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构建细胞共培养模型以模拟心肌缺血/再灌注 体外

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DOI：

10.3791/62913

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2021年10月13日

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Vanderbilt University Medical Center, 2Anesthesiology, TVHS VA Medical Center, 3Department of Pharmacology, Vanderbilt University

本文内容

摘要

空间距离是评估内皮细胞与心肌细胞分层共培养模型中缺氧/复氧损伤的关键参数，首次表明优化共培养的空间环境对于提供有利条件十分必要 体外 用于检测内皮细胞在心肌细胞保护中作用的模型。

摘要

缺血性心脏病是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因。再灌注会在缺血基础上造成额外损伤。内皮细胞（ECs）可通过细胞间相互作用保护心肌细胞（CMs）免受再灌注损伤。共培养体系有助于研究细胞间相互作用的作用机制。混合共培养是最简单的方法，但其局限性在于无法对单一细胞类型进行独立处理和后续分析。为探究ECs是否能够以剂量依赖方式减轻CMs的细胞损伤，以及通过调节两种细胞系之间的接触距离是否可进一步优化这种保护作用，我们采用小鼠原代冠状动脉内皮细胞与成年小鼠心肌细胞，测试了三种细胞培养插入式装置，其细胞层间距分别为0.5、1.0和2.0 mm。在仅含CMs的培养条件下，通过乳酸脱氢酶（LDH）释放量评估的细胞损伤在缺氧期间显著增加，且在2.0 mm间距下再氧合时进一步加重，相较于0.5 mm和1.0 mm间距更为明显。当ECs与CMs处于近乎直接接触状态（0.5 mm）时，缺氧后CMs的再氧合损伤仅出现轻微缓解。当空间距离为1.0 mm时，该缓解作用显著增强。在2.0 mm间距下，ECs在缺氧及缺氧/再氧合阶段均显著减轻了CMs的损伤，表明足够的培养间距对于ECs与CMs之间的信号交流至关重要，使分泌的信号分子得以循环并充分激活保护性通路。我们的研究首次提示，优化EC/CM共培养的空间环境对于提供有利的 体外 用于评估内皮细胞在心肌保护中对抗模拟缺血/再灌注损伤作用的模型。本报告旨在为研究人员提供使用该重要模型的逐步操作指南。

引言

缺血性心脏病是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因1,2。然而，再灌注治疗过程本身可导致心肌细胞死亡，称为心肌缺血/再灌注（IR）损伤，目前对此仍无有效治疗方法3。已有研究表明，内皮细胞（ECs）可通过分泌旁分泌信号以及细胞间相互作用来保护心肌细胞（CMs）4。

共培养模型已被广泛用于研究自分泌和/或旁分泌的细胞间相互作用对细胞功能和分化的影响。在各种共培养模型中，混合共培养是最简单的一种，即将两种不同类型的细胞以特定的细胞比例直接接触，共同培养于同一个培养空间中5。然而，由于细胞群体混合在一起，难以对不同细胞类型进行独立处理，也无法方便地对单一细胞类型进行后续分析。

既往研究表明，缺氧和缺血性损伤可导致细胞膜完整性显著受损，表现为乳酸脱氢酶（LDH）的释放增加。这种损伤在复氧过程中进一步加重，模拟了再灌注损伤6,7,8。本实验方案的目标是验证以下假设：内皮细胞（ECs）的存在能够以剂量依赖的方式减轻心肌细胞（CMs）在缺氧-复氧（HR）过程中发生的细胞膜渗漏，且通过调节两种细胞系之间的接触距离，可优化ECs的保护作用。为此，我们采用了三种类型的细胞培养小室，以及小鼠原代冠状动脉内皮细胞和成年小鼠心肌细胞。这些分别由Corning、Merck Millipore和Greiner Bio-One品牌提供的小室，使我们能够建立三种不同的细胞共培养旁分泌相互作用条件，细胞系之间的间距分别为0.5、1.0和2.0 mm。每种情况下，每个小室接种100,000个ECs。

此外，为了确定在此模型中，共培养条件下内皮细胞（ECs）的密度是否有助于减轻缺氧/复氧（HR）损伤，我们研究了ECs浓度与心肌细胞（CMs）乳酸脱氢酶（LDH）释放之间的剂量-反应关系。在2.0 mm的插入式培养小室中，分别以每孔25,000、50,000和100,000个细胞的密度接种ECs。

