本文介绍了一种用于获取健康和病理状态下大型哺乳动物完整心脏的高分辨率显微计算机断层扫描图像的实验方案，该方法采用胶原选择性对比增强技术。
本文内容
摘要
摘要
结构性重构是心脏长期承受病理性慢性应激的常见后果。了解病变组织的结构架构和组成特性，对于阐明其与心律失常行为之间的相互作用至关重要。亚临床分辨率下的微尺度组织重构正逐渐被认为是导致年轻成人致命性心律失常的重要来源，且具有较高的发生率。在临床前模型（如大型哺乳动物完整心脏）中，实现足够微尺度分辨率并获得高成像对比度仍面临挑战。此外，目前仍缺乏针对三维高分辨率成像的组织成分选择性对比增强技术。采用显微计算机断层扫描（micro-computed tomography）的无损成像技术在高分辨率成像方面展现出良好前景。本研究旨在减轻X射线在大型生物样本中过度衰减所造成的影响。实验从健康猪（N = 2）和羊（N = 2）中取出心脏，其中部分动物经诱导建立慢性心肌梗死伴纤维瘢痕形成模型，另一部分则诱导产生慢性心房颤动。离体心脏依次灌注：添加钙离子淬灭剂和血管扩张剂的生理盐水溶液、梯度乙醇脱水溶液，以及在真空条件下使用的六甲基二硅氮烷。后者可在空气干燥一周期间增强心脏结构的稳定性。以胶原为主的组织可被X射线对比增强剂磷钼酸选择性结合。组织构象在空气中保持稳定，从而允许进行长时间的显微CT扫描，以获取高分辨率（各向同性20.7 µm）图像。通过扩散实现对比剂的最佳负载，可在健康猪心室中选择性增强心内膜上皮层及心内膜下浦肯野纤维的对比度。心房颤动（AF）心脏在心房后壁和心耳区域表现出更强的对比剂聚集，这归因于更高的胶原含量。心肌梗死心脏在心肌纤维化区域显示出选择性增强的对比信号，从而能够识别出交错分布的存活心肌纤维。经对比增强并空气干燥处理的组织样本，实现了对完整大型哺乳动物心脏的微尺度成像，并可对潜在疾病相关成分进行选择性对比增强。
引言
结构性心脏病是全球范围内大多数心脏相关死亡的主要原因1。心脏结构的重构会影响心肌环境及间质空间。由于心脏的电活动和机械功能均依赖于心肌细胞的有序排列，结构破坏可导致难以耐受的心律失常、泵血功能受损以及心力衰竭2,3,4,5,6,7,8,9。目前，结构性心脏病的治愈性疗法发展远远落后于疾病的流行程度2,5。因此，越来越多的结构性心脏病的临床前模型不断涌现，以更深入地理解心脏解剖形态学特征及其导致的心律失常发病机制10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23。在各类结构性心脏病中普遍观察到间质纤维化程度上调，而在缺血相关病例中更常见的是心肌被纤维组织和脂肪组织替代18。对病理性细胞外成分的形态学理解有助于识别心律失常的潜在基质。疾病分布范围和严重程度为心律失常风险提供了强有力的预测指标。然而，如何在完整心脏中整合宏观与微观尺度，全面成像疾病特征，仍是当前面临的重要挑战。
基于X射线的显微计算机断层扫描（microCT）正作为一种强大的工具兴起，可用于利用对比剂研究软生物组织的微观结构。已有研究获得了小鼠心脏24,25,26以及大型哺乳动物心脏的小型解剖样本27,28的高分辨率解剖图谱。然而，在大型哺乳动物心脏整个器官水平进行成像时，使用传统的组织制备技术会导致X射线光子经历过长的路径而被显著衰减。该过程通常涉及将组织负载对比剂，并在数据采集过程中将样本浸入对比剂溶剂中。增大样本尺寸和提高分辨率会延长总的采集时间。因此，组织稳定性对于可用的图像重建至关重要，这意味着必须防止因干燥引起的组织形变。然而，使用浸没液存在以下缺点：（i）整体背景信号强度变得不可忽略；（ii）促进与组织结合的对比分子发生稀释。这两个因素均会导致图像对比度降低。
