复发性流产中子宫内膜四种免疫细胞类型的多重荧光免疫组织化学染色

摘要

尽管多重免疫组织化学和多光谱成像技术已取得进展，但同时表征子宫内膜中主要免疫细胞的密度和聚集情况仍具挑战性。本文介绍了一种详细的多重染色方案及成像方法，可同时定位子宫内膜中的四种免疫细胞类型。

摘要

免疫组织化学是生物研究和临床诊断中用于鉴定和可视化组织抗原的最常用方法。该方法可用于表征多种生物学过程或病理状态，例如伤口愈合、免疫反应、组织排斥以及组织与生物材料之间的相互作用。然而，使用传统的免疫组织化学（IHC）染色技术在单个组织切片中对多种抗原（尤其是免疫细胞）进行可视化和定量仍不理想。因此，近年来引入了多重检测技术，以在单个组织样本或一组不同的组织样本中同时识别多种生物标志物。

这些技术在区分生育能力正常女性与反复流产女性在胚胎植入期间子宫内膜内免疫细胞间相互作用的变化方面可能特别有用。本文描述了一种用于多重荧光免疫组化染色的详细方案，旨在同时研究胚胎植入期间精确时间点获取的子宫内膜样本中四种主要免疫细胞类型的密度和聚集情况。该方法包括样本制备、针对免疫细胞亚型标志物的多重染色优化、切片扫描以及数据分析，特别聚焦于子宫内膜免疫细胞的检测。

利用该方法，可在单个组织切片中同时分析子宫内膜中四种主要免疫细胞的密度和聚集情况。此外，本文还将讨论关键影响因素及排除荧光探针间可能存在的荧光干扰的解决方案。重要的是，这种多重染色技术的结果有助于深入理解胚胎着床过程中的免疫相互作用与调控机制。

引言

复发性流产（RM）是指在妊娠24周之前连续发生两次或以上的妊娠丢失¹。这一常见的生殖系统疾病在全球范围内影响高达1%的夫妇^2,3。其病理生理机制具有多因素性，可分为胚胎源性病因（主要由于胚胎核型异常）和母体源性病因（影响子宫内膜和/或胎盘发育）。该病症可能由父母双方的遗传异常、子宫结构异常、血栓前状态、内分泌因素以及免疫系统紊乱所致⁴。

近年来，免疫效应细胞功能障碍被认为与早期妊娠丢失的发病机制有关⁵。这促使大量研究致力于阐明在月经周期、胚胎着床及早期妊娠过程中，子宫内膜中具有特定功能的免疫细胞亚群。在这些免疫细胞中，子宫自然杀伤（uNK）细胞在胚胎着床和妊娠过程中发挥关键作用，尤其参与滋养层细胞侵袭和血管生成过程⁶。研究表明，复发性流产（RM）女性子宫内膜中uNK细胞密度升高^7,8，但该发现并未与流产风险增加相关联⁹。然而，这一现象推动了针对RM女性子宫内膜中其他免疫细胞类型（如巨噬细胞、子宫树突状细胞）密度的研究^{10, 11}。尽管如此，RM女性在着床前后子宫内膜中免疫细胞密度是否存在显著改变，目前仍不明确。

造成这种不确定性的可能原因之一是，在着床窗口期，子宫内膜会发生快速变化，这可能使得子宫内膜免疫细胞密度的评估变得困难。在24小时的时间范围内，子宫内膜发生显著变化，从而改变免疫细胞密度和细胞因子分泌，导致这些结果出现变异来源¹²。此外，大多数研究报告主要依赖单细胞染色方法（例如传统的免疫组化技术），无法在同一组织切片上同时检测多个标志物。尽管流式细胞术可用于在单个样本中检测多种细胞群体，但其需要大量细胞且优化过程耗时，限制了该方法的普及性和效率。因此，近期多重免疫组化染色技术的进步可通过在同一张切片上对多个标志物进行免疫染色，来评估包括细胞谱系和个别免疫亚群组织学定位在内的多种参数，从而解决这一问题。此外，该技术可在组织样本有限的情况下最大限度地获取信息。最终，该技术有助于阐明生育能力正常女性与复发性流产（RM）女性之间子宫内膜免疫细胞相互作用的差异。