本报告为研究人员提供了一种逐步利用该重要模型的方法。

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方案

1. 实验准备/铺板

  1. 根据制造商的说明培养心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs）。
    1. 当两种细胞系从供应商处收到后，进行解冻处理，并用新鲜培养基洗涤后接种于T25培养瓶中。建议使用与细胞来源相同的供应商提供的细胞培养基。次日更换新鲜培养基，待细胞达到汇合状态后使用。
    2. 将细胞培养用的培养箱维持在37 °C，含21% O2、5% CO2 和74% N2 的环境，并保持充分湿度。
      注：本实验方案中所用的小鼠原代冠状动脉内皮细胞来源于C57BL/6小鼠的冠状动脉，成年小鼠心肌细胞则来源于成年C57BL/6J小鼠心脏，均为商业获取（参见 材料表）。
  2. 在无菌条件下将CMs接种至24孔板的底部（下层）。24小时后，将ECs接种至共培养孔的插入式培养小室（或上层部分）。ECs接种24小时后，将含ECs的插入式小室置于CMs所在的孔板底部，开始共培养阶段。共培养至少12–24小时后方可用于实验。以下将详细描述这些步骤。
    1. 在光学显微镜下评估CM细胞系的汇合度。当培养瓶中的细胞汇合度达到90%–100%时，即可进行实验性接种。
    2. 吸除含有汇合细胞的培养瓶中的培养基，对T25培养瓶加入3–5 mL胰蛋白酶/乙二胺四乙酸（EDTA）进行消化。轻轻摇晃培养瓶，于37 °C孵育2–5分钟，期间在光学显微镜下观察酶解进程。当细胞开始变圆时，使用细胞刮刀将细胞从瓶壁上轻轻刮下。
    3. 细胞脱落后，将胰蛋白酶与细胞的混合液转移至含有10 mL培养基的50 mL离心管中（适用于T25培养瓶），以中和胰酶活性。将细胞悬液在120 × g 条件下离心2分钟，获得松散的细胞沉淀。弃去上清液，将沉淀重悬于5 mL培养基中。
    4. 为进行细胞计数并确认细胞活力，取10 µL重悬细胞与10 µL台盼蓝染液混合。使用细胞计数仪计数活细胞。用新鲜常规培养基稀释细胞，以达到所需的接种密度。所需体积应根据目标接种密度及原液细胞浓度计算确定。所有接种操作均须在无菌条件下进行。
    5. 将CMs以每孔300,000个细胞的密度接种于预先包被细胞外基质的24孔板底部。将细胞在37 °C、21% O2 和5% CO2 条件下培养过夜。
    6. 24小时后，以每插入式小室100,000个细胞的最佳密度将ECs接种至插入式小室中（培养面积为33.6 mm2），（图1）。ECs接种24小时后，将含ECs的插入式小室放入CMs所在的孔中，启动共培养。共培养12–24小时后方可进行后续实验。
    7. 确保在开始实验时，CMs和ECs均达到80%–90%的汇合度。

2. 模拟缺血/再灌注损伤的缺氧/复氧处理  体外

注意：以下步骤需按所述方式执行，不得在中途暂停。

  1. 通过将约 25 mL 培养基倒入 50 mL 锥形管中来制备缺氧培养基。用硅胶膜密封管口，并使用已灭菌的移液枪头在膜上穿一个孔。再创建另一个孔，此次将移液枪头插入培养基中约 2/3 深度并保持浸没状态。
  2. 用缺氧气体（0.0125% O₂）冲洗培养基2，5% CO₂2，94.99% N2) ，流速为30 L/min，持续5分钟。这可最大限度减少O2 缺氧开始时（步骤2.5）溶解在培养基中。
  3. 弃去含贴壁细胞的24孔板或培养小室中的培养基，用100 µL/孔的10%磷酸盐缓冲液（PBS）轻轻洗涤。随后，向每孔板或小室中加入500 µL新鲜配制的缺氧培养基。
    注意：此步骤中，培养基中的缺氧状态仅被尽可能短暂地中断，随后在步骤2.5中重新开始对细胞和培养基施加真正的缺氧条件。
    1. 在常氧对照组中，将原有培养基更换为含葡萄糖和血清的新鲜正常培养基。
  4. 在缺氧室内部放置一个装有无菌水的培养皿以增加湿度。随后，将含缺氧组的培养板放入缺氧室中。
  5. 用缺氧气体（0.0125% O₂）冲洗缺氧舱2，5% CO₂2，94.99% N2以30 L/min的流速处理5分钟。将培养室置于37 °C培养箱中孵育24小时。
  6. 缺氧处理后，在正常条件下培养心肌细胞（CMs）和内皮细胞（ECs）。具体操作为：弃去培养板/插入式培养小室中的旧培养基，更换为正常培养基（含葡萄糖和血清；每孔/插入式培养小室加入500 µL），并将培养物置于正常培养条件（21% O₂）下的培养箱中继续培养。2，5% CO₂2，74% N237 °C）孵育2小时，以模拟再灌注。
  7. 为控制换液可能带来的影响，在更换缺氧培养基的同时，对常氧细胞的培养基也进行更换。
    注意： 图2 提供了本方案的示意图概览。