本研究详细介绍了一种新型的组织处理流程，旨在减轻背景光子衰减，并优化对比增强剂所提供的动态范围。建议采用组织空气干燥结合化学加固的方法，以限制组织变形29。因此，组织样本可在空气中保持稳定，适用于长时间成像，并避免浸没液体带来的背景信号干扰。该方法学流程包括：（i）利用完整猪心脏优化建立的一套全面的组织处理与成像方案；（ii）对比剂浓度及负载技术的评估；以及（iii）在两种不同绵羊心脏慢性疾病模型——心房颤动和心肌梗死模型中的应用。每种慢性心脏疾病模型的建立方法已有其他文献报道，包括经皮冠状动脉栓塞诱导的心肌梗死13和自持性心房颤动模型30。
方案
所有实验均遵循欧洲议会关于用于科学目的动物保护的 2010/63/EU 指令指南进行。动物实验方案已获得波尔多大学当地伦理委员会（CEEA50）批准。心脏组织来源于三种大型哺乳动物模型，包括：（i）健康的大型白猪（N = 2，2 月龄）；（ii）经诱导建立心肌梗死模型的绵羊（N = 1，2 岁）13；以及（iii）经诱导建立心房颤动模型的绵羊（N = 1，7 岁）30。
1. 溶液配制：
- 停搏液：准备 3 L 蒸馏水，加入氯化钠 (110 mM)、氯化钾 (16 mM)、碳酸氢钠 (10 mM)、D-(+)-葡萄糖 (9 mM)、氯化钙溶液 (1.2 mM) 和氯化镁溶液 (16 mM)。最后加入 500 µL/L 肝素钠。将此溶液保存于 4 °C。
- 磷酸盐缓冲液-乙二胺四乙酸 (PBS-EDTA) 溶液：
- 首先，将乙二胺四乙酸 (EDTA) 加入 1 L 蒸馏水中，使其终浓度为 10 mM。使用氢氧化钠溶液 (1 M) 将溶液 pH 升至并维持在 12，以溶解 EDTA。
- 待 EDTA 完全溶解后，用盐酸将 pH 降至 7.4。加入一袋磷酸盐缓冲液粉剂，得到浓度为 0.01 M（氯化钠 0.138 M；氯化钾 0.0027 M）、pH 为 7.4 的溶液。将此溶液保存于室温 (RT)。
- 乙醇-磷钼酸 (PMA) 对比剂溶液：准备 1 L 无水乙醇，加入 PMA 使其浓度达到 1%。将此溶液保存于室温 (RT)。
2. 组织来源
- 根据当地伦理准则对动物实施安乐死后取出心脏。迅速将心脏浸入冷的心肌停跳液中，并轻轻按摩心室以进行初步冲洗。
- 确保在主动脉弓下方切断主动脉，并使用持针器夹住动脉壁两侧。
- 用持针器悬挂心脏，将主动脉插管插入主动脉根部，注意避免接触或穿透主动脉瓣。在插管水平的主动脉弓处绕一圈0号缝线，并牢固结扎固定插管。
- 使用50 mL注射器注入200 mL冷（4 °C）心肌停跳液。通过将心脏后侧朝上倾斜，使腔内积聚的血液经肺静脉流出，以清除多余血液。
- 将冲洗后的心脏浸入盛放在冰上的冷心肌停跳液中，保存至准备进行解剖为止。
3. 组织制备：
- 准备一个1升的储液罐，将其置于高于解剖皿80 cm的位置。将一根长80 cm、内径3.2 mm、外径4.8 mm的热塑性塑料管连接至储液罐的排水口。
- 在排水管路上安装一个三通旋塞，并将两根热塑性塑料管（每根长20 cm，内径1.6 mm，外径3.2 mm）分别连接至三通旋塞的两个自由端口。在每根管路的自由末端安装二通旋塞。
- 向储液罐中加入含肝素（2500单位）的停搏液。打开旋塞使停搏液排出，以清除所有气泡，随后关闭二通旋塞。
- 使用聚四氟乙烯（PTFE）管（内径1 mm，外径2 mm）制备用于左、右冠状动脉口的插管。
- 截取5 cm长的管材，将一端靠近明火加热。当管端约1 mm开始熔化并变为半透明时，立即将其压在坚硬耐热的表面上，使插管尖端形成一圈凸缘，以防止插管从血管中滑脱。
- 将每根插管未加热的一端插入1 cm至储液罐排水管路的两个末端。
- 移除主动脉插管。在冷停搏液中定位左、右冠状动脉开口。