研究招募了来自威尔士亲王医院的两组女性，包括生育功能正常的对照组女性（FC）和原因不明的复发性流产女性（RM）。生育功能正常的对照组定义为至少有一次活产且无自然流产史的女性；复发性流产组女性定义为在妊娠20周前有≥2次连续流产史的女性。两组受试者均符合以下纳入标准：（a）年龄在20至42岁之间，（b）非吸烟者，（c）月经周期规律（25-35天）且子宫结构正常，（d）在子宫内膜活检前至少3个月内未使用任何激素治疗方案，（e）子宫输卵管造影显示无输卵管积水。此外，所有纳入的受试者均具有正常的染色体核型、正常的三维超声子宫输卵管造影结果、卵泡期第2天的促卵泡激素 < 10 IU/L、黄体中期孕酮 > 30 nmol/L、甲状腺功能正常，并且狼疮抗凝物、抗心磷脂IgG和IgM抗体检测结果均为阴性。

为了更好地理解复发性流产（RM）的免疫学基础，最理想的方法是在胚胎着床时期同时定量并定位子宫内膜中存在的主要免疫细胞类型。本文详细描述了从样本制备、针对免疫细胞亚群标志物的多重染色优化、切片扫描，到数据分析的完整实验流程，特别聚焦于子宫内膜免疫细胞的检测。此外，本文还介绍了如何同时测定子宫内膜中各类免疫细胞的密度及其聚集情况。

方案

本研究经香港中文大学—新界东联网临床研究伦理委员会批准。在收集子宫内膜活检样本前，已从参与者处获得知情同意。有关对照组和复发性流产（RM）组的纳入标准，请参见引言部分。

1. 样品制备

1. 确保本研究中的所有女性从月经周期的第9天开始每日进行尿液试纸检测，以识别黄体生成素（LH）激增从而判断排卵，并将子宫内膜活检时间精确安排在排卵后第7天^th LH峰日后第7天（LH+7）。
2. 获取一个 0.5 cm² 使用Pipelle取样器或Pipet Curet获取有生育能力女性及原因不明复发性流产（RM）女性的子宫内膜活检组织碎片。标记容器，并立即将标本置于10%中性缓冲甲醛溶液（pH 7）中，室温下固定过夜。
   注意：固定剂的体积应为组织体积的5-10倍。
3. 将组织放入组织处理机的包埋盒中进行脱水，然后在熔融的石蜡中包埋。在58–60 °C条件下将组织包埋于石蜡中。
4. 让石蜡块在室温下冷却过夜。使用切片机将石蜡块修整至厚度为3 µm。
   ​注意：使用蒸馏水有助于在多重染色过程中实现组织的正确贴附和牢固黏附。
5. 将石蜡带置于40-45 °C水浴中30秒。
6. 将切片贴附于经多聚-L-赖氨酸（0.1% w/v）包被的载玻片上，将组织面朝上放置，于37 °C下干燥过夜。将载玻片存放在玻片盒中，避免极端温度，以备后续使用。

2. 使用常规免疫组化法确定多重免疫组化中抗体的最佳浓度。

注意：这对于确定子宫内膜样本中每个免疫标记物的表达水平和表达模式，以及确定每个标记物的染色顺序及其相应的酪胺信号放大（TSA）荧光染料配对至关重要。

1. 通过手动常规免疫组化法测试抗体是否适用于多重免疫组化染色¹³。
2. 使用子宫内膜组织进行单抗体测试。
3. 为优化每种抗体的染色条件，应包括阳性对照（例如脾脏）和阴性对照（同型对照）。
4. 按照抗体数据表推荐的稀释比例进行染色。
5. 在步骤2.3所用推荐稀释度的基础上，使用更高和更低浓度进行额外染色。
   ​注意：应由临床病理学家盲法评估染色切片，以确认抗体靶向定位及细胞完整性。

