泛应用于研究FUS-ALS和C9ORF72-ALS模型中的突触功能障碍，所用细胞包括原代啮齿类动物皮层神经元和运动神经元。这些方案可便捷地用于快速筛选可能改善神经元通讯的化合物。因此，这些方法不仅对ALS研究具有重要价值，也适用于神经退行性疾病和发育神经科学领域的各项研究。

引言

在实验室中建立肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型面临独特的挑战，主要原因在于超过80%的病例为散发性1，同时存在大量已知致病的基因突变2。尽管如此，所有ALS病例均具有一项共同特征：在神经元明显变性之前，突触前运动神经元与突触后肌细胞之间的通讯功能已出现障碍3,4。临床上，随着患者残余的上、下运动神经元连接性逐渐丧失，整个病程中可表现出神经元过度兴奋与兴奋性降低的特征5,6,7,8,9，这反映了这些突触背后复杂的分子变化，而我们作为ALS研究人员，正致力于揭示其机制。

多种转基因模型表明，随着ALS致病性基因突变（包括SOD1）的表达，神经肌肉接头会出现退化和结构紊乱10，FUS11,12C9orf7213,14,15,16和 TDP4317,18,19 通过形态学评估，包括突触小结、树突棘密度以及突触前/突触后结构的分析。从机制上讲，自20世纪30年代Cole、Hodgkin和Huxley的里程碑式论文发表以来，还可通过电生理技术来评估突触反应，无论是在 体外 细胞培养或组织切片制备20通过这些策略，许多肌萎缩侧索硬化症（ALS）模型已表现出突触传递功能缺陷。例如，TDP43的一种突变体可导致NSC-34（脊髓与神经母细胞瘤杂交细胞系34）运动神经元样细胞的放电频率增强以及动作电位阈值降低21该相同变异还在小鼠模型出现行为性运动缺陷之前，导致神经肌肉接头（NMJ）处突触传递功能障碍。22先前研究表明，在运动障碍出现之前，FUS-ALS 果蝇模型中突变型 FUS 的表达会导致神经肌肉接头（NMJ）处突触传递减弱11. 一项近期研究报告利用来自C9orf72基因扩增携带者的诱导性多能干细胞，发现突触囊泡的易释放池减少23这些研究及其他相关工作共同强调了在与ALS相关的疾病模型中，深入理解突触信号传导机制的重要性。这对于阐明ALS的发病机制并为患者开发潜在的治疗靶点具有关键意义。

采用电流钳和电压钳技术研究细胞，对于确定膜的特性（如电导率、静息膜电位以及单个突触的量子含量）具有重要价值20,24。然而，电生理学的一个重要局限性在于其技术难度较高，且每次只能获取单个神经元的信息。活细胞共聚焦显微镜结合特异性荧光探针，则为在时空维度上研究神经元突触传递提供了可能25,26,27。尽管该荧光方法并非对神经元兴奋性的直接测量，但它可相对定量地反映突触功能的两个分子相关事件：突触小泡释放以及突触终末的钙瞬变。

当动作电位到达神经元的突触前终末区域时，会触发钙瞬变，从而促进电信号向神经递质释放过程的转换28定位于这些区域的电压门控钙通道可严格调控钙信号，从而调节神经递质释放的动力学过程29首次基于荧光的钙瞬变记录是使用双波长指示剂Fura-2 AM或单波长染料Fluo-3 AM完成的30,31,32尽管这些染料在当时提供了重要的新见解，但它们存在若干局限性，例如在细胞内的非特异性区室化、标记细胞中染料的主动或被动丢失、光漂白现象，以及在长时间成像时可能产生的毒性。33在过去十年中，基因编码的钙离子指示剂已成为成像各种神经元活动的主要工具。这些指示剂将改良的荧光蛋白与钙螯合蛋白相结合，在结合 Ca²⁺ 后可快速改变荧光强度。2+ 离子34这些新指示剂的应用范围十分广泛，可更简便地实现对细胞内钙瞬变的可视化观察 体外 和 体内 设置。其中一类被称为 GCaMP 的基因编码报告分子现已被广泛使用。这些指示剂包含一个 C 末端的钙调蛋白结构域，其后是绿色荧光蛋白（GFP），并由一个 N 末端的钙调蛋白结合区封端。35,36钙离子与钙调蛋白结构域结合后，会触发其与钙调蛋白结合区的相互作用，导致蛋白质整体构象发生变化，并显著增强GFP片段的荧光强度。35,36多年来，这一类报告基因经历了多次演变，以实现对具有特定动力学特征（慢速、中速和快速）的特定钙瞬变进行不同的信号读出，每种均具有略微不同的特性。37,38. 此处强调了报告基因 GcaMP6 的应用，该基因此前已被证明可检测神经元中的单个动作电位及树突钙瞬变 体内 和 体外37.

