利用小鼠畏光行为研究偏头痛样症状

摘要

啮齿类动物无法报告偏头痛症状。在此，我们描述了一种可操作的实验范式（明/暗箱和开放旷场实验），用于测量畏光现象，这是偏头痛患者中最常见且最令人困扰的症状之一。

摘要

偏头痛是一种复杂的神经系统疾病，其特征是头痛和感觉异常，例如对光的敏感性增加，表现为畏光。尽管无法确认小鼠是否正在经历偏头痛，但对光的回避行为可作为偏头痛相关畏光症状的行为替代指标。为了检测对光的回避行为，我们采用明暗箱实验，测量小鼠在无干预条件下选择停留在明亮或黑暗环境中的时间。该实验方法通过两项关键改进得以优化：在正式实验前对小鼠进行实验箱的预先适应，以及可调节的箱内照明系统，使光照强度可在55 lux至27,000 lux范围内灵活调整。由于更倾向于停留在黑暗环境中的行为也可能反映焦虑状态，因此我们同时采用一种不依赖光照的焦虑行为检测方法——旷场实验，以区分焦虑与对光的回避行为。本文中，我们描述了明暗箱实验和旷场实验的改良测试范式，并介绍了这些方法在两种小鼠品系中经腹腔注射降钙素基因相关肽（CGRP）以及在光遗传学脑刺激研究中的应用。

引言

偏头痛是一种常见的神经系统疾病，影响约17%的美国人¹，是全球范围内导致残疾的第二大原因^2,3。患者会出现持续4至72小时的头痛，并伴有以下至少一种症状：恶心和/或呕吐，或畏光和畏声⁴。近年来，降钙素基因相关肽（CGRP）抗体的研发取得了新进展，目前已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准，开启了偏头痛治疗的新时代^5,6,7。这些抗体可阻断CGRP或其受体，使约50%的偏头痛患者症状得以预防⁷。在过去一年中，已有两种小分子CGRP受体拮抗剂获得FDA批准用于偏头痛的急性治疗，另有两种正在研发中⁸。尽管治疗手段不断进步，偏头痛发作的具体机制仍不明确。例如，CGRP发挥作用的部位尚不清楚。治疗性抗体难以穿过血脑屏障却仍具疗效，提示CGRP可能在外周部位（如脑膜和/或三叉神经节）发挥作用。然而，我们也不能排除其在缺乏血脑屏障的室周器官等中枢部位的作用⁹。至少对于畏光而言，根据我们使用神经胶质原纤维酸性蛋白启动子驱动人RAMP1过表达（nestin/hRAMP1）转基因小鼠进行的光厌恶实验结果，中枢作用的可能性较小¹⁰。深入理解偏头痛病理生理机制，将为开发新的偏头痛治疗药物提供方向。

临床前动物模型对于理解疾病机制和开发新药至关重要。然而，由于动物无法用语言描述其疼痛感受，因此对动物的偏头痛评估具有挑战性。鉴于80-90%的偏头痛患者会出现畏光症状¹¹，对光的厌恶被认为是动物模型中偏头痛的一个指标。这促使人们需要建立一种用于评估小鼠畏光行为的实验方法。

明暗实验包含一个明亮区和一个黑暗区，广泛用于基于小鼠对新环境的自发探索行为（该行为受到其对光的先天厌恶的制约）来评估焦虑水平¹²。一些研究将实验箱的1/3设为黑暗区，而另一些研究则将1/2设为黑暗区。前者设置常用于检测焦虑¹³。尽管我们最初选择的是大小相等的明暗箱，但我们并未比较这两种相对尺寸。我们可以指出的是，两个箱体的整体大小并非主要影响因素，因为最初的测试箱¹⁴明显大于后续使用的装置¹⁵，但结果基本相同。