- 使用尖头剪刀，仔细分离冠状动脉开口上方和下方的主动脉根部周围组织，以便在冠状动脉下方穿入一根0号丝线缝线。
- 打开二通旋塞，将插管尖端插入冠状动脉开口。使插管尖端深入开口1–2 cm，并超过缝线位置，然后结扎固定插管。
- 轻轻按摩心室，同时用溶液冲洗心脏15分钟，直至心脏内血液完全清除。
- 冲洗完成后，关闭二通旋塞，并将其从三通旋塞上断开。将心脏转移至一个含有500 mL PBS-EDTA溶液的1 L塑料耐化学腐蚀容器中。
- 在通风橱内，使用双通道蠕动泵使PBS-EDTA溶液在热塑性塑料管中循环。先对泵管进行引液，确保管内无气泡，然后以室温、80 mL/min的流速对每根冠状动脉插管进行循环灌注，持续2小时。
- 确保通风橱正常运行。停止泵运转，从容器中排出溶液，更换为10%甲醛溶液，在室温下以80 mL/min的流速固定1小时。
- 将甲醛溶液替换为PBS，以80 mL/min的流速冲洗三次，每次15分钟，以彻底去除固定剂。
4. 组织脱水与干燥：
注意：使用相同的灌注速率（80 mL/min），并让组织在整个过程中保持在室温。
- 用超纯水配制的20%乙醇溶液替换PBS溶液，并灌注至少3小时。
- 使用浓度逐步递增的乙醇溶液对心脏进行灌注。
- 首先将20%乙醇溶液替换为30%乙醇溶液，灌注2小时。
- 依次将乙醇浓度逐步提高至40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、95%、90%、95%、99%和100%，每种浓度至少灌注1小时。
注意：若某浓度下已完成至少15分钟的灌注，心脏样本可在该乙醇浓度下静置过夜，无需持续灌注。
- 可选步骤：若通过灌注施加对比剂，则用含1% PMA对比剂的100%乙醇对心脏灌注48小时，随后用100%乙醇灌注2小时以冲洗对比剂。
- 在空气干燥前为增强心脏组织强度，先以50:50的乙醇与六甲基二硅氮烷（HMDS）混合液循环处理10分钟，随后用100% HMDS继续处理2小时。
警告：HMDS为高毒性且有害的物质，接触空气时会释放出强烈的氨味。此外，HMDS液态形式具有高度挥发性，并可被含碘催化剂加速反应。 - 将套管从管路中拆除，并用主动脉缝线将心脏悬挂在通风橱内。
- 小心地将自封袋套在心脏外部，并将袋口密封于缝线上，以减少心脏暴露于流动空气。让心脏通过蒸发干燥1周。
- 可选步骤：对于扩散负载型对比剂，将心脏置于100%乙醇中振荡洗涤15分钟；随后在真空条件下将心脏浸入含1% PMA的100%乙醇中，持续48小时；重复步骤4.6。
5. 微型计算机断层扫描（MicroCT）：
注意：使用台式X射线显微CT系统对猪心脏进行成像。
- 将风干的心脏安装到合适的样品台上。使用固定在样品台上的夹具夹住已干燥且变硬的主动脉，防止在X射线显微CT扫描过程中样品发生移动。
- 仔细调整心脏样品沿其长轴方向的中心，使其与旋转角度为0°和90°时成像视野的中心对齐。为在所有取向中实现此对齐，通过固定在样品支撑上的主动脉夹将心脏悬空放置。
- 打开软件并启动X射线显微CT系统后，安装1 mm厚的铝制X射线滤片，设置X射线源电压为60 kV，电流为120 µA。将图像尺寸设为2016 × 1344像素，像素大小设为20 µm。
- 将样品台移出视野范围，通过获取平场校正图像来校准背景图像和X射线曝光时间。确保平均背景X射线透射率高于80%。
- 沿支撑结构长度方向获取X射线透射图像，以确定心脏长轴方向的整体成像范围。扫描时采用0.18°的旋转步长、5帧图像平均，样品旋转180°。选择偏移扫描模式，以对样品支撑的全宽度进行成像。