突触前区的钙瞬变触发突触小泡融合事件，导致神经递质释放到突触间隙，并启动突触后细胞内的信号传导过程28,39。突触小泡既可快速释放，又可被迅速回收，以维持细胞膜表面积的稳态以及具备融合能力的可立即释放小泡池的稳定40。本实验所用的苯乙烯类染料对脂质膜具有亲和性，并能根据周围脂质环境的有序程度特异性地改变其发射特性41,42。因此，该染料是标记可循环利用的突触小泡并随后追踪这些小泡在神经元刺激后释放过程的理想工具41,42。本方案是在Gaffield及其同事最初描述的概念基础上改进和优化的，使我们能够连续长时间地观察苯乙烯类染料标记的突触小泡荧光斑点41。

本文介绍了两种基于荧光的关联方法，可可靠地报告突触传递过程中涉及的特定细胞事件。已建立的实验方案可用于检测培养神经元中去极化介导的突触前末梢钙离子内流以及突触小泡外排的动力学过程。此处所述的方法及代表性结果主要聚焦于使用原代啮齿类动物皮层神经元或运动神经元作为体外（in vitro）模型系统，已有发表的研究采用过这些细胞类型43,44。然而，这些方法同样适用于分化的人i3类皮层样神经元45，我们实验室在当前正在进行的实验中已成功应用这两种方案。总体实验流程以逐步线性方式呈现，如图1所示。简而言之，为研究神经突中的钙动力学，将成熟神经元转染携带GCaMP6m荧光报告基因的质粒DNA，使其在巨细胞病毒（Cytomegalovirus, CMV）启动子驱动下表达37,46。转染后的细胞具有较低的基础绿色荧光水平，而在钙离子存在时荧光强度增强。通过设定感兴趣区域，可在实验操作过程中监测荧光变化，从而实现对钙离子时空高度局部化波动的测量37,46。为评估突触小泡融合与释放，将成熟神经元加载苯乙烯基染料（styryl dye），该染料在突触前细胞中随突触小泡的循环、重建及神经递质再填充而整合入其膜结构41,42,43,47,48。目前用于此目的的染料可标记神经突上的突触小泡，在活体成像实验中可作为这些区域的替代指标，Kraszewski及其同事通过苯乙烯基染料与突触素（synaptotagmin）的共染色已证实这一点49。本文还包括了类似染色的代表性图像（图2A）。先前的研究者已广泛使用此类染料来报告神经肌肉接头和海马神经元中突触小泡的动力学行为48,49,50,51,52,53,54,55,56。通过选择染料标记小泡的点状区域，并监测小泡释放后荧光强度的下降，可在刺激后研究功能性突触传递能力及释放的时间动力学特征43。对于两种方法，均使用含有高浓度氯化钾的培养基处理细胞，以诱导去极化，模拟神经元活动。设定成像参数，以捕捉从基线归一化开始，继而进入刺激采集阶段的亚秒级时间间隔。在每个时间点测定荧光信号，经背景校正后，在整个实验时间段内进行定量分析。通过该策略，可检测到由钙内流引起的GCaMP6m荧光增强，或有效突触小泡外排导致的苯乙烯基染料荧光减弱。以下将详细描述这两种实验方案的具体方法设置与参数，并讨论其优势与局限性。

神经元培养实验流程：解剖、DNA转染、显微成像、刺激处理、数据分析
图1整体通用实验流程的可视化呈现。 (1分离和培养原代啮齿类动物神经元 体外 至选定的成熟时间点。2) 引入 GCaMP DNA 或苯乙烯基染料作为突触活动的报告分子。3) 使用配备活体成像功能的共聚焦显微镜及配套软件设置成像方案。开始基线记录期。4在细胞仍在进行活体成像采集时，通过高浓度KCl浴灌注刺激神经元。5随时间评估荧光强度测量值，以检测钙瞬变或突触囊泡融合。 请点击此处以查看此图的放大版本。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中进行的所有动物实验均经杰斐逊大学机构动物护理和使用委员会批准。

1. 胚胎大鼠皮层神经元的原代培养

注意：原代皮层神经元取自 E17.5 大鼠胚胎，方法如先前文献所述57,58。该培养方案的成功率未见品系偏好性。下文将简要描述该方法，完整细节请参考前述相关文献。

  1. 通过吸入 CO2 处死怀孕的雌性大鼠，随后通过颈椎脱位进行二次确认。
  2. 在冰上预冷的 20 mM HEPES 缓冲的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）中收获胚胎并分离脑组织。从大脑皮层外层分离并弃去纹状体和海马，收集大脑皮层组织。
  3. 使用精细镊子去除大脑皮层上的脑膜。操作时，用一只手的闭合镊子轻轻夹住皮层组织固定位置。
    注：用另一只手的镊子夹住脑膜，通过夹持镊子的滚动动作剥离脑膜。必要时重新调整闭合镊子的位置，重复操作直至完全去除脑膜。
  4. 将大脑皮层组织置于含 10 µg/mL 木瓜蛋白酶的 HBSS 溶液中，37 °C 孵育 4 分钟。
  5. 用 HBSS 洗涤三次，然后用火焰抛光的玻璃巴斯德移液管轻柔吹打 5–10 次，以获得均一的细胞悬液。
    ​注：避免产生气泡；吹打时保持移液管始终浸没在细胞悬液中。
  6. 将神经元以每皿 75,000 个细胞的密度接种于经 100 µg/mL 多聚-D-赖氨酸包被的 35 mm 玻底培养皿中，培养基为含 B27 添加剂（2%）和青霉素-链霉素的神经基础培养基。

2. 从胚胎大鼠脊髓中分离运动神经元的原代培养

注意：初级运动神经元按照先前描述的方法从E13.5大鼠胚胎中制备，仅做了少量修改59,60。该培养方案的成功率未显示出任何品系偏好性。下文将简要描述该方法，完整细节请参考前述相关文献。