为评估畏光行为，对该明暗箱实验的两个关键改进是测试条件和光照强度（图1）。首先，小鼠在正式实验前需预先暴露于明暗箱环境中，以降低其探索动机¹⁶（图1A）。预暴露的必要性及次数取决于小鼠品系和模型。野生型C57BL/6J小鼠通常需要两次预暴露¹⁰，而CD1小鼠仅需一次预暴露即可¹⁷。通过这种方式，可在上述两种小鼠品系中揭示出畏光行为。其次，已对箱体照明系统进行改进，使其光照强度可在较暗（55 lux）至明亮（27,000 lux）范围内调节，其中55 lux相当于阴天多云时的光照水平，27,000 lux则相当于树荫下晴天的光照强度¹⁰。我们发现，所需光照强度因小鼠品系和遗传模型的不同而有所差异。因此，研究者应首先确定其特定实验范式所需的最低光照强度。

即使对实验方法进行了这些改进，能够揭示对光的厌恶表型，仍有必要检测类焦虑行为，以区分由光本身引起的光厌恶与由焦虑引起的光厌恶。旷场实验是一种基于动物对新环境自发探索行为来测量焦虑的传统方法。该实验与明暗箱实验不同之处在于，其探索倾向受到动物对无遮蔽开放空间的先天厌恶所制约。旷场实验中，实验箱的中央区域和边缘区域均处于光照条件下，因此旷场实验是一种与光照无关的焦虑检测方法。因此，结合明暗箱实验与旷场实验，可使我们区分光厌恶是源于对光本身的回避，还是源于整体焦虑水平的升高。

CGRP 是一种多功能神经肽，可调节血管舒张、痛觉和炎症¹⁸。它在周围神经系统和中枢神经系统中广泛表达，在偏头痛的病理生理过程中发挥重要作用¹⁸。然而，CGRP 在偏头痛中发挥作用的具体机制尚不明确。通过采用改进后的明暗箱实验和旷场实验，我们能够观察到在外周^10,16（图2）和中枢^14,15,16,19给予 CGRP 后，小鼠出现畏光行为。除了神经肽之外，确定参与畏光反应的脑区对于理解偏头痛的病理生理机制也至关重要。丘脑后核是整合痛觉和光信号处理的脑区¹⁹，且在偏头痛发作期间丘脑会被激活²⁰。因此，我们通过向该区域注射携带通道视紫红质-2（ChR2）或 eYFP 的腺相关病毒（AAV），靶向丘脑后核。将这种光遗传学方法与上述两种行为学实验相结合，我们证明了对丘脑后核中表达 ChR2 的神经元进行光刺激可诱发畏光行为¹⁹（图3）。在本实验中，鉴于光遗传操控小鼠表现出显著的诱发性畏光反应，故省略了实验前对行为箱的适应性预暴露步骤。