注意：本节所述采集参数已选定，以优化整体心脏组成成像的质量。 - 扫描完成后，使用软件进行三维各向同性图像体积的断层重建。若使用NRecon软件，应启用与采集相关的伪影校正功能，包括10%的束硬化校正和8级环状伪影抑制。
- 为优化数据存储限制，选取最小矩形感兴趣区域，使其包含所有与心脏相关的图像体素。将图像以8位位图格式导出为图像序列。
- 使用DataViewer软件可视化重建后的图像序列。在图像边界内对样品进行数字定向，使样品的长轴和短轴与图像体积的三个主轴对齐。
- 在三个轴向上裁剪图像体积，去除图像外层的背景区域，以最大程度减小总图像尺寸。
结果
采用脱水和空气干燥法制备大型哺乳动物心脏，可去除样品中的全部水分。在HMDS浸入过程中，若乙醇未能充分置换水分，则可观察到相应现象（见方案，步骤4.4）。当HMDS下方存在水分时，会产生从组织中上升的气泡。若水分含量过高，浸入液的温度可能升高。在初始HMDS浸入阶段，将浸入室周围放置冰块，可减轻组织受热带来的不良影响。在未使用对比剂的情况下对心脏进行空气干燥后，样品呈现白色（见方案，步骤4.6）。通常，心外膜表面比心肌内层更早干燥并达到结构稳定。在加载对比剂前用乙醇冲洗，可去除白色沉积物（见方案，步骤4.7）。使用锋利刀片切开组织时，可宏观观察到彼此清晰分离的单个肌纤维。通过将心脏样品浸入对比剂溶液中进行对比剂加载，在样品较厚且肌肉组织密集的区域，会受到扩散限制伪影的影响。在真空条件下进行扩散加载，可使肌肉组织着色更加均匀（心脏样品#1，对比剂加载时间见表1）。宏观上，对比剂在心肌与主要由细胞外成分（尤其是脂肪和结缔组织）构成的区域之间，呈现出不均匀的染色分布。无论在加载对比剂之前或之后进行空气干燥，组织样品均能保持稳定的结构完整性。
使用上述扫描参数，在微计算机断层扫描（microCT）中以20 µm分辨率扫描样品全宽度所需的时间为6小时34分钟，曝光时间为1700 ms。根据样品在扫描仪转台轴方向上的尺寸，该时长需乘以覆盖标本全长所需的位置数量。在本研究中，猪和羊的心脏采用了三到四个位置。NRecon软件将多位置且偏移的扫描数据拼接，为X射线源和探测器的每个旋转步动生成单一的X射线投影图像。总共存储了1000个投影，均为16位图像，生成30–40 GB的数据。重建的体数据图像大小为52–70 GB。
通过扩散负载法用对比剂染色的风干猪心脏进行X射线透射成像后，主要解剖标志（包括心室腔、室间隔以及心室的游离壁）清晰可辨（图1A）。此外，由于X射线衰减/透射的高灵敏度，还可观察到显示微结构组织特征的高纹理区域，例如心肌纤维的取向（图1B）。三维图像体积的断层重建结果显示，在心外膜和内皮边界处，组织与背景之间均表现出明显的区分（图1D）。在心肌壁内，厚透壁区域整体表现出较低的对比度及体素强度扩散梯度。尽管如此，沿裂面分离的血管结构和心肌纤维仍可清晰识别。在最表层的心外膜以及点状的亚心内膜区域，观察到第二组更高强度的对比信号。对比增强最显著的部位集中在细胞外成分富集的区域，特别是心外膜结缔组织、心外膜脂肪以及浦肯野纤维网络的结缔组织鞘。体素信号强度分布显示，组织信号与零强度背景（空气）之间分离度高，并呈现出低对比度和高对比度组织两种主要的信号群体（图1D）。