  1. 按照步骤 1.1 处死怀孕的雌性大鼠。
  2. 从胚胎中解剖出 10–20 个脊髓，并使用两对镊子分别进行夹捏和牵拉，将组织机械性地破碎成小片段。
  3. 在 0.025% 胰蛋白酶中孵育 8 分钟，随后加入 DNase 至终浓度为 1 mg/mL。
  4. 在 4 °C 条件下，以 470 × g 离心 5 分钟，通过 4%（w/v）BSA 垫层，离心过程中不使用刹车。
  5. 将沉淀的细胞在 4 °C 条件下，通过 10.4%（v/v）密度梯度介质（见材料表）垫层，以 830 × g 离心 55 分钟，离心过程中不使用刹车。收集在界面处可见的运动神经元条带。
    注意：为确保捕获所有细胞，密度梯度步骤应使用无酚培养基，其余步骤则使用含酚培养基。密度梯度介质与解离介质之间的界面可根据颜色差异清晰识别。
  6. 将收集的条带再次通过 4%（w/v）BSA 垫层，在 4 °C 条件下以 470 × g 离心 5 分钟，离心过程中不使用刹车。
  7. 将纯化的运动神经元重悬于完全神经基础培养基中，添加 B27 补充剂（2%）、谷氨酰胺（0.25%）、2-巯基乙醇（0.1%）、马血清（2%）以及青霉素-链霉素。
  8. 将神经元接种于预先用 100 µg/mL 多聚赖氨酸和 3 µg/mL 层粘连蛋白包被的盖玻片上，接种密度为每 35 mm 玻底培养皿 50,000 个细胞。

3. 神经元转染

注意：此步骤适用于将进行GCaMP钙成像和/或在突触评估之前预先导入外源性DNA质粒或 目标RNA 的神经元。相比之下，苯乙烯染料是在成像前立即加载的，相关内容见第6节。以下总结的是在本示例中用于原代啮齿类动物神经元的转染方案，但可根据用户需求轻松调整和优化。

  1. 原代培养皮质神经元的转染在第12天进行 体外 （第12天），而运动神经元在第7天进行转染 体外 （体外培养7天）
    注意：以下所有步骤均须在无菌生物安全柜内进行。
  2. 使用转染试剂按1:2的体积比转染500 ng GCaMP6m。进行共转染时，每皿总DNA量为1.25 µg，并保持相同的DNA与试剂比例。
    注意：在所示的实验示例中，已转染750 ng与ALS/FTD相关的质粒以表达C9orf72-ALS相关的二肽、突变型FUS蛋白等。确保共转染质粒的荧光标签不会与GCaMP成像的FITC通道发生冲突。同样，若进行苯乙烯染料成像，需确保共转染质粒不会与成像的TRITC通道发生冲突。本方案中使用突触素-synaptophysin-GCaMP3同样有效。因此，转染相同量的该质粒，并按照第7节的常规步骤进行操作。
  3. 将DNA-转染试剂复合物在室温下孵育10分钟。
  4. 将孵育后的复合物轻轻滴加至神经元中，同时轻柔旋转混匀。将培养皿放回 CO2 37 °C 培养箱中孵育 45–60 分钟。
  5. 移除含有DNA-转染试剂复合物的全部培养基，替换为体积比50:50的预条件培养基与新鲜神经元培养基的混合液。然后将细胞放回CO2 孵育箱中孵育48小时，直至成像。

4. 缓冲溶液和苯乙烯染料储备液的配制

  1. 使用表1中列出的成分，在成像前新鲜配制低浓度和高浓度 aCSF 溶液。使用前对两种缓冲液均进行过滤。
    注意：CaCl2 二水合物在储存过程中可能生成 Ca(OH)2。为达到最佳效果，应始终使用最近开启的容器。若无法做到，则可在加入 CaCl2 前，用气态 CO2 对其碳酸化处理 5 分钟，以去除表面的 Ca(OH)2 并确保最大溶解度。若执行此步骤，需调节最终溶液的 pH 值至 7.4，因为过度碳酸化会导致生成 Ca(HCO3)2。
低 KCl aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂浓度
HEPES10 mM
NaCl140 mM
KCl5 mM
葡萄糖10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM
高 KCl aCSF 缓冲液（pH 7.40 至 7.45）
试剂浓度
HEPES10 mM
NaCl95 mM
KCl50 mM
葡萄糖10 mM
CaCl2 2H2O2 mM
MgCl2 4H2O1 mM

表1：人工脑脊液（aCSF）缓冲液的成分。 本表格列出了用于成像和刺激神经元时所使用的低浓度和高浓度KCl人工脑脊液缓冲液的配制成分。配制方法详见第4节。

  1. 取一支100 µg的苯乙烯染料，用蒸馏水或Neurobasal培养基重悬，配制成10 mM的染料储备液。

5. 显微镜和灌流系统设置

注意：对于成像玻璃底培养皿，建议使用倒置共聚焦荧光显微镜，因其具有灌流操作的灵活性，并可使用高数值孔径的油浸物镜。有关在代表性结果部分中详细描述的成像示例所使用的共聚焦显微镜、相机和物镜，请参见材料表。