3. 多重染色方法

1. 切片制备与固定
   1. 将步骤 1.6 中的切片平放，组织面向上，置于烘箱中，在 60 °C 下烘烤至少 1 小时。
   2. 从烘箱中取出切片，在室温下冷却至少 20 分钟，然后放入垂直切片架中。
   3. 使用以下各步骤，每步 10 分钟，对福尔马林固定、石蜡包埋的切片进行脱蜡和水化：二甲苯（2 次）、100% 乙醇（2 次）、95% 乙醇（1 次）、70% 乙醇（2 次）和蒸馏水（2 次）。
   4. 将切片架放入塑料切片盒中，并浸入 Tris 缓冲盐水（TBS，pH 7.6）中。
      注意：从该水化步骤开始，直至最后封片，切片必须始终保持湿润。
   5. 将切片浸入装有甲醛与甲醇稀释液（1:9）混合液的塑料切片盒中，在避光条件下固定 30 分钟。
   6. 用去离子水洗涤切片两次，每次 2 分钟，然后进行抗原修复。
2. 表位修复
   1. 将切片架放入耐热盒中，并加入柠檬酸缓冲液（pH 6.0），使液体完全覆盖切片。
   2. 将盒子放入微波炉中，先以 100% 功率加热 50 秒，再以 20% 功率加热 20 分钟，以维持相同温度。
   3. 在室温下让切片冷却约 15 分钟。
   4. 用清水冲洗切片 2 分钟，再用含 0.05% Tween 20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）冲洗 2 分钟。
      注意：TBST 由 25 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM NaCl 和 0.05% Tween 20（v/v）组成。
3. 封闭
   1. 将切片浸入装有过氧化物酶阻断液（见材料表）的容器中，室温孵育 10 分钟，以封闭组织中的内源性过氧化物酶活性。
   2. 用 TBST 洗涤切片 5 分钟。
   3. 使用疏水屏障笔在切片上的组织区域周围画出边界。
   4. 在组织切片上覆盖封闭缓冲液（见材料表）或牛血清白蛋白（5%，w/v），并在湿盒中孵育 15 分钟。
4. 抗体与信号应用
   1. 去除封闭试剂。
   2. 在湿盒中，室温下加入目标一抗（例如 CD3，1:100 稀释于抗体稀释液中，参见表 1），孵育 30 分钟。
   3. 去除一抗，用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   4. 在湿盒中，室温下加入聚合物辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗（表 1），孵育 15 分钟，然后用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
   5. 加入 Opal 荧光染料 TSA 工作液（1:100 稀释于扩增稀释液中），室温孵育 10 分钟，使荧光染料在组织样本中与一抗结合位点共价结合。随后用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
5. 基于微波的抗体剥离
   1. 用抗原修复缓冲液（柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0）冲洗切片。
   2. 进行基于微波的剥离处理，以去除一抗-二抗-HRP 复合物，为引入下一个一抗（例如 CD20）做准备。
   3. 将切片置于抗原修复缓冲液中，在微波炉安全容器中以 100% 功率加热 50 秒，再以 20% 功率加热 20 分钟，随后在室温下冷却 15 分钟。
   4. 重复步骤 3.2.4 至 3.5.2，直至所有目标一抗均已用于检测组织样本。
6. 复染与封片
   1. 在基于微波的剥离处理及抗原修复缓冲液冷却后，用蒸馏水和 TBST 冲洗切片。
   2. 在湿盒中，室温下加入 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（1.0 µg/mL），孵育 5 分钟。
   3. 用 TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟；再用清水洗涤 1 次，5 分钟。
   4. 将切片自然晾干，并使用适当的封片介质封片（见材料表）。
      注意：用于光谱库构建的单重染色切片无需进行复染。