为验证显微CT图像重建的对比度增强效果以及对心脏样本胶原结构区域的选择性，采用了组织学、明场显微镜和荧光显微镜分析（图2）。取一例未经对比剂灌注的风干心脏的跨壁心室组织块，制备用于石蜡包埋与切片。贴附于载玻片上的相邻组织切片分别进行Masson三色染色、不作处理或经1% PMA处理48小时。将切片固定于载玻片上进行染色可消除在完整心脏样本中观察到的染色扩散梯度效应。Masson三色染色显示上皮层和内皮层、心外膜下血管周围组织以及包绕伸入左心室腔内的游离浦肯野纤维的结缔组织鞘中存在胶原阳性染色（图2A）。明场照明下，PMA染色后胶原结构呈现更深的着色，表明PMA在这些区域的选择性富集（图2B、C）。此外，已有研究显示PMA处理可淬灭胶原大分子复合物的自发荧光31。心室组织切片的荧光图像显示，在胶原所在区域经PMA处理后荧光明显减弱（图2D 与 2E、图2D' 与 2E' 以及 图2D'' 与 2E'' 对比）。在明场与荧光成像中，细胞结构均未因PMA处理而发生改变，而胶原结构则表现出PMA染色的选择性富集及自发荧光的特异性淬灭。
心脏样本#2在空气干燥前通过灌注法用对比剂染色。图像重建显示心肌隔室内的染色呈现明显的斑片状分布（图3A）。对比增强对组织成分无选择性，在心外膜或心内膜下区域未观察到信号强度的进一步增强。此外，低对比度组织与背景强度之间的区分较差（图3B）。
心室纤维化由心肌梗死和慢性缺血诱导形成（心脏样本#3）。在血管栓塞部位下游的组织区域，心肌细胞被纤维脂肪沉积物取代，形成前壁心尖部瘢痕。心脏样本#3制备自一个包含左心室前壁、室间隔及右心室游离壁的离体心室楔形组织，并对其进行成像。该心室楔形结构的制备方法此前已有描述32，且楔形组织在心脏成像中的应用也已被系统综述33。瘢痕形态呈透壁性，但具有异质性（图4）。中央致密的纤维化病灶周围环绕着结构疏松且不均一的边缘区（图4A）。心室组织样本通过空气干燥后扩散负载法并在真空条件下进行染色。图4B–E展示了重建的微计算机断层扫描（microCT）图像体积在组织边界和瘢痕区域中信号强度的最大值。对比剂对健康心肌染色效果较差，但保留了微结构对比度（图4C'）。在边缘区，瘢痕组织与存活的心肌组织交错分布（图4D'）。致密纤维化呈透壁性分布，但具有纹理特征，提示其组成存在差异（图4E'）。对空气干燥并经PMA染色的组织样本，取其左心室透壁区域的组织切片，通过与Masson三色染色结果对比，验证PMA对病理组织中胶原的选择性染色效果（图4F）。PMA染色特异性地显示胶原（位于心外膜下和心内膜下区域），而在存活心肌区域无染色信号（图4G）。
心脏样本#4因诱导产生持续性心房颤动，在保持心房腔天然形态的同时进行风干处理。未观察到心耳塌陷现象。从重建图像中可通过对形态的识别确定主要解剖标志（包括房间隔、梳状肌、冠状窦、肺静脉口、腔静脉和终末嵴）。在真空条件下进行扩散染色，使得主动脉根部、房室瓣以及工作心肌的某些局部区域呈现对比度增强。肌肉染色增强主要局限于左右心房的心耳及后壁区域（图5）。
图1：通过真空扩散法用PMA对比剂处理的猪心脏的MicroCT成像。（A）X射线投影图像。（B）从A图中红线提取的透射剖面。（C）由三维断层重建体积数据获得的心室短轴切片。黄色箭头指示归因于心内膜下浦肯野纤维的点状对比区域。蓝色箭头指示血管结构。（D）C图所示重建图像切片的信号强度分布。LV：左心室；RV：右心室。请点击此处查看本图的放大版本。
图 2：PMA 对胶原蛋白染色特异性的验证。 （A）来自风干心脏心室的透壁组织切片的马松三色染色结果。心肌组织呈红色，胶原蛋白呈绿色。相邻的组织切片（B）未进行染色，或（C）经 PMA（1%）染色后，使用明场照明成像以评估染色均匀性。（D）未染色的组织切片或（E）经 PMA 染色的组织切片通过荧光显微镜成像。图 D'（实线红框）和 E'（虚线红框）分别为未染色和 PMA 染色切片的心外膜下区域的放大视图。图 D''（实线蓝框）和 E''（虚线蓝框）分别为心内膜下区域及一条游离的浦肯野纤维的对应放大视图。箭头指示胶原蛋白存在的位置。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：在空气干燥和MicroCT成像前，先用PMA灌注装载。 (A) 猪心脏心室重建图像体积的短轴切面。蓝色箭头指示血管结构。B) 图像切片中信号强度的分布来自面板 A. LV：左心室，RV：右心室。 请点击此处以查看该图的放大版本。