  1. 使用与培养箱系统耦合的载物台，在 37 °C 及持续 5% CO2 条件下进行所有实验 。
  2. 使用共聚焦显微软件控制图像采集。在成像会话开始时优化采集参数，选择激发光功率和增益，以确保信号的最佳可视化，同时避免光漂白。
    1. 所有样品的激发光功率、曝光时间、探测器增益和帧率应保持一致。采用 512 × 512 的纵横比和每秒 2 幅图像的帧率进行延时成像，以最小化染料漂白。
      注意：虽然荧光点应清晰可见，但激光强度应设置为尽可能低，以避免漂白和光毒性。将共聚焦针孔设置为最窄，以实现神经突内荧光点的最佳分辨率。曝光时间设定为 200 ms 或更短，并在所有样品中保持一致。所用相机的最大成像速度为每秒 2 幅图像。若使用更快的相机，可采集更多图像/秒。应尽可能选择合适的时间成像参数。
  3. 使用共聚焦显微软件成像时，选择以下荧光激发/二向色/发射滤光片组合：Gcamp6m/Gcamp3 使用 FITC，苯乙烯染料使用 TRITC。
  4. 在延时成像过程中，使用共聚焦成像采集软件的完美聚焦功能，以避免 z-轴漂移。
    注意：由于成像速度较快，仅对单个焦平面进行成像。确保实验过程中无 z 轴漂移至关重要。
  5. 在图像采集面板中选择 时间 选项卡，以设置记录周期和间隔。
    1. 将 第 1 阶段 设置为 间隔 500 ms，持续时间 3 - 5 分钟。
    2. 将 第 2 阶段 设置为 间隔 500 ms，持续时间 5 分钟。
      注意：第 1 阶段对应基线记录，第 2 阶段对应刺激期。
  6. 使用阀门控制系统和通道歧管组装用于 aCSF 的重力灌注装置。
    1. 将高 KCl 溶液（见 表 1）装入装置顶部的 50 mL 注射器中，管道贯穿整个系统。设置流速为 1 mL/min。
  7. 将含有神经元的 35 mm 玻璃培养皿放置在共聚焦显微镜的成像载物台上，灌注管末端置于培养皿边缘。选择成像视野。

6. 突触小泡释放的苯乙烯染料成像

  1. 在低KCl人工脑脊液中孵育细胞（参见 表137 °C、转染后48小时孵育10分钟
  2. 在玻璃底培养皿中接种原代皮层神经元或运动神经元，并加入styryl染料。
    1. 吸除低KCl aCSF。
    2. 在避光条件下，用移液器将神经元与含50 mM KCl的aCSF中的10 µM styryl染料共同孵育5分钟。
    3. 去除上样液，用低KCl人工脑脊液孵育神经元10分钟，以消除非特异性染料上样。
  3. 将35 mm玻璃底培养皿置于成像载物台上，然后在倒置共聚焦显微镜的20倍物镜或40倍油镜下观察。
    注意：若细胞共转染了带GFP标签的质粒，请利用GFP荧光定位转染细胞。
  4. 使用546 nm激光激发styril染料，通过630-730 nm（TRITC）带通滤光片收集发射光。
  5. 选择成像区域并启用完美聚焦功能。随后，使用明场、TRITC和荧光标记通道拍摄一张静态图像，以标记神经元边界。
  6. 启动 立即运行 在采集软件中进行3-5分钟的基础记录，以排除染料强度可能存在的变异（第#1阶段）。
    注意：必须确保染料荧光强度的降低是由于突触囊泡释放所致，而非染料被动扩散或光漂白所引起。这一3-5分钟的刺激前记录期应使染料荧光强度保持稳定。该记录阶段的最后30秒将用于确定每个感兴趣区域（ROI）的平均基线荧光值。在评估实验条件之前，还可额外进行约10分钟的无刺激连续记录，使用预定的图像采集参数，以确认在长时间激光照射下荧光信号仍保持稳定。
  7. 切换到第2阶段时，触发 开启 灌流系统按钮。随后，持续向神经元灌注50 mM KCl以促进染料卸载（第2阶段）。
    1. 加入KCl后进行300秒记录。此后采集停止；触发 关闭 灌注系统的开关。
  8. 保存实验并使用共聚焦软件分析数据，具体步骤如下文第8节所述。
    ​注意：实验可在此处暂停，分析可稍后进行。若细胞无需转染即可表达目标蛋白，则本方案可在任意时间点实施。 体外 在试图检测突触卸载功能时，应先对对照细胞进行检测，以确保突触卸载正常。实验操作者应对每孔细胞所处的遗传学或药理学条件保持盲态，以尽量减少偏倚。

7. Gcamp6m 钙瞬态的荧光成像

  1. 在35 mm玻璃底培养皿中培养的原代啮齿类动物皮层神经元中转染500 ng Gcamp6m，具体操作见第3节。
    注意：如有需要，可将神经元与含有红色或远红光范围荧光标签的目的质粒共转染。
  2. 转染后48小时，用低KCl aCSF孵育神经元15分钟，然后将培养皿置于成像平台上。
  3. 使用FITC滤光片（488 nm）和20倍或40倍物镜观察GCaMP6m荧光。
  4. 选择成像区域并启用完美聚焦功能。随后，使用明场、FITC和荧光标记通道拍摄一张静态图像，以标记神经元边界。
  5. 启动 立即运行 在采集软件中进行5分钟的基线记录，然后以与第6节染料实验所述相同的方式，用含有50 mM KCl的aCSF进行灌注。
    注意：本成像的目的是测量刺激诱发的钙瞬变。若神经元在刺激前阶段存在基础放电活动或钙信号波动，则该细胞不纳入数据分析。仅选用背景荧光稳定的细胞进行分析。刺激后阶段可延长至60分钟以观察钙瞬变，期间可继续灌注高浓度KCl溶液，也可不进行额外持续灌注。
  6. 保存实验，并使用共聚焦软件按照下文第8节所述方法分析数据。此时可停止实验，后续再进行数据分析。
    ​注意：如果细胞无需转染即可表达目的蛋白，则可在任意时间点进行本实验方案 体外 在检测钙瞬变时，应首先测试对照细胞以确保钙瞬变信号的可测量性。实验操作者应对每孔细胞所处的遗传学或药理学处理条件保持盲态，以尽量减少偏倚。