4. 图像与分析

1. 光谱库切片的制备
   1. 使用相同的对照组织制备每种荧光染料、DAPI 和自发荧光的文库切片（单染参考图像），用于多光谱图像分析。
   2. 使用反复流产（RM）女性和生育正常女性的子宫内膜活检样本切片，对每张切片执行步骤1.1至3.6.4，进行单抗体检测（无需额外添加其他抗体或荧光染料）。
   3. 每种抗体检测时，将一张载玻片用DAPI染色（同步骤3.6.2），另一张载玻片不染色，用于检测光谱中可能存在的组织自发荧光。
   4. 在工作站中使用适当的滤光片，获取该组切片每种抗体的图像，并将其上传至图像分析库（如步骤4.2所述）。
   5. 图像捕获后，选择 inForm 作为 光谱库来源 并构建谱图库。
   6. 由于使用了荧光染料，应选择 染色剂/荧光染料... 从菜单中。
   7. 在选择染料或荧光染料时，通过选择一个或多个组来缩小选择范围。选择 全部 显示所有与图像兼容的光谱。
2. 光谱成像
   注意：图像使用 Mantra 工作站采集，光谱库通过 inForm 图像分析软件建立。
   1. 使用建议的落射荧光滤光片拍摄单抗体染色切片的图像 表2 （例如 DAPI、异硫氰酸荧光素 [FITC]、CY3、Texas Red 和 CY5）使用工作站进行。
      注意：本实验方案中所用特定荧光染料的推荐滤光片如下所示 表2.
   2. 通过在相应的荧光通道中检测每个标记物，确定获得最佳信号的合适曝光时间。
      注意：最佳信号应根据单抗体染色中获得的阳性结果和定位参考来确定。
   3. 为每种分析物（抗体-荧光染料组合）确定固定的曝光时间，以标准化样本间的比较。
      注意：固定曝光时间的确定取决于所关注样本中的信号强度。
   4. 使用嵌入式自动对焦算法，以适当的扫描模式扫描多重染色切片。
      注意：已建立的光谱库将用于将多光谱图像立方体分解为单独的单个组分（光谱解混）。这将允许基于颜色对所有目标标记物进行识别，并通过以下两个主要步骤完成处理：训练阶段和图像分析阶段。
3. 图像分析
   1. 子宫内膜中特定免疫细胞类型的计数
   2. 在200倍放大下至少采集10个视野用于分析。
      注意：通过扫描整个切片区域而无需选择特定部位，可同时捕获子宫内膜的所有细胞成分，例如腔上皮边界、间质和腺体。
   3. 要计数细胞，请点击 计数对象 步骤栏中的按钮以显示 对象计数设置 面板
   4. 检查 若接触边缘则丢弃对象 用于排除接触图像边缘、处理区域或组织区域的任何对象的选项框。
   5. 如果组织已被分割，请选择 组织类别 其中应包含待检测的对象。请勿计数所选组织类别之外的对象。
   6. 选择所需的 方法 用于识别物体： 基于对象的 或 基于像素的（阈值）.
      注意：该 基于像素的（阈值） 方法 应在染色可靠或稳定的情况下选择，此时应用简单阈值即可获得目标像素。 基于对象的方法 当对象染色缺乏一致性和特异性，需要更高级的基于形态测量学的方法时，建议采用此方法。
   7. 选择所需的 信号缩放: 自动缩放 或 固定比例尺.
      注意：选择 自动缩放 将在执行对象分割之前自动缩放每个分量平面。 固定比例尺 当需要更优的分割性能且染色信号一致可靠时，建议采用此选项。
   8. 选择 初级 从下拉列表中选择用于对象分割的组件。
   9. 调节 最小信号 将主成分的值调整至所需阈值。
   10. 要自动填充对象中的孔洞，请选择 填补孔洞.
   11. 为了将接触其他物体的物体识别为独立个体而非单一整体，请选择 优化分割 选择后勾选复选框 最大尺寸（像素） 复选框
   12. 根据物体的圆形度排除对象，请勾选 圆形度 盒并指定所需参数 最小圆度.
   13. 计数所有基质细胞（CD3⁻/CD20⁻CD68⁻/CD56⁻，以及 DAPI⁺），包括血管周围的细胞。
   14. 分别计数免疫细胞，包括T细胞（CD3⁺ 以及 DAPI⁺），B细胞（CD20⁺ 以及 DAPI⁺），巨噬细胞（CD68⁺ 以及 DAPI⁺）以及 uNK 细胞（CD56⁺ 以及 DAPI⁺).
   15. 将数据表示为每张捕获图像中免疫细胞占间质细胞总数的百分比，并将最终细胞计数报告为所有视野的平均值。
   16. 使用 查看编辑器 以查看处理后的结果数据表。导出 计数数据表.
   17. 子宫内膜免疫细胞空间分布的定量分析
   18. 在200倍放大倍数下，使用R程序估算0-20 µm范围内的L函数，该范围被视为细胞间接触的最大距离¹⁴.
       注意： R 使用语言工具箱“spatstat”测量L函数。
       1. 根据免疫细胞对L函数的曲线下面积（AUC）标示其聚类程度。

结果

进行4色多重检测以识别4种子宫内膜免疫细胞类型的总体示意图见图1。简而言之，该多重免疫荧光染色方案包含8个关键步骤：1. 载玻片准备，2. 抗原修复，3. 封闭，4. 一抗孵育，5. 二抗孵育，6. 信号放大，7. 抗体去除，以及8. 复染与封片。随后使用Mantra工作站进行图像呈现与分析，并利用inForm图像分析软件生成的光谱库对子宫内膜样本中的4种免疫细胞类型进行区分（图2）。