3. 终点评估

  1. 将24孔板中的细胞培养基转移至96孔板中。从24孔板的每个孔中取200 µL培养基，均等地分配到96孔板的四个孔中。分别使用单独的96孔板用于常氧、低氧和缺氧复氧（HR）条件。
  2. 测定细胞损伤程度，例如按照细胞毒性检测试剂盒的说明书，通过检测乳酸脱氢酶（LDH）的吸光度来评估。按照试剂盒说明书要求，在96孔板中进行检测。

4. 统计学

  1. 参数数据以均值±标准差表示，非参数数据以箱线图表示，其中包含中位数和四分位距。应采用适当的参数或非参数多重比较检验，并结合可接受的事后检验，以降低Ⅰ类错误的发生概率。显著性水平通常设定为α=0.05（双尾）。
  2. 本研究中开展的所有实验均需在单次实验内至少完成三个独立重复。用于统计分析的每项实验重复次数为三至六次。

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结果

本实验使用的三种插入式培养插件（A、B、C）具有相同的孔径，均为 0.4 µm。它们之间的唯一区别在于插件底部到基底的高度不同，从而使共培养的两层细胞之间的距离分别为 0.5、1.0 和 2.0 mm（图 3），且这些插件来自不同的供应商（详见材料表）。

建立一个 体外 采用双细胞系共培养模型，其中两种细胞分别形成独立层次并经历缺氧-复氧（HR）以模拟缺血-再灌注（IR）损伤，我们检测了心肌细胞（CMs）在与内皮细胞（ECs）共培养或单独培养时的细胞膜完整性。通过使用可置于CM层上方不同距离处的EC专用培养插件，我们还可评估细胞层间距对CM膜损伤程度的差异性影响。在另一组实验中，我们调整了EC的密度，从而改变EC与CM的比例。此外，为区分模拟缺血与模拟IR损伤，在以下三种条件下分别开展实验：1）常氧、2）仅缺氧、3）HR。在本模型中，采用24小时缺氧 followed by 2小时复氧处理。

可变距离...

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讨论

实验方案中的关键步骤
共培养细胞模型已被用于研究心肌保护的细胞机制。因此，如何构建两个具有适当间距的独立细胞层，对于建立合适的共培养模型至关重要。研究模拟缺血-再灌注（即缺氧-复氧，HR）损伤的一个难点在于，不仅缺血（缺氧）本身，而且再灌注（复氧）过程也会加剧细胞功能障碍。因此，一个理想的模型应能反映这些特征，例如，在缺氧后复氧条件下应表现出较单纯缺氧更显著的损伤加重，同时仍能通过细胞保护性药物或策略（如本研究中的内皮细胞，ECs）减轻损伤。有趣的是，两层细胞之间的距离在构建合适的共培养模型中似乎起着重要作用。我们发现，当内皮细胞（ECs）与心肌细胞（CMs）之间的距离为1.0 mm和2.0 mm时，均可观察到预期的HR损伤反应；但更重要的是，只有在2.0 mm的距离下，内皮细胞才能在缺氧及HR条件下均稳定地发挥对细胞损伤的保护作用。

方法的改进与故障排除
共培养模型中的细胞间相互作用受到多种变量的影响，例如共培养的不同细胞群体数量、细胞类型之间的相似程度、细胞间的物理分离程度、不同群体局部...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