8. 图像分析

  1. 使用共聚焦软件打开延时成像图片。
  2. 通过以下命令序列对延时图像序列进行对齐：Image | Processing | Align Current Document。选择Align to the First Frame。
  3. 使用图像右侧的ROI选择工具（一个豆形图标）沿神经突选择感兴趣区域（ROIs）（图3B）。同时标记一个代表背景荧光强度的ROI。
    注意：通过明场静态图像中标记的神经元轨迹上明显分离的点状结构区域来选择ROIs。每个神经元至少选择五个ROIs用于分析。背景ROI应选在视野中不含神经突的区域。
  4. 使用以下命令序列测量所选ROIs随时间变化的原始荧光强度：Measure | Time Measurement。
    1. 在Time Measurement面板的上部启动Measure功能，将生成随时间变化的原始荧光强度图（图3C）以及定量数据。
      注意：每个数据点代表该ROI在对应特定测量时间点的帧中的原始荧光强度。
  5. 将原始荧光强度数据导出至电子表格软件。
  6. 对每个ROI独立进行分析。首先，在每个时间点从目标ROI的荧光强度中减去背景ROI的强度，以对数据进行归一化处理。
    1. 取每个特定时间点背景ROI的原始荧光值，并从该时间点目标ROI的原始荧光强度值中减去该值。
      注意：此操作需在整个记录期间（包括基础期和刺激期）进行。
  7. 确定基线最后30秒内目标ROI的平均荧光强度。
    1. 对步骤8.6中生成的归一化原始基础值，在3-5分钟基础记录期的最后30秒内取平均值。
      注意：可使用整个基础记录期计算该值。但由于该值趋于稳定并保持恒定，最后30秒共60个时间点已具有足够的采样量以代表整体水平。
  8. 将此基线值与每个时间点的归一化强度值进行比较，得到荧光变化量（ΔF）。
    1. 取步骤8.8所得数值，减去平均基线荧光值。此步骤及后续所有步骤均需覆盖整个记录期，包括基础期和刺激期。
  9. 将上述荧光变化量相对于基线荧光值进行计算，得到荧光变化量与基线荧光值的比值（ΔF/F）。具体方法为：将步骤8.8所得数值除以平均基线荧光值。
  10. 最后，将起始点的数值设为1，以便于在图中直观显示随时间变化的上升或下降趋势。
    1. 取步骤8.9中得到的数值并加1。
      ​注意：若操作正确，基线期30秒的数据值应围绕1上下波动。在有效释放突触内容物的细胞中，该值在刺激开始后应从1逐渐下降至0。步骤6-9的示例见图3E。

9. 数据分析

注意：实验人员可根据需要了解实验分组情况，以便合理合并数据进行分析。每个实验条件应至少包含来自三次独立实验的各10个神经元。仅当每个神经元中可划定至少五个ROI区域时，方可将其纳入分析。在已发表的研究中，该实验重复水平足以显示携带ALS相关poly-GA的细胞相较于GFP对照组出现显著的突触卸载功能丧失（见代表性结果）。然而，若观察到的表型较为细微，用户可能需要优化生物学重复和/或技术重复的次数。

  1. 根据特定实验条件下各感兴趣区域（ROI）随时间变化计算出的全部 ΔF/F 值，确定每个时间点的平均 ΔF/F 值及其标准误（SEM）。
  2. 使用绘图与统计分析软件以 xy 坐标格式绘制数据，其中 x 轴表示经过的时间，y 轴表示步骤 9.1 中计算得到的 ΔF/F 值。所有数据均以均值 ± 标准误（SEM）形式呈现。
  3. 为确定统计学显著性，比较两组时采用学生 t 检验（Student's t-test），比较三组或更多组时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Tukey 事后检验（Tukey's posthoc analysis）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

在成功实施上述方案后，展示了一项典型的苯乙烯类染料突触小泡释放实验的代表性结果。培养的大鼠原代皮层神经元按照第6节所述方法加载染料。通过与突触小泡标志物突触素（synaptophysin）共标记来确定染料加载的特异性。大多数苯乙烯类染料阳性的斑点与此标志物共定位（图2A）。为确定苯乙烯类染料成像所用参数是否引起光漂白，通常对未处理的孔进行染料加载，并在无刺激条件下持续成像10分钟，以确保荧光值保持稳定。

此外，结果再次通过突触素（synaptophysin）与苯乙烯染料（styryl dye）的共标记来展示，如图2A所示。这些荧光团的共聚焦成像采用第6节中针对TRITC苯乙烯染料成像所描述的方案，并通过在DAPI通道使用高强度激光功率同时捕获突触素的荧光信号，以可视化mTurquoise-突触素。图中展示了刺激前后突触区域的代表性图像（图2B）。尽管该方法是对光漂白缺失的间接推断，但对整个成像期间原始强度...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

两种所述方法中均包含三个关键步骤，对实验成功和获得可量化的结果至关重要。首先，每次实验前必须根据附带说明新鲜配制人工脑脊液（aCSF），这是必不可少的步骤。若未做到这一点，可能导致神经元无法正常去极化。在刺激任何实验组之前，应持续检测未经处理的对照组神经元，以确保细胞能够正常去极化，并为该次成像实验中获得的阳性结果提供基准参考。其次，为了成功追踪特定突触区域随时间变化的荧光信号，在设定成像参数及选择用于监测的感兴趣区域（ROI）时也需格外谨慎。基线记录阶段应无缝过渡至刺激记录阶段。必须采用足够高的帧率（每秒2帧），以准确捕捉styryl染料释放的单次衰减动力学过程。最后，实验分析中的一个关键步骤是将荧光强度测量值首先归一化至成像背景，再归一化至刺激前的基线水平。与其他成像方案类似，需首先从所有配对的时间-荧光测量值中减去空白成像区域的信号，以消除因加入KCl培养基可能引入的背景 自发荧光。此外，还必须测量并计算每个ROI在刺激前最后30秒基线期的平均荧光读数。该平均起始值将作为该ROI所有时间点测量的明确定义的起始点，用于量化"相对于基线的变化"强度。