方案

动物实验已获得爱荷华大学动物护理与使用委员会的批准，并按照美国国立卫生研究院制定的标准进行。

1. 光照/黑暗实验

1. 明暗箱装置（参见 材料表）设置。本节中所有设备均为商业化产品。
   1. 在架子上放置隔音箱（内部尺寸：宽 59.7 厘米 × 高 38 厘米 × 深 35.6 厘米），箱内配有可抽拉托盘，便于接触实验腔室和暗插件。
   2. 将直流电源和直流稳压电源连接至隔音屏蔽箱。
   3. 将透明无缝开放场箱（27.31 cm × 27.31 cm × 20.32 cm，长×宽×高）放置于隔间抽屉式底座上。
   4. 将黑色红外透射塑料暗区插件（28.7 cm × 15 cm × 20.6 cm，长×宽×高）放入开放场箱中，确保箱体被均分为两个大小相等的区域：暗区和光区。
   5. 通过电缆将三组16光束红外阵列分别连接到开放场箱体的X、Y和Z轴，并连接至红外USB控制器。
   6. 将红外USB控制器连接到计算机。
   7. 在计算机上安装能够记录和收集鼠标位置及活动的追踪软件。
   8. 对于光源面板的设置，首先将发光二极管（LED）光源面板（长×宽：27.70 × 27.70 cm；含360个LED，日光平衡色温，5600K，60°泛光光束角）从其原始外壳中取出。
   9. 将LED驱动器、散热器和电源与灯板组装在一起。多个LED灯板可连接至同一个电源、散热器和LED驱动器，以实现对灯板的统一控制。
   10. 构建一个定制的丙烯酸平台（长×宽×高：29.77 × 27.70 × 8.10 cm），包含7个相同的隔层，隔层间距为0.53 cm图1B将定制的亚克力搁板永久固定在隔间内培养箱上方的天花板上。
   11. 将LED灯板插入底部两层搁板之间的插槽中。调节灯板至不同高度（图1B, C），如有必要（例如，使用光遗传学小鼠时。详见第3节）。
   12. 打开散热器、LED驱动器和电源。通过测量培养皿底部的光照强度，确认LED驱动器能够调节LED光照强度，并确认底部光照均匀。
2. 行为学测试流程
   注意：小鼠饲养在12小时光照循环条件下。所有行为学实验均在光照周期内进行。实验使用10至20周龄的雄性和雌性小鼠。在本方案中，未经处理的野生型CD1和C57BL/6J小鼠经历两次对明暗箱的预暴露，随后进行给药暴露及一次给药后暴露。每次暴露之间间隔三天，以确保小鼠充分恢复（具体时间点如下所述：第1、4、7和10天） 图1A）。然而，CD1小鼠不需要2^nd 暴露前可在暗光条件下进行测试。
   1. 第1天（预处理1），打开明暗箱实验装置，并将光照强度设置为27,000 lux。
   2. 打开追踪软件并建立新方案。在 新方案 设置，设定 持续时间 30分钟。在 新分析 设置，设定 按持续时间划分的数据区间 至 300 秒。
   3. 在 新区域 设置，选择 预设区域. 选择 2 然后 水平方向检查记录室是否在水平方向上被划分为两个大小相等的区域。
   4. 在测试前1小时将小鼠放入测试房间进行适应。适应期间保持房间灯光开启，以避免干扰小鼠的昼夜节律。确保明暗箱实验所需的所有设备均已开启，以便小鼠充分适应测试环境。
   5. 选择 获取数据输入小鼠编号。启动实验方案。
   6. 将抽屉从隔音箱中拉出，以接触明暗箱和暗室插入件。轻轻抓住小鼠尾根部，将其放入 将小鼠放入隔间内光照区，并推入抽屉。确保软件立即检测到小鼠并开始记录活动。
   7. 等待记录在30分钟后自动停止。将小鼠放回其饲养笼。
   8. 使用含有55.0%异丙醇、0.25%十二至十八烷基二甲基乙基苄基氯化铵和0.25%十二至十八烷基二甲基苄基氯化铵作为抗菌活性成分的无味杀菌一次性擦拭巾清洁实验腔室和暗区插件，以消除前一只小鼠留下的任何嗅觉线索。
   9. 第4天（预处理2），重复步骤1.2.1至1.2.8。
   10. 第7天（处理当天），重复步骤1.2.1和1.2.4。适应结束后，给予CGRP（0.1 mg/kg，按小鼠体重10 µl/g，腹腔注射（i.p.）），将小鼠头部前倾，在右下腹区域进行注射。注射后将小鼠放回原笼具中。
   11. 30分钟后，开始实验方案，让小鼠在明/暗箱中运行 如步骤1.2.5至1.2.7所述。注射后在饲养笼中的恢复时间可根据处理方式缩短或延长²¹.
   12. 按照步骤1.2.8所述清洁腔室和暗插件。
   13. 第10天（治疗后第10天），重复步骤1.2.1至1.2.8。实验可在步骤1.2.13处暂停 在开始开放场实验之前。