图4慢性心肌梗死绵羊心脏的显微CT成像 (A在心尖区域形成了致密瘢痕（见插图照片）。从心内膜视角对心尖区域进行体积渲染，并根据图像强度进行着色（红色代表瘢痕组织，绿色代表心肌）。灰度强度的正交切片显示了致密瘢痕的分布及其周围存活的心肌。纤维化组织与心肌之间的分隔区域对应于脂肪组织。B) 一张来自心肌梗死后伴有心尖瘢痕的绵羊的风干心室楔形标本照片。重建的微计算机断层扫描（microCT）图像体积的斜切面穿过心室，位于心底与心尖之间的中段，并靠近（C) 血管阻塞 (C- 面板中的红线 B), (D) 紧邻致密瘢痕与健康心肌的梗死周边区域（D- 面板中的蓝线 B）和（E致密纤维化区域E - 面板中的绿色线条 B). (C'红色虚线框标出的隔区区域的放大视图 C. (D'右心室心尖部梗死区域的放大视图（面板中蓝色虚线框） D). (E'左心室心尖部梗死区域的放大视图（面板中绿色虚线框内） E）。LV：左心室腔；RV：右心室腔；MB：节制索；Pap：乳头肌。黄色箭头指示左前降支动脉。F) 对经PMA染色后风干的左心室切取的组织切片进行Masson三色染色。胶原纤维呈蓝色，心肌组织呈粉红色/紫色。G) PMA 染色分布的相应组织切片。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图 5：慢性诱导心房颤动后绵羊心脏的MicroCT图像。 （A）心房的容积渲染图，颜色编码方式同图4A。 （B）沿心脏长轴方向的心房MicroCT图像切片。在（C）房室瓣水平（C—面板B中的红线）、（D）主动脉根部（D—面板B中的蓝线）和（E）左心房顶部（E—面板B中的绿线）处提取短轴切片。 LA：左心房；RA：右心房；LAA：左心耳；RAA：右心耳；LV：左心室；RV：右心室；LVOT：左心室流出道；RVOT：右心室流出道；PA：肺动脉。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 样本编号 | 1 | 2 | 3 | 4 |
| 物种 | 猪 | 猪 | 绵羊 | 绵羊 |
| 体重 (kg) | 32.4 | 31.2 | 47.2 | 53.4 |
| 心脏重量 (g) | 191.2 | 186.2 | 202.4 | 207.6 |
| 病理状态 | - | - | 慢性心肌梗死 | 慢性房颤 |
| 样本制备方式 | 完整心脏 | 完整心脏 | 心脏前部楔形组织 | 完整心脏 |
| 对比剂加载模式 | 扩散法 | 灌注法 | 扩散法 | 扩散法 |
| 对比剂暴露时间 (h) | 48 | 24 | 48 | 48 |
表1：心脏样本及对比剂处理。
讨论
本文以大型哺乳动物的完整心脏为例，详细阐述了一种用于后续高分辨率结构成像的大组织样本制备方案。采用空气干燥法可消除背景X射线衰减的影响，并最大程度地优化组织与背景之间的对比度29。利用该方法，可在直径达7.2 cm的样本上实现约20 µm各向同性分辨率的三维成像。然而，软组织的显微CT成像通常依赖非特异性对比剂以改善X射线吸收能力及显微CT系统的灵敏度34。尽管X射线对比剂能够提高整体X射线衰减效应并增强软组织成像效果，但基于生化成分差异来区分不同组织组分仍具挑战性。然而，研究发现，在实验室条件下将空气干燥的心脏与常用的X射线对比剂PMA联合使用时，可选择性地染色细胞外成分。健康心肌相关的结缔组织以及慢性疾病中的病理性结构重塑均得到了显著增强。