利用这种多重染色技术，可在人子宫内膜样本中鉴定出四种子宫内膜免疫细胞类型：CD3+ T细胞、CD20+ B细胞、CD68+ 巨噬细胞和CD56+ 子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）（图3）。然而，必须仔细考虑荧光团之间的干扰，以获得清晰且可用的图像。尽管使用Mantra工作站的多光谱技术可支持多达8重检测，但本方案中使用的4种荧光团因其发射光谱的差异，表现出最佳性能且无明显荧光团干扰。相比之下，涉及5至8种荧光团的多重染色通常...

讨论

方案中的关键步骤
需要注意的是，多重染色需要仔细优化。使用柠檬酸盐缓冲液和微波技术进行抗原修复时，必须优化条件以确保完全去除抗体的同时维持组织活性。由于TSA试剂会共价结合到抗原周围的位点，可能通过空间位阻（也称为"伞效应"）阻碍后续一抗的结合。当多个免疫标记物位于同一细胞区域时，这种情况更容易发生，并导致荧光染料之间的干扰。为了判断是否存在此类影响，关键是在之前进行单plex IHC/IF实验，以识别免疫细胞定位是否存在重叠。由于生成光谱库需要单样本染色，经过验证的光谱库有助于区分各个信号，进一步防止荧光染料干扰。如有必要，可调整一抗浓度和孵育时间、荧光染料-抗体配对、TSA荧光染料浓度以及染色顺序，以最小化荧光染料干扰。同样，正确平衡HRP浓度以防止TSA二聚体形成也非常重要。这可以通过滴定一抗和二抗来实现。此外，必须牢记用于多重染色的一抗浓度和孵育时间可能与传统显色单染中使用的不同。因此，应在实验前确定用于多重染色的一抗浓度及其染色顺序。

修改与故障排除
在本研究中，我...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
扩增稀释液	Perkin Elmer	FP1498	荧光染料稀释缓冲液
抗体稀释液	Perkin Elmer	ARD1001EA	用于稀释抗体
CD3	Spring Bioscience	M3072	一抗
CD20	Biocare Medical	CM004B	一抗
CD56	Leica	NCL-CD56-504	一抗
CD68	Spring Bioscience	M5510	一抗
柠檬酸盐缓冲液（pH 6.0，10倍浓缩液）	Abcam	AB64214	抗原修复液
EMSURE 二甲苯（异构体混合物）	Merck	108297	脱蜡
无水乙醇	Merck	107017	用于再水化的乙醇
HistoCore BIOCUT 手动旋转式切片机（Leica）	Leica	RM2125RTS	石蜡包埋组织切片
inForm Advanced Image Analysis Software	Perkin Elmer	inForm® Tissue Finder Software 2.2.1（版本 14.0）	数据分析软件
Mantra® 工作站	Akoya Biosciences	CLS140089	光谱成像
微波炉	Panasonic	Inverter	微波脱抗原
Opal 520	Perkin Elmer	FP1487A	合适的基于酪胺的荧光试剂
Opal 620	Perkin Elmer	FP1495A	合适的基于酪胺的荧光试剂
Opal 650	Perkin Elmer	FP1496A	合适的基于酪胺的荧光试剂
Opal 690	Perkin Elmer	FP1497A	合适的基于酪胺的荧光试剂
烘箱	Memmert	U10	脱蜡
过氧化物酶阻断液	DAKO	S2023	去除组织内源性过氧化物酶活性
多聚-L-赖氨酸包被载玻片	FISHER SCIENTIFIC	120-550-15	常规组织学用途载玻片
PolyHRP 广谱试剂	Perkin Elmer	ARH1001EA	二抗
ProLong™ Gold 抗荧光淬灭封片剂	ThemoFisher Scientific	P36930	封片
Spatstat	/	Version 2.1-0	空间点模式分析
光谱 DAPI	Perkin Elmer	FP1490A	核酸染色
组织处理仪	Thermo Fischer	Excelsior ES	组织脱水与石蜡包埋处理
Tris 缓冲盐水（TBS，10倍浓缩液）	Cell Signaling Technology	12498S	洗涤液
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1370-1L	非离子型去垢剂