2. 开放旷场实验

1. 仪器设置
   1. 旷场实验箱设置：使用与明暗箱实验相同的隔音箱和旷场实验箱，但不使用暗室插入件。
   2. 光源面板设置：使用与明暗箱实验相同的装置。确保光照强度与明暗箱实验中所用的相同。
2. 行为学测试流程
   1. 打开仪器，将光照强度设置为 27,000 lux。
   2. 启动追踪软件。
   3. 建立新实验方案，除新区域设置外，其余设置均与明暗箱实验相同。在新区域设置中选择1，然后选择中心。将边缘区域设为距周长 3.97 cm，中心区域设为 19.05 × 19.05 cm。
   4. 按照步骤 1.2.4 所述，使小鼠适应测试房间。
   5. 给予CGRP（0.1 mg/kg，根据小鼠体重按 10 µl/g 腹腔注射），将小鼠头部前倾，在右下腹区域进行注射。注射后将小鼠放回饲养笼。
   6. 30 分钟后开始实验程序。将隔音箱外的抽屉拉出， 轻柔地 将小鼠 放置于旷场实验箱中央，然后将抽屉推回隔音箱内。
   7. 记录 30 分钟的行为数据，之后将小鼠放回其饲养笼。
   8. 按照步骤 1.2.8 所述清洁仪器。

3. 用于光遗传学小鼠的改良光照/黑暗实验

1. 装置设置
   1. 对暗区插件进行两项修改。
      1. 将暗区插件的开口修改为5.08 × 5.08 cm（宽 × 高），并在暗区插件顶部与开口之间设置一个狭缝，尺寸为0.95 × 10.16 cm（宽 × 高）（图1D 左上图）。
         注意：此修改可使小鼠在头部光纤套管连接至光纤跳线时，能够顺利进入暗区。
      2. 将暗区插件的顶部延伸至光区上方，形成一个三角形门廊（高 = 6.5 cm）（图1D 右上图和左下图）。在门廊上切割一个圆形孔洞（直径 = 1.7 cm），并将一个固定座插入该孔洞中，用于放置和固定旋转接头，该接头连接激光器与光纤跳线（图1D 左上图和左下图）。
         注意：这些修改仅对到达暗区底部的光照强度造成轻微变化（在27,000 lux条件下，暗区右后角测得的光照强度为：修改后17 lux，未修改时14 lux）。
   2. 将旋转接头插入暗区插件上的固定座中。
   3. 将30.5 cm长的光纤跳线连接至旋转接头。确认旋转接头可顺畅旋转，使小鼠在穿梭于实验腔体时，跳线能随之自由转动而无阻碍。
   4. 其余装置设置部分，请采用与第1节（明暗箱实验）相同的装置配置。
2. 行为学测试流程
   注意：与野生型小鼠不同，光遗传学小鼠不进行预暴露处理（预处理1和预处理2）。
   1. 在测试当天，将LED光源面板插入隔音箱内从下往上数第二低的槽位（距腔体底部28.23 cm），以预留空间用于连接光纤跳线。打开明暗箱实验装置，并将光照强度设定为55 lux。
   2. 采用与1.2.2和1.2.3节相同的实验方案设置，但需在新建分析设置中将数据分段时间设为60秒，以便与第3.2.3步中的激光刺激方案保持一致。
   3. 打开激光电源开关。设置激光脉冲控制器，使其在30分钟内交替进行1分钟刺激与1分钟无刺激。
   4. 在正式测试前1小时，将小鼠置于开启照明的测试房间内进行适应性驯化。
   5. 启动实验程序。将隔音箱外的抽屉拉出，以便接触明暗箱及暗区插件。
   6. 轻柔地固定小鼠，并通过耦合套管将小鼠头部的光纤套管与光纤跳线连接（图1D 右下图）。将小鼠轻轻放入明区，然后将抽屉推回箱体内。确保程序将自动开始记录小鼠行为。
   7. 在第1分钟时，开启脉冲控制器，随后将安全锁钥匙转至开启状态。确保目标脑区每间隔一分钟即接受一次激光刺激。
   8. 30分钟后程序自动停止，此时将安全锁钥匙转至关闭状态，随后关闭脉冲控制器。
   9. 断开小鼠与光纤跳线的连接，将小鼠放回其饲养笼中。
   10. 按照步骤1.2.8所述方法清洁实验腔体和暗区插件。