空气干燥生物组织的过程需要采取干预措施以防止样本变形。电子显微镜的样本制备也有类似要求。通常采用临界点干燥法，该方法通过调节组织浸润介质、温度和压力，消除组织内液体成分的表面张力，从而避免液体蒸发时在分子水平上引起的变形35。该方法需要将样本中的水分均匀替换为液态二氧化碳，这一过程在体积较小且易于扩散的样本中更为可靠。另一种方法是提高组织的结构完整性，并延长空气干燥（即蒸发阶段）的时间，以减少整体变形。分子HMDS通过硅烷化反应形成基于硅酮的支架，从而增强并稳定组织样本的分子结构36。此外，通过限制环境中的空气流动，进一步延长蒸发时间，以避免不均匀蒸发，特别是在样本表面与壁内层之间发生差异性蒸发。
以往已使用多种对比剂对软组织进行显微CT成像。最常见的包括碘、磷钨酸（PTA）和磷钼酸（PMA）。尤其是碘，因其具有较高的扩散速率而被广泛使用34,37,38。然而，碘会催化HMDS试剂的硅烷化反应36。该催化反应剧烈且放热，若样品干燥不完全而残留HMDS，则存在标本破坏和安全风险。PTA和PMA均可安全地溶于乙醇并与HMDS联合使用。研究表明，在对未矿化的椎间盘精细结构进行成像时，PTA和PMA的分辨能力优于碘染色38。在哺乳动物样本的显微CT成像中，PTA和PMA已被用于小鼠胚胎39、小鼠心血管系统37、兔肌肉和脑组织40以及猪静脉41的染色。PTA在溶液中的分子质量和密度均高于PMA，部分原因是PTA中的主要衰减元素钨的原子质量较高（原子序数为74 g/mol），而相比之下，PMA中最重的元素钼的原子序数为42 g/mol。除了样品厚度外，X射线衰减还取决于原子质量和样品密度42。当通过增加样品尺寸来延长X射线路径长度时，X射线衰减对样品密度的变化更为敏感。因此，选择密度较低的PMA作为对比剂，以降低过度衰减的风险，并优化类人尺度心脏图像对比度的动态范围。进一步的研究证据表明，在心肌组织中，PMA的扩散负载染色比分子更大的PTA更为均匀43。
对比剂递送方式会影响对比剂在心肌组织中分布的均匀性（图3）。在乙醇脱水的心脏中，由于血管阻力不均，对比剂灌注导致PMA背景染色呈现斑片状。而在空气干燥的心脏中，样品脱水过程强化了心肌的层状结构，增加了层间分离程度。这最终提高了组织对基于扩散方式加载对比剂的整体通透性。因此，空气干燥促进了在层状及层内水平上的组织-空气对比（图4）。此外，通过在真空条件下施加对比剂可进一步促进扩散加载。已有研究显示，未干燥样品的组织收缩程度依赖于对比剂浓度40。然而，通过空气干燥对样本进行预先形态学稳定化可抑制组织收缩效应29。
整个器官的高分辨率显微CT图像本质上会产生大量的数据。断层成像技术的特点使得图像可以在逐层的基础上进行可视化和处理，从而减轻计算机的处理和内存负担。然而，为了可视化三维图像堆栈，例如将样本体积渲染为三维图像，建议的最低计算机配置为128 GB内存和3 GHz处理器速度。固态硬盘也显著提高了数据传输速度。
微计算机断层扫描（microCT）成像技术在心脏领域的应用为转化研究和临床验证提供了诸多优势。其三维和微米级成像的优势已在评估ST段抬高型心肌缺血患者的血栓负荷方面得到体现44,45。对结构性心脏病患者心律失常潜在来源的定位，主要依赖于纤维化瘢痕组织分布的判定以及存活心肌交织走行路径的精确定位。目前用于诊断室性心律失常的二线方法采用磁共振成像46，该技术可有效定位致密纤维化区域，但仅限于低分辨率的形态学表征，对微结构重塑及纤维化病变的弥散性分布提供的信息有限47。对瘢痕分布进行高分辨率的检测与表征，有望显著提升我们对心脏结构重塑机制以及心力衰竭发生风险的理解。特别是基础研究或尸检研究，将从与心律失常电生理标测相印证的结构图像中获益良多。