原...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

我们感谢杰斐逊温伯格肌萎缩侧索硬化症中心的现任和前任成员，他们为优化这些技术及其分析方法提供了宝贵的反馈意见和建议。本研究得到了美国国立卫生研究院（NIH）（资助号：RF1-AG057882-01 和 R21-NS0103118，授予 D.T）、美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）（资助号：R56-NS092572 和 R01-NS109150，授予 P.P）、肌肉萎缩症协会（D.T.）、罗伯特·帕卡德肌萎缩侧索硬化症研究中心（D.T.）、Family Strong 4 ALS 基金会以及法伯家族基金会（B.K.J.、K.K 和 P.P）的资助支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
20倍空气物镜Nikon用于成像
40倍油浸物镜Nikon用于成像
B27添加剂Thermo Scientific17504044神经元生长添加剂
BD无针注射器，50 mLThermo Scientific13-689-8重力灌流装置的组成部分
生物安全细胞培养罩BakerSterilGARD III SG403A用于无菌细胞培养、转染和染料加载
β-巯基乙醇Millipore SigmaM3148用于神经元培养的培养与维持
牛血清白蛋白Millipore SigmaA9418用于制备神经元培养物
二水合氯化钙Millipore Sigma223506aCSF溶液的组分
细胞培养CO2培养箱Thermo Scientific13-998-123用于神经元的培养与维持
离心机Eppendorf5810R用于神经元培养物的制备
共聚焦显微镜NikonEclipse Ti +A1R核心用于荧光成像
CoolSNAP ES2  CCD相机Photometrics用于图像采集
D-葡萄糖Millipore SigmaG8270aCSF溶液的组分
DNaseMillipore SigmaD5025用于神经元培养物的制备
雌性定时妊娠Sprague Dawley大鼠Charles river400SASSD用于制备胚胎皮层和脊髓运动神经元培养物
FITC滤光立方体Nikon77032509用于Gcamp钙瞬态成像
FM4-64苯乙烯染料InvitrogenT13320用于突触囊泡释放成像
玻璃底培养皿（厚度#1.5）CellVisD35-10-1.5-N用于在适用于成像的培养皿上培养神经元
玻璃巴斯德吸管Grainger52NK56用于制备神经元培养物
汉克平衡盐溶液（HBSS）Millipore SigmaH6648用于制备神经元培养物
HEPESMillipore SigmaH3375aCSF溶液的组分
高KCl人工脑脊液（aCSF）用于成像。请参见配方*
马血清Millipore SigmaH1138用于神经元的培养与维持
层流通风解剖罩NUAIRENU-301-630用于制备神经元培养物
层粘连蛋白Thermo Scientific23017015用于制备神经元培养物
Leibovitz's L-15培养基Thermo Scientific11415064用于制备神经元培养物
Leibovitz's L-15培养基，无酚红Thermo Scientific21083027用于制备神经元培养物
L-谷氨酰胺（200 mM）Thermo Scientific25030149神经元培养添加剂
Lipofectamine 2000转染试剂Thermo Scientific11668019用于神经元转染
低KCl人工脑脊液（aCSF）用于成像。请参见配方*
氯化镁Millipore Sigma208337aCSF溶液的组分
Microsoft ExcelMicrosoft用于数据分析/归一化的软件
Nalgene  滤器单元，0.2 µm PESThermo Scientific565-0020aCSF溶液用滤器单元
Neurobasal培养基Thermo Scientific21103049用于神经元培养物的培养与维持
NIS-Elements高级研究软件Nikon用于图像采集与分析的软件
Nunc 15 mL锥形管Thermo Scientific339650用于制备神经元培养物和缓冲液
Nunc 50 mL锥形管Thermo Scientific339652用于制备神经元培养物和缓冲液
OptiprepMillipore SigmaD1556用于制备神经元培养物
木瓜蛋白酶Millipore SigmaP4762用于制备神经元培养物
青霉素-链霉素（10,000 U/mL）Thermo Scientific15140122用于防止神经元培养物的细菌污染
灌流系统Warner InstrumentsSF-77B用于aCSF的更换
灌流管路Cole-ParmerUX-30526-14重力灌流装置的组成部分
pGP-CMV-Gcamp6m质粒Addgene40754用于钙瞬态成像
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐Millipore SigmaP7886玻璃底培养皿的包被剂
氯化钾Millipore SigmaP3911aCSF溶液的组分
碳酸氢钠Millipore SigmaS5761aCSF溶液的组分
氯化钠Millipore SigmaS9888aCSF溶液的组分
载物台培养箱Tokai Hit用于成像期间活神经元的孵育
TRITC滤光立方体Nikon77032809用于FM4-64成像
胰蛋白酶抑制剂Millipore SigmaT6414用于制备神经元培养物
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），含酚红Thermo Scientific25200056用于制备神经元培养物
振动隔离台New PortVIP320X2430-135520显微镜用台/支架