本工作部分得到了美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发项目的资助。&D 服务（I01 BX003482）以及机构资金资助 M.L.R.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
成年小鼠心肌细胞（CMs）Celprogen Inc11041-14从成年 C57BL/6J 小鼠心脏组织中分离
Countess II 自动细胞计数仪InvitrogenA27977用于计算细胞数量的细胞计数
生物安全柜NuaireNU425400细胞培养无菌操作台
细胞培养冻存液Cell Biologics Inc6916用于长期细胞系保存的细胞冷冻
细胞培养孵箱NuaireNu-5500提供正常细胞生存条件（21%O2, 5%CO2, 74%N2, 37°C, 湿润环境）
细胞培养孵箱用气罐A-L Compressed GasesUN1013细胞培养孵箱所需气体 
细胞培养小室 A（0.5 mm）Corning Inc353095用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养）
细胞培养小室 B（1.0 mm）Millicell MilliporePIHP01250用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养）
细胞培养小室 C（2.0 mm）Greiner Bio-One662640用于内皮细胞-心肌细胞共培养（EC-CM 共培养）
离心机Anstel Enterprises Inc4235用于细胞接种和传代
CMs 细胞培养瓶 T25Celprogen IncE11041-14用于 CMs 常规培养，由制造商预先包被
CMs 完全细胞培养基Celprogen IncM11041-14SCMs 完全培养基
CMs 无酚红完全细胞培养基Celprogen IncM11041-14PN乳酸脱氢酶（LDH）检测期间使用的不含酚红的 CMs 培养基
CMs 细胞培养板 96 孔Celprogen IncE11041-14-96well用于 LDH 检测实验，由制造商预先包被
CMs 缺氧细胞培养基Celprogen IncM11041-14GFPN用于缺氧条件下（无葡萄糖、无血清）的 CMs 细胞培养
Countess 细胞计数专用载片InvitrogenC10283用于细胞计数仪的计数载片
Cyquant LDH 细胞毒性检测试剂盒Thermo Scientific C20301LDH 检测试剂盒
ECs 细胞培养瓶 T25Fisher Scientific FB012935用于 ECs 常规培养
ECs 完全细胞培养基Cell Biologics IncM1168ECs 完全培养基
ECs 无酚红完全细胞培养基Cell Biologics IncM1168PF乳酸脱氢酶（LDH）检测期间使用的不含酚红的 ECs 培养基
ECs 细胞培养板 96 孔Fisher Scientific (Costar)3370用于 LDH 检测实验
ECs 明胶基包被液Cell Biologics Inc6950用于 ECs 培养瓶和培养板的包被
ECs 缺氧细胞培养基Cell Biologics IncGPF1168用于缺氧条件下（无葡萄糖、无血清）的 ECs 细胞培养
胎牛血清（FBS）Fisher ScientificMT35011CV经 USDA 认证的热灭活 FBS，适用于细胞培养与维持
缺氧培养舱StemCell Technologies27310用于创建含 0.01%O2 环境的缺氧条件
缺氧舱流量计StemCell Technologies27311连接缺氧气体罐以维持恒定气体流速
缺氧气体罐（0.01%O2 气瓶）A-L Compressed GasesUN1956用于置换缺氧培养基和培养舱中的气体（0.01%O2/5%CO2/94.99%N2）
显微镜 NikonTMS用于观察细胞状态
小鼠原代冠状动脉内皮细胞（ECs）Cell Biologics IncC57-6093从 C57BL/6 小鼠冠状动脉中分离
NUNC 15 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific12565269用于细胞培养操作、实验、溶液配制等
NUNC 50 mL 圆锥形离心管Fisher Scientific12565271用于细胞培养操作、实验、溶液配制等
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichD8662用于细胞培养或实验过程中的细胞洗涤
酶标仪BioTek Instrument11120533用于比色或荧光检测的微孔板读数
反应用 96 孔板（透明无盖）Fisher Scientific12565226用于 LDH 检测的酶标仪读数
用于 CMs 的胰蛋白酶/EDTACelprogen IncT1509-0141×，经无菌过滤并经组织培养测试
用于 ECs 的胰蛋白酶/EDTACell Biologics Inc6914/06190.25%，经细胞培养测试

参考文献

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