综上所述，经HMDS处理并空气干燥加固的心脏可进一步用X射线造影剂染色，以增强细胞外成分的X射线衰减。具体而言，在健康心肌中，PMA主要积聚于上皮、瓣膜组织以及由结缔组织包绕的心室传导系统各腔室，从而增强X射线衰减。此外，在结构异常的心肌中，造影增强效应对纤维化区域具有进一步的选择性。
致谢
本研究获得了法国政府的财政支持，作为 "未来的投资" 由法国国家科研署（ANR）管理的项目资助，项目编号为ANR-10-IAHU-04，以及莱杜克基金会（Leducq Foundation）RHYTHM网络项目、ANR-17-CE14-0029-01 [UNMASC] 项目资助，欧洲心血管疾病研究区（ERA-CVD）资助项目H2020-HCO-2015_680969 [MultiFib]，法国新阿基坦大区资助项目（项目编号：2016 - 1R 30113 0000 7550/2016-1R 30113 0000 7553）和ANR-19-ECVD-0006-01。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 10% 中性缓冲福尔马林 | Diapath | F0043 | |
| 氯化钙溶液 | Honeywell | 21114 | |
| PTFE 插管管路 | VWR | DENE3400102 | |
| 恒压头 1L 储液罐 | Harvard Apparatus | 50-0496 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma | G5767 | |
| 无水乙醇 | VWR | 20821.330 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma | 796881 | |
| 肝素钠（5000 U/mL） | Panpharma | 3400891287301. | |
| 六甲基二硅氮烷（HMDS） | Sigma | 440191-1L | |
| 盐酸，ACS 级试剂，37% | Sigma | 258148 | |
| 氯化镁溶液 | Honeywell | 63020 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma | P5368 | |
| 磷钼酸水合物 | Fisher Scientific | 417895000 | |
| 氯化钾 | Sigma | P5405 | |
| 三通泵管 | Ismatec | FV-96328-48 | |
| SkyScan, 1276 | Bruker | micro CT | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S5761 | |
| 氯化钠 | Sigma | S3014 | |
| 50% 氢氧化钠溶液（溶于 H2O） | Sigma | 415413 | |
| 管路连接套件 | Harvard Apparatus | 72-1407 | |
| 蠕动泵 | Ismatec | ISM 1089 | |
| Tygon R-3603 管路 1.6 mm 3.2 mm 0.8 mm | VWR | 228-1279 | |
| Tygon R-3603 管路 3.2 mm 4.8 mm 0.8 mm | VWR | 228-1283 | |
| 一次性双组分注射器 50 mL | Norm-Ject | 4850001000 | 无热原，不含 PVC |
参考文献
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