参考文献

  1. Gibson, S. B., et al. The evolving genetic risk for sporadic ALS. Neurology. 89 (3), 226-233 (2017).
  2. Kim, G., Gautier, O., Tassoni-Tsuchida, E., Ma, X. R., Gitler, A. D. ALS genetics: Gains, losses, and implications for future therapies. Neuron. 108 (5), 822-842 (2020).
  3. Nijssen, J., Comley, L. H., Hedlund, E. Motor neuron vulnerability and resistance in amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathologica. 133 (6), 863-885 (2017).
  4. Marttinen, M., Kurkinen, K. M., Soininen, H., Haapasalo, A., Hiltunen, M. Synaptic dysfunction and septin protein family members in neurodegenerative diseases. Molecular Neurodegeneration. 10, 16(2015).
  5. Bae, J. S., Simon, N. G., Menon, P., Vucic, S., Kiernan, M. C. The puzzling case of hyperexcitability in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Clinical Neurology. 9 (2), 65-74 (2013).
  6. Kiernan, M. C. Hyperexcitability, persistent Na+ conductances and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis. Experimental Neurology. 218 (1), 1-4 (2009).
  7. Krarup, C. Lower motor neuron involvement examined by quantitative electromyography in amyotrophic lateral sclerosis. Clinical Neurophysiology. 122 (2), 414-422 (2011).
  8. Vucic, S., Nicholson, G. A., Kiernan, M. C. Cortical hyperexcitability may precede the onset of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain. 131, Pt 6 1540-1550 (2008).
  9. Marchand-Pauvert, V., et al. Absence of hyperexcitability of spinal motoneurons in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Physiology. 597 (22), 5445-5467 (2019).
  10. Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185 (2), 232-240 (2004).
  11. Markert, S. M., et al. Overexpression of an ALS-associated FUS mutation in C. elegans disrupts NMJ morphology and leads to defective neuromuscular transmission. Biology Open. 9 (12), (2020).
  12. Shahidullah, M., et al. Defects in synapse structure and function precede motor neuron degeneration in Drosophila models of FUS-related ALS. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19590-19598 (2013).
  13. Liu, Y., et al. C9orf72 BAC Mouse Model with Motor Deficits and Neurodegenerative Features of ALS/FTD. Neuron. 90 (3), 521-534 (2016).
  14. Freibaum, B. D., et al. GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 129-133 (2015).
  15. Zhang, K., et al. The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport. Nature. 525 (7567), 56-61 (2015).
  16. Perry, S., Han, Y., Das, A., Dickman, D. Homeostatic plasticity can be induced and expressed to restore synaptic strength at neuromuscular junctions undergoing ALS-related degeneration. Human Molecular Genetics. 26 (21), 4153-4167 (2017).
  17. Romano, G., et al. Chronological requirements of TDP-43 function in synaptic organization and locomotive control. Neurobiology of Disease. 71, 95-109 (2014).
  18. Armstrong, G. A., Drapeau, P. Calcium channel agonists protect against neuromuscular dysfunction in a genetic model of TDP-43 mutation in ALS. Journal of Neuroscience. 33 (4), 1741-1752 (2013).
  19. Diaper, D. C., et al. Loss and gain of Drosophila TDP-43 impair synaptic efficacy and motor control leading to age-related neurodegeneration by loss-of-function phenotypes. Human Molecular Genetics. 22 (8), 1539-1557 (2013).
  20. Schwiening, C. J. A brief historical perspective: Hodgkin and Huxley. Journal of Physiology. 590 (11), 2571-2575 (2012).
  21. Dong, H., et al. Curcumin abolishes mutant TDP-43 induced excitability in a motoneuron-like cellular model of ALS. Neuroscience. 272, 141-153 (2014).
  22. Chand, K. K., et al. Defects in synaptic transmission at the neuromuscular junction precede motor deficits in a TDP-43(Q331K) transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 32 (5), 2676-2689 (2018).
  23. Perkins, E. M., et al. Altered network properties in C9ORF72 repeat expansion cortical neurons are due to synaptic dysfunction. Molecular Neurodegeneration. 16 (1), 13(2021).
  24. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P. Vesicle hypothesis of the release of quanta of acetylcholine. Physiological Reviews. 60 (2), 396-441 (1980).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Ryan, J., Gerhold, A. R., Boudreau, V., Smith, L., Maddox, P. S. Introduction to Modern Methods in Light Microscopy. Methods in Molecular Biology. 1563, 1-15 (2017).
  27. Wang, L., Frei, M. S., Salim, A., Johnsson, K. Small-molecule fluorescent probes for live-cell super-resolution microscopy. Journal of the American Chemical Society. 141 (7), 2770-2781 (2019).
  28. Neher, E. Vesicle pools and Ca2+ microdomains: new tools for understanding their roles in neurotransmitter release. Neuron. 20 (3), 389-399 (1998).
  29. Dolphin, A. C., Lee, A. Presynaptic calcium channels: specialized control of synaptic neurotransmitter release. Nature Reviews Neuroscience. 21 (4), 213-229 (2020).
  30. Tsien, R. Y., Rink, T. J., Poenie, M. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium. 6 (1-2), 145-157 (1985).
  31. Takahashi, N., et al. Cytosolic Ca2+ dynamics in hamster ascending thin limb of Henle's loop. American Journal of Physiology. 268 (6), Pt 2 1148-1153 (1995).
  32. Cleemann, L., DiMassa, G., Morad, M. Ca2+ sparks within 200 nm of the sarcolemma of rat ventricular cells: evidence from total internal reflection fluorescence microscopy. Advances in Experimental Medicine and Biology. 430, 57-65 (1997).
  33. Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