4. 用于光遗传学小鼠的改良开放场实验

1. 装置设置
   1. 使用支架和夹具将旋转接头稳定固定在实验腔室上方（图1E）。
   2. 将长度为50 cm的光纤跳线连接至旋转接头。检查旋转接头是否可顺畅旋转。
   3. 在支架上调整旋转接头至适当高度：确保光纤跳线刚好能够到达腔室的各个角落，以避免干扰小鼠的运动。
   4. 其余装置设置部分，采用与第1节（明暗实验）相同的装置，但不使用暗室插入件。
2. 行为学测试流程
   1. 打开明暗实验装置，并将光照强度设定为55 lux。
   2. 采用与改良明暗实验（第3节）相同的实验方案设置，但新区域设置除外。在新区域设置中选择1，随后选择中心。将周边区域设定为距周长3.97 cm处，中心区域设定为19.05 × 19.05 cm。
   3. 打开激光电源开关。设置激光脉冲控制器，在30分钟内以1分钟刺激、1分钟无刺激的交替模式进行刺激。
   4. 按照步骤3.2.4至3.2.10所述进行适应性训练及后续测试，但对步骤3.2.6作两处修改：将小鼠轻柔地放置于腔室中央而非明室区域；由于光纤跳线连接至小鼠头部，需将抽屉保持拉出状态，置于隔间外部。

结果

该行为学测试范式旨在检测避光行为。可使用未经处理的野生型小鼠和光遗传学小鼠进行实验，以在实时刺激特定神经元群体的同时，研究光厌恶反应。

该方法已被用于研究外周给予CGRP对CD1和C57BL/6J小鼠^10,16以及在C57BL/6J小鼠中对丘脑后核神经元进行光刺激¹⁹对畏光行为的影响。实验中使用了年龄为10–20周、包括雄性和雌性的小鼠（图2A、图2B–D和图3）。结果显示，在明暗箱实验中，腹腔注射CGRP显著减少了CD1（图2A）和C57BL/6J（图2B）小鼠在明区停留的时间，但在旷场实...

讨论

明暗箱实验被广泛用于评估类似焦虑的行为¹²。该实验基于小鼠天生对光的厌恶，以及将其置于新环境（明区）时的探索倾向。然而，正如我们在此报道的，该实验也可用于评估避光行为。

在进行测试之前，必须仔细考虑预暴露的次数及其必要性。这取决于小鼠品系或模型。例如，在我们的明暗箱实验方案中，未经处理的野生型CD1和C57BL/6J小鼠在接受处理测试程序前会预先暴露于明暗箱环境中两次，而光遗传学小鼠则不需要进行预暴露。最近一项研究报道，对于CD1小鼠而言，一次预暴露已足以在腹腔注射CGRP后表现出对光的厌恶行为¹⁷。因此，在处理日到来时，新奇性这一参数的重要性将有所降低^10,16。预暴露可通过降低探索驱动力，从而改变探索与厌恶之间的平衡，进而揭示出对光的厌恶表型。在某些情况下，预暴露并非必需。例如，对于神经系统中CGRP受体增加的基因改造小鼠，无需进行预暴露

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
活动监测仪	Med Assoc. Inc		用于追踪小鼠行为的软件
定制丙烯酸支架			用于调节LED面板的高度
暗箱插入件	Med Assoc. Inc	ENV-511
直流电源	Med Assoc. Inc	SG-500T
直流稳压电源	Med Assoc. Inc	SG-506
光纤套管	Doric	MFC_200/ 240-0.22_4.5mm_ZF1.25_FLT
杀菌性一次性擦拭巾	Sani-Cloth	SKU # Q55172
散热片	Wakefield	490-6K	连接至LED面板
红外控制器电源线	Med Assoc. Inc	SG-520USB-1
红外USB控制器	Med Assoc. Inc	ENV-520USB
对接套筒	Doric	SLEEVE_ZR_1.25
改装LED光源面板	Genaray Spectro	SP-E-360D	日光平衡色温（5600K）
电源	MEAN WELL USA	SP-320-12	连接至LED面板
无缝开放场箱	Med Assoc. Inc	ENV-510S
隔音屏蔽箱	Med Assoc. Inc	ENV-022MD-027
支架与夹具
三个16光束红外阵列	Med Assoc. Inc	ENV-256