  34. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  35. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  36. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  37. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  38. Horikawa, K. Recent progress in the development of genetically encoded Ca2+ indicators. Journal of Medical Investigation. 62 (1-2), 24-28 (2015).
  39. Bohme, M. A., Grasskamp, A. T., Walter, A. M. Regulation of synaptic release-site Ca(2+) channel coupling as a mechanism to control release probability and short-term plasticity. Federation of European Biochemical Society Letters. 592 (21), 3516-3531 (2018).
  40. Li, Y. C., Kavalali, E. T. Synaptic vesicle-recycling machinery components as potential therapeutic targets. Pharmacological Reviews. 69 (2), 141-160 (2017).
  41. Gaffield, M. A., Betz, W. J. Imaging synaptic vesicle exocytosis and endocytosis with FM dyes. Nature Protocols. 1 (6), 2916-2921 (2006).
  42. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the Drosophila neuromuscular junction. Methods in Molecular Biology. 440, 349-369 (2008).
  43. Jensen, B. K., et al. Synaptic dysfunction induced by glycine-alanine dipeptides in C9orf72-ALS/FTD is rescued by SV2 replenishment. European Molecular Biology Organization Molecular Medicine. 12 (5), 10722(2020).
  44. Kia, A., McAvoy, K., Krishnamurthy, K., Trotti, D., Pasinelli, P. Astrocytes expressing ALS-linked mutant FUS induce motor neuron death through release of tumor necrosis factor-alpha. Glia. 66 (5), 1016-1033 (2018).
  45. Fernandopulle, M. S., et al. Transcription Factor-Mediated Differentiation of Human iPSCs into Neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 51(2018).
  46. Ye, L., Haroon, M. A., Salinas, A., Paukert, M. Comparison of GCaMP3 and GCaMP6f for studying astrocyte Ca2+ dynamics in the awake mouse brain. Public Library of Science One. 12 (7), 0181113(2017).
  47. Angleson, J. K., Betz, W. J. Monitoring secretion in real time: capacitance, amperometry and fluorescence compared. Trends in Neuroscience. 20 (7), 281-287 (1997).
  48. Ryan, T. A., et al. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  49. Kraszewski, K., et al. Synaptic vesicle dynamics in living cultured hippocampal neurons visualized with CY3-conjugated antibodies directed against the lumenal domain of synaptotagmin. Journal of Neuroscience. 15 (6), 4328-4342 (1995).
  50. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 12 (2), 363-375 (1992).
  51. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  52. Ryan, T. A., Smith, S. J. Vesicle pool mobilization during action potential firing at hippocampal synapses. Neuron. 14 (5), 983-989 (1995).
  53. Betz, W. J., Ridge, R. M., Bewick, G. S. Comparison of FM1-43 staining patterns and electrophysiological measures of transmitter release at the frog neuromuscular junction. Journal of Physiology-Paris. 87 (3), 193-202 (1993).
  54. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  55. Ryan, T. A., Smith, S. J., Reuter, H. The timing of synaptic vesicle endocytosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (11), 5567-5571 (1996).
  56. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  57. Kayser, M. S., McClelland, A. C., Hughes, E. G., Dalva, M. B. Intracellular and trans-synaptic regulation of glutamatergic synaptogenesis by EphB receptors. Journal of Neuroscience. 26 (47), 12152-12164 (2006).
  58. Washburn, H. R., Xia, N. L., Zhou, W., Mao, Y. T., Dalva, M. B. Positive surface charge of GluN1 N-terminus mediates the direct interaction with EphB2 and NMDAR mobility. Nature Communications. 11 (1), 570(2020).
  59. Magrane, J., Sahawneh, M. A., Przedborski, S., Estevez, A. G., Manfredi, G. Mitochondrial dynamics and bioenergetic dysfunction is associated with synaptic alterations in mutant SOD1 motor neurons. Journal of Neuroscience. 32 (1), 229-242 (2012).
  60. Casci, I., et al. Muscleblind acts as a modifier of FUS toxicity by modulating stress granule dynamics and SMN localization. Nature Communications. 10 (1), 5583(2019).
  61. Hruska, M., Henderson, N., Le Marchand, S. J., Jafri, H., Dalva, M. B. Synaptic nanomodules underlie the organization and plasticity of spine synapses. Nature Neuroscience. 21 (5), 671-682 (2018).
  62. Rein, M. L., Deussing, J. M. The optogenetic (r)evolution. Molecular Genetics and Genomics. 287 (2), 95-109 (2012).
  63. Bertucci, C., Koppes, R., Dumont, C., Koppes, A. Neural responses to electrical stimulation in 2D and 3D in vitro environments. Brain Research Bulletin. 152, 265-284 (2019).
  64. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 Fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  65. Guerra-Gomes, S., Sousa, N., Pinto, L., Oliveira, J. F. Functional roles of astrocyte calcium elevations: From synapses to behavior. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 427(2017).
  66. Westergard, T., et al. Cell-to-cell transmission of dipeptide repeat proteins linked to C9orf72-ALS/FTD. Cell Reports. 17 (3), 645-652 (2016).
  67. Wen, X., et al. Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death. Neuron. 84 (6), 1213-1225 (2014).
  68. Daigle, J. G., et al. Pur-alpha regulates cytoplasmic stress granule dynamics and ameliorates FUS toxicity. Acta Neuropathologica. 131 (4), 605-620 (2016).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

突触功能突触囊泡释放钙离子内流活细胞成像共聚焦显微镜原代神经元培养GCaMP6m报告蛋白苯乙烯基染料
肌萎缩侧索硬化症模型中突触功能的实时荧光检测
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。